基因工程II-外源基因的表达(ppt62)(1).pptx
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基因工程II-外源基因的表达(ppt62)(1).pptx
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生物技术概论生物技术概论基因工程II外源基因的表达外源基因的表达生物技术学院生物技术学院王王萍萍概念概念基因表达:
生物在代谢活动和生长发育基因表达:
生物在代谢活动和生长发育过程中将蕴藏在过程中将蕴藏在DNA的遗传信息传递到的遗传信息传递到RNA分分子,然后再转移到蛋白质分子的过程,即基因表子,然后再转移到蛋白质分子的过程,即基因表达。
达。
基因表达系统基因表达系统原核表达系统真核表达系统大肠杆菌表达系统大肠杆菌表达系统酵母表达系统酵母表达系统芽孢杆菌表达系统芽孢杆菌表达系统链霉菌表达系统链霉菌表达系统蓝藻表达系统蓝藻表达系统昆虫细胞表达系统昆虫细胞表达系统植物细胞表达系统植物细胞表达系统哺乳动物细胞表达系统哺乳动物细胞表达系统
(一)外源基因在大肠杆菌中的表达
(一)外源基因在大肠杆菌中的表达授课内容
(二)外源基因在酵母菌中的表达
(二)外源基因在酵母菌中的表达(三)外源基因在哺乳动物细胞中的表达三)外源基因在哺乳动物细胞中的表达参考书11、分子克隆实验指南、分子克隆实验指南JJ萨姆布鲁克,主编金冬雁,萨姆布鲁克,主编金冬雁,黎黎孟枫,译科学出版社孟枫,译科学出版社.22、基因工程楼士林,杨盛昌,龙敏南,等,主编、基因工程楼士林,杨盛昌,龙敏南,等,主编.科学科学出出版社版社.33、基因工程原理吴耐虎,主编、基因工程原理吴耐虎,主编.科学出版社科学出版社.
(一)外源基因在大肠杆菌中的表达
(一)外源基因在大肠杆菌中的表达1大肠杆菌受体细胞的特征大肠杆菌受体细胞的特征2外源基因高效表达的原理外源基因高效表达的原理3工程菌的构建策略工程菌的构建策略4遗传不稳定性及其对策遗传不稳定性及其对策
(一)外源基因在大肠杆菌中的表达
(一)外源基因在大肠杆菌中的表达
(一)外源基因在大肠杆菌中的表达
(一)外源基因在大肠杆菌中的表达
(一)外源基因在大肠杆菌中的表达
(一)外源基因在大肠杆菌中的表达表达外源基因的优势表达外源基因的优势繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定全基因组测序全基因组测序基因克隆表达系统成熟完善基因克隆表达系统成熟完善被美国被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物批准为安全的基因工程受体生物
(一)外源基因在大肠杆菌中的表达
(一)外源基因在大肠杆菌中的表达劣势劣势缺乏蛋白质的复性功能缺乏蛋白质的复性功能缺乏蛋白质的修饰加工系统缺乏蛋白质的修饰加工系统内源性蛋白酶降解异源蛋白内源性蛋白酶降解异源蛋白胞内含多种内毒素胞内含多种内毒素
(一)外源基因在大肠杆菌中的表达
(一)外源基因在大肠杆菌中的表达外源基因高效表达的原理外源基因高效表达的原理启动子启动子终止子终止子核糖体结合位点核糖体结合位点密码子密码子质粒拷贝数质粒拷贝数
(一)外源基因在大肠杆菌中的表达
(一)外源基因在大肠杆菌中的表达外源基因高效表达的原理外源基因高效表达的原理启动子启动子定义:
位于结构基因上游的一段与定义:
