生物酶法.docx
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生物酶法.docx
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生物酶法
一.1实验材料
一.1.1生化试剂
生化试剂(均为分析纯)
产地
橄榄油
北京芳草医药化工研制公司
聚乙烯醇(PVA)
北京旭东化工厂
罗丹明B
HZH生物公司
葡萄糖
天津市化学试剂三厂
酵母浸粉
北京奥博星生物技术有限责任公司
磷酸氢二钾
天津市福晨化学试剂厂
七水硫酸酶
天津市化学试剂一厂
磷酸氢二钠
天津市化学试剂三厂
硫酸氨
天津市瑞金特化学品有限公司
氯化钙
天津市瑞金特化学品有限公司
明胶
天津市化学试剂三厂
琼脂粉
北京奥博星生物技术有限责任公司
酚酞
中国医药公司北京采购供应站
甘氨酸
Biosharp公司
甲基红
公私合营新中化学厂
30%过氧化氢
天津市东方化工厂
硫酸氨
天津市瑞金特化学品有限公司
α—萘胺
北京化学试剂公司
对氨基苯磺酸
北京化工厂
碳酸钠
沈阳试剂一厂
肌酸
比利时进口北京化学试剂公司分装
生化试剂(均为分析纯)
产地
NaOH
天津市化学试剂三厂
KOH
天津市化学试剂三厂
可溶性淀粉
天津市化学试剂一厂
甲醇钠
天津市化学试剂三厂
甲醇
天津市化学试剂三厂
甘油
天津市化学试剂三厂
冰醋酸
天津市化学试剂三厂
乙醇
天津市北方天医化学试剂厂
凡士林
包头黄河石化有限公司
牛肉膏
天津市珠江卫生试剂厂
硅藻土
天津市化学试剂三厂
正己烷
天津市华东试剂厂
金龙鱼食用油
天津市嘉里粮油工业公司
Tris
Roche分装
革兰氏染液(套装)
广东环凯微生物科技有限公司
溴百里酚蓝
天津市光复精细化工研究所
溴酚蓝
南京博尔迪生物科技有限公司
一.1.2仪器设备
设备名称
产地
手提式蒸汽灭菌锅(YX280A)
上海三申
水平单向流无菌工作台
天津市中环实验电炉有限公司
电热恒温鼓风干燥箱(101-3-5)
上海跃进医疗器械厂
水域恒温震荡器
哈尔滨市东联电子器械开发有限公司
精密电子天平
北京赛多利斯天平有限公司
台式离心机
上海安亭科学仪器厂
恒温磁力搅拌器
上海和欣科教设备厂
电热恒温培养箱
上海跃进医疗器械厂
设备名称
产地
721分光光度计
上海精密科学仪器有限公司
紫外灯
天津市紫晶特种光源公司
微量移液器
北京青云卓立精密设备有限公司
精密定时电动搅拌器
江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司
不锈钢蒸馏水器
上海科析仪器厂
净化工作台
天津市中环实验电炉有限公司
显微镜
奥林巴斯光学工业株式会社
真空干燥箱
上海一恒科技有限公司
空气恒温震荡器
哈尔滨市东联电子器械开发有限公司
冰箱
海尔集团
便携式pH计
上海精密科学仪器有限公司
一.2菌种筛选
一.2.1样品的采集及其环境
本实验所用的四个样品分别来自
[1]内蒙古科技大学餐厅外长期集油的土壤命名为:
W
[2]内蒙古包头市友谊市场油品商店长期集油土壤命名为:
Y
[3]内蒙古巴彦淖尔市某一葵花地的土壤命名为:
K
[4]内蒙古巴彦淖尔市炼油厂长期集油土壤命名为:
L
取样地点环境:
寡营养、常压、温差较大。
本实验所选采样地点的考虑:
希望得到能以植物油或煎炸油等废油为碳源的微生物,并且该菌能产生脂肪酶使油类物质发生转酯反应。
该菌种能适应较大的温差,最好是在40℃时其脂肪酶活性最高,这样在发酵生产产品时可节省大量的冷却水而节省成本。
1.2菌种筛选的方法及培养基组成
1.2.1菌种富集
将培养基放在高压蒸汽灭菌锅中,灭菌20min。
同时打开无菌操作台的紫外灯杀菌。
待培养基冷却后,将采集来的土样倒入烧杯中,加少量水搅匀用吸量枪吸取1ml的菌液加入到配制好的富集培养基中。
