脂肪酶活检测原理及方法Word格式文档下载.docx
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21742-1G-F¥487对硝基苯辛酸酯
1956-11-2C12
61716-1G¥435对硝基苯月桂酸酯
1492-30-4
C16N2752-1G¥379对硝基苯棕榈酸酯
14617-86-8
C18
N3627-1G
¥2621.97对硝基苯硬酸脂
全部为色谱纯试剂,购于sigma公司
3.标准曲线绘制:
a.标准对硝基苯酚母液(2mM,2mmol/L):
称取0.02789g的对硝基苯酚(p-NP)溶于100ml的溶液B(即不同pH的缓冲液),置于棕色试剂瓶内,4℃冰箱保存。
方法一:
b.标准曲线绘制:
分别取0.02,0.04,0.06,0.08,0.12,0.16ml的对硝基苯酚母液(2mM),用溶液B(即不同pH的缓冲液)稀释至4ml,分别测定在410nm处的吸收值。
以对硝基苯酚浓度x(对应浓度分别是0.01,0.02,0.03,0.04,0.06,0.08,单位:
mM)为横坐标,吸光值y为纵坐标,绘制标准曲线。
方法二:
全部对硝基苯酚经过与测酶活相同的处理,获得吸光度。
b.标准曲线的绘制:
分别取0、1.875、3.75、7.5、15、22.5、30、45μL的对硝基苯酚分别加入62.5、60.625、58.75、55、47.5、40、32.5、17.5μL的异丙醇和(全部都是)562.5的溶液B,40℃15min,95%乙醇,10000r/min,3min,测出标准曲线。
↗
体系液180(μL)+酶液(40μL)
↘
B液(pH缓冲液):
162μL
此步骤中,底物再次被稀释,浓度为0.889mM。
(吸光度法,精准,速度慢)
a.溶液的配制
溶液A:
30.0mg对硝基苯棕桐酸脂(p-NPP,Sigma,或者其他底物)溶于10.00ml异丙醇,4℃棕色瓶(可以使用包锡箔纸的15ml离心管)保存,每10ml可用于单个酶8-10次测定,或用于8-10个酶一次测定,或用于一个酶4次密精测定;
溶液B:
缓冲液(pH缓冲液,可更改)100.0ml加入1滴TritonX-100,混匀,4℃保存。
b.脂肪酶的活力测定(以单个酶液做一个/两个对照为例)
①准备试管30个,10个15ml离心管;
②取1ml/1.2ml溶液A加入到9ml/10.8ml溶液B于离心管中,充分混匀,37℃水浴保温5min,分装至3/4个试管中,每个2.7ml,即体系液;
③向每个试管中加入适量酶液(粗酶液加300μL),对照组中加入灭活酶液(沸水煮沸5min),加入酶液后即为反应液;
④37℃反应10-15min,加入95%乙醇终止反应,在410nm下测定吸光值,每个样品重复2/3次,取平均值。
三、96孔板装样方式:
步骤一:
温度不变,定为40℃,以pH和底物为变量,先在EP管内反应,后加入至96孔板中。
其中每个孔是220μL体系。
pH缓冲液分别采取PBS缓冲液(7、8)、Tris-HCl缓冲液(8、9)。
a.该方法需要的总酶液量(每个酶的单次实验):
40*80=3.2ml,其中需要灭活的是800μL。
以方便计算以及加样,取4ml酶液,1ml用来灭活。
b.该方法需要的单个底物的总量是(每个酶的单次试验):
18*16=288μL,以方便计算和加样,取300μL。
c.以三个酶为例仅做pH和底物交叉实验为例,需要每个酶液4ml,每个底物900μL。
表为96孔加样模式:
C2等代表底物,后面的数字代表pH,红色字体表示一个空白对照和三个平行。
蓝色字体中,pH8分别用了PBS缓冲液和Tris-HCl缓冲液,以便比较不同缓冲液对酶活的影响。
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
A
C27空白
C27
平行
C47空白
C47
C87空白
C87
C127空
C127
C167空
C167
B
C
C28空白
C28
C4空白
C48
C8空白
C88
C12空白
C128
C16空白
C168
D
C168
E
C28Tri空白
C28Tri
C48Tri空白
C48Tri
C88Tri空白
C88Tri
C128Tri空白
C128Tri
C168Tri空白
C168Tri
F
G
C29Tri空白
C29Tri
C49Tri空白
C49Tri
C89Tri空白
C89Tri
C129Tri空白
C129Tri
C169Tri空白
C169Tri
H
步骤二:
pH不变,以温度和底物为变量,先在EP管内反应,后加至96孔板中。
40*60=2.4ml,其中需要灭活的是600μL。
以方便计算以及加样,取3ml酶液,750ml用来灭活。
18*12=216μL,以方便计算和加样,取250μL。
c.以三个酶为例仅做pH和底物交叉实验为例,需要每个酶液3ml,每个底物750μL。
表为96孔加样模式其中C2等代表底物,后面的数字代表温度,红色字体表示一个空白对照和三个平行。
40℃因已经在上个步骤中做过,不再重复。
C230空白
C230平行
C430空白
C430
C830空白
C830
C1230空白
C1230
C1630空白
C1630
C250空白
C250
C450空白
C450
C850空白
C850
C1250空白
C1250
C1650空白
C1650
C1650
C260空白
C260
C460空白
C460
C860空白
C860
C1260空白
C1260
C1660空白
C1660
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