位于结构基因上游的一段与DNA依赖的依赖的RNA聚合酶相结合的聚合酶相结合的DNA序列,用序列,用P代表。
代表。
大小:
为大小:
为20300bp。
功能:
转录目标基因的功能:
转录目标基因的mRNAmRNA分类:
组成型、调控型分类:
组成型、调控型意义:
在转录水平控制基因表达意义:
在转录水平控制基因表达。
启动子启动子启动子启动子-35-35区序列区序列-10-10区序列区序列PLTTGACAGATACTPrecATTGATATATAATPtraATAGACATAATGTPtrpTTGACATTAACTPlacTTTACATATAATPtacTTGACATATAAT乳糖启动子乳糖启动子Plac的可控性的可控性:
(一)外源基因在大肠杆菌中的表达
(一)外源基因在大肠杆菌中的表达终止子终止子转录过头对外源基因表达的影响转录过头对外源基因表达的影响耗时耗时耗能耗能干扰复制,导致质粒的不稳定性干扰复制,导致质粒的不稳定性不能形成理想的二级结构不能形成理想的二级结构
(一)外源基因在大肠杆菌中的表达
(一)外源基因在大肠杆菌中的表达核糖体结合位点核糖体结合位点定义:
位于启动子下游,从转录起始点开始定义:
位于启动子下游,从转录起始点开始延伸几十个碱基长度的一段序延伸几十个碱基长度的一段序列。
列。
(一)外源基因在大肠杆菌中的表达
(一)外源基因在大肠杆菌中的表达核糖体结合位点核糖体结合位点结构:
结构:
SD序列(序列(Shine-Dalgarno序列)序列)翻译起始密码子翻译起始密码子SDSD序列与翻译起始密码子之间的距离及碱基组成序列与翻译起始密码子之间的距离及碱基组成基因编码区基因编码区5端若干密码子的碱基序列端若干密码子的碱基序列
(一)外源基因在大肠杆菌中的表达
(一)外源基因在大肠杆菌中的表达核糖体结合位点核糖体结合位点SD序列(序列(Shine-Dalgarno序列):
指序列):
指位于翻译起始密码子上游的位于翻译起始密码子上游的6-8个核苷酸序列个核苷酸序列5UAAGGAGG3。
它通过与它通过与rRNA16S亚基亚基3AUUCCUCC5端互补,并专一性结将端互补,并专一性结将mRNA定位于核糖体上,从而启动翻译。
定位于核糖体上,从而启动翻译。
对外源基因表达的影响:
对外源基因表达的影响:
(一)外源基因在大肠杆菌中的表达
(一)外源基因在大肠杆菌中的表达SD序列与起始密码子之间的序列:
序列与起始密码子之间的序列:
核糖体结合位点核糖体结合位点对外源基因表达的影响:
对外源基因表达的影响:
SD序列与起始密码子之间的距离:
序列与起始密码子之间的距离:
(一)外源基因在大肠杆菌中的表达
(一)外源基因在大肠杆菌中的表达翻译起始密码子:
位于核糖体翻译起始密码子:
位于核糖体结合位点的中心位置。
结合位点的中心位置。
大肠杆菌翻译起始密码子:
大肠杆菌翻译起始密码子:
AUG、GUG或或UUG。
核糖体结合位点核糖体结合位点对外源基因表达的影响:
对外源基因表达的影响:
(一)外源基因在大肠杆菌中的表达
(一)外源基因在大肠杆菌中的表达密码子偏爱性对外源基因表达的影响密码子偏爱性对外源基因表达的影响:
密码子密码子密码子偏爱性:
密码子偏爱性:
外源基因全合成外源基因全合成同步表达相关同步表达相关tRNA编码基因编码基因策略策略
(一)外源基因在大肠杆菌中的表达