于40℃,220r/min培养2―3天。
1.2.2菌种初筛和选择
将培养基放在高压蒸汽灭菌锅中,灭菌20min.同时打开无菌操作台的紫外灯杀菌。
灭菌完成后在无菌操作台中加入20ml的罗丹明(由于脂肪酶可降解平板中的油脂产生脂肪酸与罗丹明B的阳离子发生作用,在350nm紫外光照射下出现橙黄色的荧光物质,故产生脂肪酶的菌株周围会出现荧光。
且荧光圈越大,脂肪酶活力越高)。
倒平板分别稀释10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7进行涂布最后在40℃的恒温培养厢中培养3—4天。
待培养结束后,将培养皿在紫外灯照射下进行观察,若菌种周围有黄色的荧光圈说明该菌可以产生脂肪酶。
挑取单菌落进行复筛。
经过筛选,可以从80个培养皿中得到生长较为理想的四种菌株,图片如下(图4.1命名为W、图4.2命名为Y、图4.3命名为K、图4.4命名为L)等从图片上看,在波长为350nm的紫外灯下菌落表面或周围有黄色的荧光物质,证明这些菌可以分解植物油发生酯解反应。
图4.1餐厅外菌落命名为W图4.2友谊市场菌落命名为Y
图4.3葵花地菌落命名为K图4.4炼油厂菌落命名为L
1.2.3菌种摇瓶复筛
将复筛培养基放在高压蒸汽灭菌锅中,灭菌20min.同时打开无菌操作台的紫外灯杀菌。
待培养基冷却后,在无菌条件下用接种环挑取初筛培养皿中的较好的单菌落,接种于复筛培养基中,于40℃,220r/min培养2―3天。
1.3酶活力测定
通过对酶活性的测定,我们可以了解到该菌产生的脂肪酶对油脂的催化能力。
以确定该菌的价值。
脂肪酶在一定条件下将甘油三酯水解,在不同水解阶段可释放出脂肪酸,甘油二酯,甘油单酷及甘油。
水解释放出的脂肪酸可用标准碱液滴定,以此表示酶活力。
选用合适的指示剂(本实验选用酚酞为指示剂),在规定时间内用一定量的脂肪酶催化油脂并用一定浓度的NaOH滴定,可定量测出反应液中的脂肪酸含量,从而确定酶活力。
该方法简便快捷,所需设备简单,但精度不高。
酶活力单位(U)[30]定义为:
在一定条件下,以每分钟分解底物(大豆油)释放出lumol游离脂肪酸所需酶量定义为1个脂肪酶活力单位,国际单位(1U),以1U/ml表示。
配制LB培养基,灭菌后分别接种,40℃,220r/min摇床培养72小时,确定有酶产生。
待用。
用台式离心机5000r/min离心10min,去除菌体去上清夜(须新鲜制备)。
在三角瓶中加入5ml缓冲溶液和4ml乳化液,放入40℃恒温水浴锅中,再加入酶液反应并计时,30min后终止反应,用0.05mo1/L氢氧化钠滴定游离出的脂肪酸,同时做空白样(先加终止剂,后加酶液,其余同样品操作)。
酶活力(U)=(V2-V1)×N/t
其中:
V2:
样品消耗碱的体积(ml)
V1:
空白消耗碱的体积(ml)
t:
反应时间(min)
N:
稀释倍数,这里N=50,50为1ml0.05mo1/L氢氧化钠的微摩尔数。
表4.1酶活力测定结果
菌项种目
滴定前(ml)
滴定后(ml)
NaOH用量(ml)
(V2-V1)值
酶活力(U/ml)
空白
12.1
12.3
0.2
---
---
L
12.3
14.8
2.5
2.3
3.5
Y
14.8
16.3
1.5
1.3
2.17
W
16.3
18.5
2.2
2.0
3.33
K
19.9
20.5
0.6
0.4
0.67
从表4.1可以看出L菌的酶活力最高,而K菌的酶活力最低。
该方法虽简单,快捷但准确率不高。
在酶活力测定过程中,有许多影响因素,因此在比较酶活力时只适用用该方法测得的酶活力。
其主要影响因素有:
菌种的细胞壁对胞外酶的排除有一定阻力,不同的菌株其细胞壁不同,阻力也就不同;脂肪酶催化油脂反应生成的脂肪酸可能与缓冲液中存在的NaOH反应,使测量数据减小;可能有部分菌体没有离心分离等。
总之,这里测量得到的酶活力只是一个相对的参考值。
一.3菌种鉴定
一.3.1菌株形态的显微观察
(1)制片
制片要采用干净的载玻片,用接种环挑菌体涂布到载玻片上。
操作时需注意接种环的无菌操作,注意菌体量适中。
(2)固定
涂片后最好先在室温下自然干燥,然后固定。
固定常用高温。
手执载玻片一侧,标本面朝上,在火焰外层快速来回通过3—4次。
共约3—4s,要求载玻片表面温度不超过60℃,此时以手背皮肤接触,不觉烫为适。
放置待冷后染色。
(3)染色
标本固定以后,滴加结晶紫染色液,使整个标本固定在染色液中。
染色时间为1—3min。
(4)水洗与干燥
染色时间一到,用细小的缓流水将多余染料从标本上洗去,洗净后,将标本置桌上风干,也可用吸水纸轻轻吸去水分。
有时也可微微加热,待干后再镜检。
(5)显微镜观察菌体形态。
在显微镜下可以观测到L、Y菌为链球状,W、K菌为杆状,而且多数菌两个或两个以上连在一起。
(下图分别为L菌、Y菌、W菌、K菌)
图4.5L菌图4.6Y菌
图4.7W菌图4.8K菌
一.3.2菌株生理生化特征测定[31]
(1)革兰氏染色
该染色法根据细胞壁的结构和成分不同将细菌分为G+菌和G—菌。
G—菌的细胞壁中含有较多类脂质,而且肽聚糖层较薄、交联度低,染色处理后为红色。
G+菌的细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高,类脂质含量少,经染色处理后为紫色。
其步骤为:
A制片:
制片要采用干净的载玻片,并注意接种环的无菌操作。
做斜面菌体时,要防止菌体和水混合不均匀有结团现象,注意菌体量适中。
B固定:
涂片后最好先在室温下自然干燥,然后固定。
固定常用高温。
手执载玻片一侧,标本面朝上,在火焰外层快速来回通过3—4次。
共约3—4s,要求载玻片表面温度不超过60℃,此时以手背皮肤接触,不觉烫为度。
放置待冷后染色。
C媒染与染色:
标本固定以后,滴加结晶紫染色液,使整个标本固定在染色液中。
染色时间视标本与染料的性质而定,一般染色时间为1—3min,用水洗。
碘液作用lmin,水洗,吸干。
D脱色与复染:
a用95%乙醇或丙酮乙醇溶液脱色,流滴到脱色液为无色,约30秒。
b脱色后需再用蕃红液染色2—3min。
E水洗与干燥:
染色时间一到,用细小的水缓缓流滴将多余染料从标本上洗去。
洗净后,将标本置桌上风干,也可用吸水纸轻轻吸去水分。
有时也可微微加热,待干后再镜检。
(2)乙酰甲基甲醇(V.P)试验
实验原理:
某些细菌在糖代谢过程中,分解葡萄糖产生丙酮酸,丙酮酸通过缩合和脱羧转变成乙酰甲基甲醇,乙酰甲基甲醇在碱性条件下,被空气中的氧氧化成二乙酰,二乙酰在与蛋白胨中的精氨酸的胍基起作用生成红色化合物,此为V—P阳性,若无红色则为阴性。
高压蒸汽灭菌,等培养基冷却后将待测定菌接种于该培养基,40℃、210r/min摇床分别培养2,4,9天。
取培养液和40%氢氧化钠等体积混合,加入少许肌酸,10min后如培养液显红色,则V.P为阳性,有时需放置更长时间才出现红色反应。
若仍为阴性,可适当延长培养时间。
(3)硝酸盐还原试验
高压蒸汽灭菌,等培养基冷却后将待测定菌接种于硝酸盐还原液体培养基中,置室温培养1,3,5天,另两管不接种作对照。
倒出少许1,3,5天液体培养基,再各加一滴硝酸盐显色液A液和B液。
如溶液变为红色、橙色、棕色等表示亚硝酸盐存在,为硝酸盐还原阳性;否则按硝酸盐还原阴性处理。
(4)明胶液化试验
试验原理:
某些细菌分泌蛋白酶分解明胶,产生小分子物质,如果细菌具有分解明胶的能力,则培养基可由原来的固体状态变为液体状态。
高压蒸汽灭菌,在培养基未凝固前倒入透明试管中,培养基高度为4—5cm。
培养基置于4℃冰箱中冷藏18—24小时。