(一)外源基因在大肠杆菌中的表达包涵体型异源蛋白的表达包涵体型异源蛋白的表达分泌型异源蛋白的表达分泌型异源蛋白的表达融合型异源蛋白的表达融合型异源蛋白的表达寡聚型异源蛋白的表达寡聚型异源蛋白的表达整合型异源蛋白的表达整合型异源蛋白的表达外源基因在大肠杆菌中的表达形式外源基因在大肠杆菌中的表达形式
(一)外源基因在大肠杆菌中的表达
(一)外源基因在大肠杆菌中的表达包涵体型表达包涵体型表达外源基因在大肠杆菌中的表达形式外源基因在大肠杆菌中的表达形式定义:
大肠杆菌在表达一些异源基因时定义:
大肠杆菌在表达一些异源基因时,在某些生长条件下,能将这些生物大分子致密,在某些生长条件下,能将这些生物大分子致密地集聚在细胞内,形成被膜包裹或无膜裸露结构地集聚在细胞内,形成被膜包裹或无膜裸露结构,而不溶于水,这种结构称为包涵体(,而不溶于水,这种结构称为包涵体(InclusionBodies,IB)。
)。
(一)外源基因在大肠杆菌中的表达
(一)外源基因在大肠杆菌中的表达包涵体型表达包涵体型表达组成:
外源基因表达产物、外膜蛋白组成:
外源基因表达产物、外膜蛋白、载体蛋白及少量的、载体蛋白及少量的DNA、RNA和脂多糖和脂多糖等非蛋白分子。
等非蛋白分子。
重组蛋白的性质:
具有正确的氨基酸重组蛋白的性质:
具有正确的氨基酸序列,但构象错误。
序列,但构象错误。
(一)外源基因在大肠杆菌中的表达
(一)外源基因在大肠杆菌中的表达包涵体型表达包涵体型表达优点:
优点:
简化表达产物的分离操作简化表达产物的分离操作保持表达产物的结构稳定保持表达产物的结构稳定缺点:
缺点:
重组蛋白丧失了原有的生物活性重组蛋白丧失了原有的生物活性
(一)外源基因在大肠杆菌中的表达
(一)外源基因在大肠杆菌中的表达包涵体型表达包涵体型表达主要任务:
拆开错配的二硫键和次级键主要任务:
拆开错配的二硫键和次级键包涵体的溶解与变性包涵体的溶解与变性:
(一)外源基因在大肠杆菌中的表达
(一)外源基因在大肠杆菌中的表达包涵体型表达包涵体型表达试剂和条件试剂和条件:
溶解与变性溶解与变性:
清洗剂清洗剂SDS、正十二醇肌氨酸、正十二醇肌氨酸促溶剂盐酸胍、尿素促溶剂盐酸胍、尿素混合溶剂混合溶剂极端极端pH
(一)外源基因在大肠杆菌中的表达
(一)外源基因在大肠杆菌中的表达包涵体型表达包涵体型表达主要任务:
主要任务:
通过次级键的形成使蛋白质复性通过次级键的形成使蛋白质复性将多肽链中被拆开的游离巯基重新将多肽链中被拆开的游离巯基重新折叠折叠复性与重折叠复性与重折叠:
(一)外源基因在大肠杆菌中的表达
(一)外源基因在大肠杆菌中的表达包涵体型表达包涵体型表达复性复性:
复性与重折叠复性与重折叠:
分段稀释法分段稀释法一步稀释法一步稀释法试剂添加法试剂添加法蛋白修饰法蛋白修饰法产物隔离法产物隔离法分子伴侣法分子伴侣法
(一)外源基因在大肠杆菌中的表达
(一)外源基因在大肠杆菌中的表达包涵体型表达包涵体型表达二硫键形二硫键形成成复性与重折叠复性与重折叠:
化学氧化法化学氧化法二硫键交换法二硫键交换法
(一)外源基因在大肠杆菌中的表达
(一)外源基因在大肠杆菌中的表达化学氧化法化学氧化法二硫键交换法二硫键交换法
(一)外源基因在大肠杆菌中的表达
(一)外源基因在大肠杆菌中的表达分泌型表达分泌型表达外源基因的表达形式外源基因的表达形式定义:
外源基因的表达产物通过运输或分泌定义:
外源基因的表达产物通过运输或分泌的方式穿过细胞外膜进入培养基中。
的方式穿过细胞外膜进入培养基中。
(一)外源基因在大肠杆菌中的表达
(一)外源基因在大肠杆菌中的表达分泌型表达分泌型表达优点:
优点:
目的蛋白稳定性高目的蛋白稳定性高目的蛋白易于分离目的蛋白易于分离目的蛋白末端完整目的蛋白末端完整有利于目的蛋白形成正确的空间构象有利于目的蛋白形成正确的空间构象缺点:
缺点:
表达量低表达量低
(一)外源基因在大肠杆菌中的表达
(一)外源基因在大肠杆菌中的表达分泌型表达分泌型表达系统的构建系统的构建:
在目的基因在目的基因N端加入大肠杆菌端加入大肠杆菌信信号肽序列号肽序列,转化完全分泌型受体细胞。
,转化完全分泌型受体细胞。
(一)外源基因在大肠杆菌中的表达
(一)外源基因在大肠杆菌中的表达融合型表达融合型表达外源基因的表达形式外源基因的表达形式定义:
将外源蛋白基因与受体菌自身蛋定义:
将外源蛋白基因与受体菌自身蛋白基因重组在一起,但不改变两个基因阅读框白基因重组在一起,但不改变两个基因阅读框,以目的蛋白和受体菌蛋白融合形式表达目的,以目的蛋白和受体菌蛋白融合形式表达目的蛋白。
蛋白。
(一)外源基因在大肠杆菌中的表达
(一)外源基因在大肠杆菌中的表达融合型表达融合型表达优点:
优点:
目的蛋白稳定性高目的蛋白稳定性高目的蛋白易于分离目的蛋白易于分离目的蛋白表达率高目的蛋白表达率高目的蛋白溶解性好目的蛋白溶解性好缺点:
缺点:
裂解和进一步分离裂解和进一步分离
(一)外源基因在大肠杆菌中的表达
(一)外源基因在大肠杆菌中的表达融合型表达融合型表达构建原则:
构建原则:
高效表达高效表达外源基因的位置外源基因的位置两个结构基因拼接位点处序列的设计两个结构基因拼接位点处序列的设计保持一致的翻译阅读框架保持一致的翻译阅读框架
(一)外源基因在大肠杆菌中的表达
(一)外源基因在大肠杆菌中的表达融合型表达融合型表达受体蛋白受体蛋白:
谷胱甘肽转移酶(谷胱甘肽转移酶(GST)硫氧化还原蛋白硫氧化还原蛋白(TrxA)麦芽糖结合蛋白(麦芽糖结合蛋白(MBP)金黄色葡萄球菌蛋白金黄色葡萄球菌蛋白A(SAPA)外膜蛋白(外膜蛋白(OmpF)泛素蛋白(泛素蛋白(Ubi)半乳糖苷酶(半乳糖苷酶(LacZ)
(一)外源基因在大肠杆菌中的表达
(一)外源基因在大肠杆菌中的表达融合型表融合型表达达蛋白质回收蛋白质回收:
融合蛋白的位点融合蛋白的位点专一性断裂方法专一性断裂方法化学断裂法化学断裂法单残基位点单残基位点多残基位点多残基位点酶促裂解法酶促裂解法目的目的蛋白蛋白载体载体蛋白蛋白多克多克隆隆酶切位点酶切位点切割切割位点位点
(一)外源基因在大肠杆菌中的表达
(一)外源基因在大肠杆菌中的表达寡聚型表达寡聚型表达外源基因的表达形式外源基因的表达形式定义:
将多拷贝的外源基因克隆在一定义:
将多拷贝的外源基因克隆在一个低拷贝质粒上,以获得目的蛋白的高效表达。
个低拷贝质粒上,以获得目的蛋白的高效表达。
(一)外源基因在大肠杆菌中的表达
(一)外源基因在大肠杆菌中的表达寡聚型表达寡聚型表达优点:
优点:
目的蛋白高效表达目的蛋白高效表达稳定表达小分子短肽稳定表达小分子短肽缺点:
缺点:
目的产物回收困难目的产物回收困难
(一)外源基因在大肠杆菌中的表达
(一)外源基因在大肠杆菌中的表达不稳定性形式不稳定性形式基因工程菌的遗传不稳定性及其对策基因工程菌的遗传不稳定性及其对策结构不稳定性结构不稳定性分配不稳定性分配不稳定性
(一)外源基因在大肠杆菌中的表达
(一)外源基因在大肠杆菌中的表达机机制制基因工程菌的遗传不稳定性及其对策基因工程菌的遗传不稳定性及其对策限制修饰限制修饰应急反应应急反应重组质粒的不均匀分配重组质粒的不均匀分配受体细胞内源性的转座元件的作用受体细胞内源性的转座元件的作用