穿刺后置于20℃以下培养2,7,10,14,30天另有两只试管不接种作为空白对照。
观察菌的生长情况和明胶是否融化。
若菌生长;明胶表面无凹陷,且为稳定的凝块,则为明胶水解阴性。
若明胶凝块部分或全部在20℃以下变为可流动的液体,则表明该菌为明胶水解阳性。
若细胞未生长,可能是不能在明胶培养基上生长,或是基础培养基不适合。
(5)甲基红试验(M.R)
试验原理:
某些细菌在糖代谢过程中,将培养基中的糖先分解为丙酮酸,丙酮酸再分解为甲酸、乙酸、乳酸等,有机酸的产生可由加入甲基红指示剂的变色来检测。
高压蒸汽灭菌,等培养基冷却后将待测定菌接种于甲基红试验培养基,30℃下培养2,4,9天。
在培养基中加入一滴甲基红试剂,如果显红色,则为M-R阳性,如黄色则为阴性。
若仍为阴性,可适当延长培养时间。
(6)菌体运动性试验
试验原理:
对细菌进行穿刺培养,如果细菌只沿着穿刺线生长,则没有运动性,若有细菌存在穿刺线周围,说明细菌有运动性。
高压蒸汽灭菌,在培养基未凝固前倒入透明试管中,培养基高度为4—5cm。
待培养基冷却凝固后接种针穿刺接种于半固体培养基内,30℃下培养。
培养1,2,3天后观察,细菌的运动性可用透射光目测。
如果细菌只沿着穿刺线生长,则没有运动性。
若有细菌(非气泡)存在穿刺线周围,说明细菌有运动性。
(7)好氧性测试
高压蒸汽灭菌,在培养基未凝固前倒入透明试管中,培养基高度为4—5cm。
待培养基冷却凝固后接种针穿刺接种于半固体培养基内,一支用高温灭菌的液体凡士林液封,另一支不液封。
30℃下培养。
3天后观察,细菌的好氧性可以用透射光目测。
若菌体既能在液封的培养基穿刺线上生长,同时也在不液封的培养基穿刺线上生长则属于兼性厌氧菌。
若菌体只能在不液封的培养基穿刺线上生长则该菌属于好氧菌。
若菌体只能生长在液封了的培养基穿刺线中,则该菌是厌氧菌。
(8)淀粉水解酶的检验
试验原理:
某些细菌分泌淀粉酶能分解培养基中的淀粉,在培养一段时间后,在培养基上滴加碘液,如果出现蓝色说明培养基中的淀粉未被分解,未出现蓝色则说明淀粉被分解。
高压蒸汽灭菌,等培养基冷却后将待测定菌接种于淀粉水解酶试验培养基上,40℃恒温48小时后用卢哥氏碘液检查透明圈的产生情况,若菌落周围不变色说明该菌能产生淀粉酶,则为阳性。
若菌落周围或菌落上变为蓝色说明该菌不产生淀粉酶,为阴性。
(9)过氧化氢酶(接触酶)试验
高压蒸汽灭菌,等培养基冷却后将待测定菌接种于过氧化氢酶试验培养基上,40℃培养48小时。
在菌落上或菌落周围滴加3%双氧水于培养基上,观察是否有气泡产生,若有气泡为阳性,无气泡为阴性。
(10)葡萄糖发酵实验
高压蒸汽灭菌,在培养基未凝固前倒入透明试管中,培养基高度为4—5cm。
每株鉴定菌种分别接种4支试管,其中两支试管用经过高温灭菌的凡士林液封,以隔绝空气。
另外两支试管不液封,同时需准备两支未接种的试管,一支用凡士林液封,另外一支不液封,以做空白对照。
室温培养1,2,3,7,14天观察结果。
若只有开管产酸变黄的为氧化型。
若开管、闭管均产酸变黄的为发酵型。
菌种
鉴别种类
L
K
W
Y
V.P实验
—
+
—
—
M.R实验
+
—
+
+
菌种
鉴别种类
L
K
W
Y
葡萄糖氧化发酵实验
发酵型
发酵型
氧化型
氧化型
过氧化氢酶实验
+
+
+
+
明胶实验
—
+
+
—
硝酸盐还原实验
+
—
—
+
淀粉水解实验
+
+
+
+
菌体好氧性实验
好氧
好氧
好氧
好氧
革兰氏染色
—
—
—
—
菌体运动性实验
—
—
—
—
注:
“+”为阳性,“—”为阴性。
通过以上一系列的生理生化实验的结果,根据《伯杰氏手册》我们可以初步鉴定出这四种菌分别为:
W:
假单胞菌属;L:
耶尔森氏菌属;K:
不动杆菌;Y:
接近耶尔森氏菌属(可能是耶尔森氏菌属的变种)。
一.4生长曲线测定
一.4.1测定生长曲线的意义