(一)外源基因在大肠杆菌中的表达
(一)外源基因在大肠杆菌中的表达改进策略改进策略基因工程菌的遗传不稳定性及其对策基因工程菌的遗传不稳定性及其对策改进载体受体系改进载体受体系统统施加选择压力施加选择压力控制目的基因的过量表达控制目的基因的过量表达改进培养工艺改进培养工艺
(二)外源基因在酵母菌中的表达
(二)外源基因在酵母菌中的表达1、受体菌的特征、受体菌的特征2、酵母菌的宿主系统、酵母菌的宿主系统3、酵母菌的转化系统、酵母菌的转化系统4、酵母菌的表达系统、酵母菌的表达系统
(二)外源基因在酵母菌中的表达
(二)外源基因在酵母菌中的表达酵母菌(酵母菌(YeastYeast)是一群以芽殖或)是一群以芽殖或裂殖方式进行无性繁殖的单细胞真核生物,共由裂殖方式进行无性繁殖的单细胞真核生物,共由5656个属和个属和500500多个种。
多个种。
酵母菌的分类学特征酵母菌的分类学特征酵母菌是最成熟的真核生物表达系统酵母菌是最成熟的真核生物表达系统
(二)外源基因在酵母菌中的表达
(二)外源基因在酵母菌中的表达全基因组测序,遗传操作简便全基因组测序,遗传操作简便优势优势可分泌表达产物至培养基中可分泌表达产物至培养基中翻译后加工系统翻译后加工系统大规模发酵大规模发酵不含有特异性的病毒、不产内毒素不含有特异性的病毒、不产内毒素
(二)外源基因在酵母菌中的表达
(二)外源基因在酵母菌中的表达提高表达产率的突变宿主菌提高表达产率的突变宿主菌酵母菌的宿主系统酵母菌的宿主系统抑制超糖基化作用的突变宿主菌抑制超糖基化作用的突变宿主菌减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌
(二)外源基因在酵母菌中的表达
(二)外源基因在酵母菌中的表达酿酒酵母酿酒酵母(Sacchaoomycescerevisiae)已用于外源基因表达和研究的酵母菌已用于外源基因表达和研究的酵母菌巴斯德毕赤酵母(巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)乳酸克鲁维酵母(乳酸克鲁维酵母(Kluyveroyceslactis)非洲酒裂殖酵母(非洲酒裂殖酵母(Schizosaccharoycespombe)多态汉逊酵母(多态汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)酵母菌的转化方法酵母菌的转化方法
(二)外源基因在酵母菌中的表达
(二)外源基因在酵母菌中的表达原生质体转化法原生质体转化法碱金属离子介导的完整细胞的转化法碱金属离子介导的完整细胞的转化法电击转化法电击转化法
(二)外源基因在酵母菌中的表达
(二)外源基因在酵母菌中的表达外源基因稳态外源基因稳态mRNA的浓度的浓度外源基因外源基因mRNA的翻译活性的翻译活性酵母菌对密码子的偏爱性酵母菌对密码子的偏爱性外源基因表达的限制因素外源基因表达的限制因素
(二)外源基因在酵母菌中的表达