生长曲线是某菌在培养期间不同时期的宏观表现,测定出菌种的生长曲线,对了解该菌的生长、产酶及衰亡有重要意义。
一.4.2测定生长曲线的方法
配制LB培养基200ml培养基灭菌前用离心机离心过滤,去除不溶杂质,得清澈液体,然后高温蒸汽灭菌等培养基冷却后将待测菌种接种到该液体培养基中。
于40℃,220r/min的摇床培养,每2h取样一次,共测60小时。
每次3m1,取好的样品立刻用721分光光度计在560nm波长下测出各自的光密度,以灭完菌但未接种的培养基为空白对照。
绘制时间—OD560曲线。
菌种生长曲线结果如图:
菌种生长曲线图4.9
通过以上生长曲线图我们可以看出L菌的迟滞期最短,只有4小时左右,较短的迟滞期在发酵时可以大大提高生产速率,但该菌在LB培养基中生长率最差;Y、W菌的迟滞期要比L菌的迟滞期稍长,在9—12小时之间,在LB培养基中Y的生长能力要比W菌强;K菌的迟滞期最长,有20小时左右。
造成这些结果的原因可能是不同细菌其最适培养基不同,另外经过大量实验发现,Na+浓度对不同细菌的生长抑制也不同。
通过较四种菌的生长能力,再结合产酶能力及酶活力和转酯能力,可以从四种菌中筛选出最好的一种应用。
一.5菌生长的影响因素及其生长条件优化
一.5.1温度的影响
经培养测量发现,两种菌在35℃时生长的最快且最多,当温度高于45℃后,菌生长速度十分缓慢,菌B的温度—OD曲线见下图:
图4.6温度对菌生长的影响
由图知,可取35℃为其生长温度。
讨论:
一般脂肪酶产生菌的最适生长温度为30℃—45℃,我们所筛选的菌种最适生长温度均为35℃,但在测量过程中,由于摇床数量不够,我们进行了分批地培养测量,这样做,培养条件不是完全相同,可能使结果产生一定的误差。
一.5.2pH对菌生长的影响
pH在一定范围内对菌的生长影响不大,但低于5.0或高于9.0后会对菌的生长产生明显的抑制作用,测定菌B的pH—OD曲线,见下图。
图4.7pH对菌生长的影响
通过上图,将该菌生长的pH值设定为自然。
一.5.3无机离子的影响及优化
(1)Na+的影响
结果表明,Na+浓度低于7%时,两种菌均可生长,但由一定的适应期,当其浓度再大时,两种菌生长受到抑制。
(2)Ca2+的影响
结果表明,Ca2+对菌的生长无明显影响,但加入Ca2+的发酵液中油量明显少于未加入的另一只锥形瓶中的油量,说明Ca2+可能有利于脂肪酶的产生。
讨论:
少量的Na+在菌生长过程中可提供细胞膜中必要的Na+,以维持细胞膜内外一定的压力差,使细胞的物质交换得以顺利进行,但当其浓度过高时,就会使胞外离子浓度过高,从而影响细胞膜内外的物质交换,影响菌的生长。
在菌的培养过程中,主要的无机离子为上述两种,另外还有Mg2+,它主要是影响脂肪酶的活力。
不同装液量对发酵的影响
在250mL三角瓶中分别加入30mL,50mL,70Ml,90mL在基础培养基(蛋白胨2.5,橄榄油1.0,(NH4)2S040.l,MgS04·7H200.05,K2HP040.1,pH7.5),400C,200rpm摇床培养2天,取发酵上清液测定酶活力。
不同装液量对发酵的影响
结果如表3-11所示,250mL摇瓶中装50mL培养基时,发酵效果最佳。
不同装液量对发酵的影响
紫外诱变流程
单细胞或孢子悬浮液→诱变处理→后培养→平板分离→斜面→初筛→复筛→分离,筛选→保藏及扩大实验
3.5.1菌悬液的制备[28]
配置LB培养基600ml,35-40℃发酵培养72h,将发酵液冷冻离心30min,离心转速为4000r/min。
弃去上清液,用0.05mol/LpH7.2的Tris-Hcl缓冲液清洗两次,离心后,收集细胞,加入少量Tris-Hcl缓冲液,混合均匀,得到菌悬液。
3.5.2紫外诱变
采用功率为30W紫外灯,照射距离为30cm,对菌悬液进行不同时间的诱变处理。
诱变处理时先打开紫外灯,预热20min,以稳定波长。
取制好的菌悬液5ml于直径为7cm的无菌培养皿中,内加磁力转子(无菌),在磁力搅拌下,开盖用紫外光照射不同时间,每隔2min定时取出菌液,于冰浴中保存1h,同未经紫外照射的菌液用无菌水进行梯度稀释,每个稀释度做3个平行,涂布于普通固体平板,用黑色胶袋包好于30℃恒温培养2d,观察不同处理时间的平板菌落数,计算致死率。
3.5.3致死率的计算
3.5.3.1计数原理
本实验采用平板菌落计数法来计算致死率[28]。
平板菌落计数法是根据微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的现象进行的,也就是说一个菌落即代表一个单细胞。
计数时,先将待测样品作一系列稀释,再取一定量的稀释菌液接种到培养皿中,使其均匀分布于平皿中的培养基内,经培养后,由单个细胞生长繁殖形成菌落,统计菌落数目,即可换算出样品中的含菌数。
此法的有点是能检测出样品中的活菌数,常用于某些成品检定,生物制品检定以及食品,水源的污染程度的检定等。
但平板菌落计数法的手续较繁,而且测定值常受到各种因素的影响。
3.5.3.2计算步骤
1.编号取无菌平皿9套,分别用记号笔标明10-4,10-5,10-6各3套。
另取6支盛有4.5mL无菌水的试管,排列与试管架上,依次标明10-1,10-2,10-3,10-4,10-5,10-6
2.稀释用1mL无菌吸管精确地吸取0.5mL菌悬液放入10-1的试管中,注意吸管尖端不要碰到液面,以免吹出时,管内液体外溢。
然后仍用此吸管将管内悬液来回吸吹3次,吸时深入管底,吹时离开水面,使其混合均匀。
另取1支吸管自10-1试管吸0.5mL放入10-2试管中,吸吹3次......其余依次类推。
3.取样用3支1mL无菌吸管分别精确地吸取10-4,10-5,10-6的稀释菌液各0.2mL,对号放入便好号的无菌培养皿中。
4.倒平板于上述盛有不同稀释度的培养皿中,倒入溶化后冷却至45℃左右的麦芽汁培养基约10-15mL,置水平放置,迅速旋动混匀,待凝固后,倒置与37℃温室中培养。
5.计数培养24h后,取出培养皿,算出同一稀释度3个平皿上的菌落平均数,并按下列公式进行计算:
每毫升中总活菌数=同一稀释度3次重复的菌落平均数×稀释倍数×5
注意:
一般选择每个平板上长有30-300个菌落的稀释度计算每毫升的菌数最为合适。
同一稀释度的3个重复的菌数不能相差很悬殊。
由10-4,10-5,10-63个稀释度计算出的每毫升菌液中总活菌数也不能相差悬殊。
3.5.4筛选
(1)初筛:
把诱变后的菌液进行梯度稀释,取0.1ml适宜梯度的菌液涂布于罗丹明显色平板[28],用黑色胶袋包好于30℃恒温培养5~6d后观察水解透明圈的大小,把透明圈较大的菌落接入普通平板培养后备用。
(2)复筛:
选取初筛中透明圈较大的菌株斜面保存,活化一次后以1%接种量接入发酵摇瓶中培养48h,测定发酵液中的酶活。
3.6传代培养
对诱变后酶活提高的菌株进行传代培养,2到3天接一次菌,培养5代。
诱变结果
4.3.1诱变后菌的生长状况
各个诱变时间均有大小不一,数量差距不大的水解圈,其中没有诱变菌的水解圈最多。
诱变120秒稀释至10-3在显色培养基上的水解圈
4.3.2关于致死率
把诱变后的L1菌悬液稀释至10-5,每个不同诱变时间做三个平行板,于麦芽汁培养基上培养两天,可得到下列数据:
秒数(s)
稀释度10-5
平均
1
2
3
0
125
140
106
123
20
86
102
生长过密
94
40
68
70
80
72
60
74
80
74
76
80
78
66
59
67
100
56
55
64
58
致死率计算公式:
诱变后菌落数
致死率=1-————
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