(二)外源基因在酵母菌中的表达应用成果应用成果乙肝病毒疫苗的批量生产乙肝病毒疫苗的批量生产酿酒酵母表达重组酿酒酵母表达重组HBsAg巴斯德毕赤酵母表达重组巴斯德毕赤酵母表达重组HBsAg(三)外源基因在哺乳动物细胞内(三)外源基因在哺乳动物细胞内的表达的表达1、基本概念、基本概念2、受体系统、受体系统3、载体系统、载体系统4、基因转移、基因转移高等哺乳动物基因工程高等哺乳动物基因工程基因表达技术基因表达技术转基因技术转基因技术转基因动物个体转基因动物个体动物工程细胞动物工程细胞哺乳动物遗传性状改良哺乳动物遗传性状改良药物筛选研究评价模型药物筛选研究评价模型人体基因治疗人体基因治疗蛋白多肽物质大规模生产蛋白多肽物质大规模生产药物筛选研究评价模型药物筛选研究评价模型高等哺乳动物细胞的生长特性高等哺乳动物细胞的生长特性(三)外源基因在哺乳动物细胞内(三)外源基因在哺乳动物细胞内的表达的表达锚地依赖性锚地依赖性血清依赖性血清依赖性接触抑制性接触抑制性形态依赖性形态依赖性作为受体细胞的条件作为受体细胞的条件(三)外源基因在哺乳动物细胞内(三)外源基因在哺乳动物细胞内的表达的表达细胞系便于大规模培养细胞系便于大规模培养遗传稳定性遗传稳定性合适的标记合适的标记生长快且齐生长快且齐安全性能好安全性能好常用的细胞系常用的细胞系(三)外源基因在哺乳动物细胞内(三)外源基因在哺乳动物细胞内的表达的表达中国仓鼠卵巢细胞(中国仓鼠卵巢细胞(CHO)载体系统载体系统(三)外源基因在哺乳动物细胞内(三)外源基因在哺乳动物细胞内的表达的表达质粒型载体质粒型载体如如pTK2质粒表达载体:
质粒表达载体:
SV40衍生物的表达载体衍生物的表达载体牛乳头瘤病毒(牛乳头瘤病毒(BPV)衍生载体)衍生载体人疱疹病毒(人疱疹病毒(EBV)衍生载体)衍生载体人腺病毒(人腺病毒(adenovirus)衍生载体)衍生载体反转录病毒(反转录病毒(retrovirus)衍生载体)衍生载体转化与转染转化与转染(三)外源基因在哺乳动物细胞内(三)外源基因在哺乳动物细胞内的表达的表达电击转化法电击转化法脂质体介导法脂质体介导法显微注射法显微注射法血影细胞介导法血影细胞介导法病毒转染法病毒转染法应用成果应用成果(三)外源基因在哺乳动物细胞内(三)外源基因在哺乳动物细胞内的表达的表达干扰素(干扰素(、)凝血因子(凝血因子(VIII、IX)促红细胞生成素(促红细胞生成素(EPO)生长因子(生长因子(hGH)白介素白介素2(IL-2)乙型肝炎表面抗原乙型肝炎表面抗原单克隆抗体单克隆抗体CD4受体受体组织型纤溶酶原激活剂(组织型纤溶酶原激活剂(tPA)复习题1、外源基因在大肠杆菌中以融合蛋白的形、外源基因在大肠杆菌中以融合蛋白的形式表达的优点是什么?
式表达的优点是什么?
2、什么是包涵体?
以包涵体形式表达外源、什么是包涵体?
以包涵体形式表达外源基因的优缺点是什么?
包涵体变性、溶解和复性基因的优缺点是什么?
包涵体变性、溶解和复性的主要方法是什么?
的主要方法是什么?
复习题3、已知一条基因其、已知一条基因其5和和3端分别含端分别含EcoRI和和BamHI位点,请简述其氨苄抗性大肠位点,请简述其氨苄抗性大肠杆菌表达系统构建的主要步骤。
杆菌表达系统构建的主要步骤。
复习题4、外源基因在酵母菌中表达的优点是什么、外源基因在酵母菌中表达的优点是什么?
你知道哪些重组蛋白质已在酵母中批量生产?
你知道哪些重组蛋白质已在酵母中批量生产?
5、高等哺乳动物基因工程的主要研究内容、高等哺乳动物基因工程的主要研究内容是什么?
是什么?
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- 基因工程 II 基因 表达 ppt62
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