高分辨率溶解曲线HRM.ppt
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高分辨率溶解曲线HRM.ppt
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SNP及突变研究的最新工具高分辨率熔解曲线(HighResolutionMelting)突变筛查和基因分型系统,北京思博全科技有限公司,内容提示,高分辨熔解曲线(HighResolutionMelting)高分辨熔解曲线在遗传育种中的应用筛查突变(mutationscanning)基因分型(MutationGenotyping)小片段+内标法(SmallAmpliconGenotyping)非标记探针法(UnlabeledProbeGenotyping,LunaProbe)SSR分析检测甲基化HRM仪器,HighResolutionDNAMelting(HRM)是基于有序列变化的Amplicon之间微弱的Tm值差异,通过DNA片段熔解曲线的差异进行突变检测,比如:
PCR,LightScanner突变检测原理,Lightscanner高分辨溶解曲线结果,Saturatingdye,LCGreenplus高分辨溶解曲线专用荧光染料,内容提示,高分辨熔解曲线(HighResolutionMelting)的定义高分辨熔解曲线在蚕的遗传育种中的应用筛查突变(mutationscanning)基因分型(MutationGenotyping)小片段+内标法(SmallAmpliconGenotyping)非标记探针法(UnlabeledProbeGenotyping,LunaProbe)SSR分析检测甲基化HRM仪器,MutationScanning,未知SNP扫描,M.H.Ye等对北京油鸡CAPN1基因外显子进行扫描,筛查其潜在SNPs。
BernhardJ.HoWngerHai-ChunJingKimE.Hammond-KosackKostyaKanyuka(BarleyApplication)TheorApplGenet(2009)119:
851865DOI10.1007/s00122-009-1094-2数据来自英国洛桑农业实验站,Bernhard等对Barley的eukaryotictranslationinitiationfactor4E(eIF4E)gene基因外显子进行突变扫描结果,内容提示,高分辨熔解曲线(HighResolutionMelting)的定义高分辨熔解曲线在蚕的遗传育种中的应用筛查突变(mutationscanning)基因分型(MutationGenotyping)小片段+内标法(SmallAmpliconGenotyping)非标记探针法(UnlabeledProbeGenotyping,LunaProbe)SSR分析检测甲基化HRM仪器,SmallAmpliconGenotyping扩增小片段直接进行基因型鉴定,使用已知Tm值的双链DNA做温度内标,低温内标Tm(61),高温内标Tm(92)内标能够实现96/384孔板的温度均一矫正。
PCR片段的Tm值范围:
70-88优点:
不需要探针,直接利用PCR产物针对已知突变位点进行基因分型,为何要使用温度内标,ATSNPwithoutCalibration72bp,ApplyTemperatureCalibration,ATSNPwithCalibration,SmallAmpliconGenotyping,M.H.Ye等对北京油鸡A-FABP基因进行小片段法基因分型,扩增片段为56bp,灰色曲线显示的是杂合型(CT),蓝颜色和红颜色曲线分别代表纯合型CC和TT。
内容提示,高分辨熔解曲线(HighResolutionMelting)的定义高分辨熔解曲线在蚕的遗传育种中的应用筛查突变(mutationscanning)基因分型(MutationGenotyping)小片段+内标法(SmallAmpliconGenotyping)非标记探针法(UnlabeledProbeGenotyping,LunaProbe)SSR分析检测甲基化HRM仪器,HRMLunaprobegenotyping,HRMLunaprobegenotyping,1Probe1SNP,AllPossibleSNPs,1Probe1SNP,AllPossibleSNPs,1Probe,2SNPs,1Amplicon,2Probes,2SNPs,1Amplicon-ApoE,2Probes,2SNPs,2Amplicons-HFE,AmpliconScanning发现新的突变,DavidDe,YongSongatel.Applicationoghigh-resolutionDNAmeltingforgenotypingandvariantscanningofdiploidandautotetraploidpotatoMolBreeding(2010)25:
6790,rr,RR,Rr,MixRr:
rrby1:
1Rrrr,MixRR:
Rrby1:
1RRRr,内容提示,高分辨熔解曲线(HighResolutionMelting)的定义高分辨熔解曲线在蚕的遗传育种中的应用筛查突变(mutationscanning)基因分型(MutationGenotyping)小片段+内标法(SmallAmpliconGenotyping)非标记探针法(UnlabeledProbeGenotyping,LunaProbe)SSR分析检测甲基化HRM仪器,RosarioMuleo(2009)等用HRM方法对三个品种的SSRDCA4进行分析,DCA4的等位基因有131bp的重复序列,杂合等位基因的序列为131-133bp,分析结果如图8所示,HRM曲线可以将纯合样品和杂合样品明显的区分,其中一个等位基因只相差2bp。
三种颜色(浅灰,深灰、黑色)表明3种不同的品种。
RosarioMuleo等得出结论:
HRM是一种快速、重复性高、成本低,操作简单,且可以应用于其他物种的SNP检测及SSR基因分型的方法。
RosarioMuleo,MarirChiaraColao,DarioMianoatel.2009Genome52:
252-260,内容提示,高分辨熔解曲线(HighResolutionMelting)的定义高分辨熔解曲线在蚕的遗传育种中的应用筛查突变(mutationscanning)基因分型(MutationGenotyping)小片段+内标法(SmallAmpliconGenotyping)非标记探针法(UnlabeledProbeGenotyping,LunaProbe)SSR分析检测甲基化HRM仪器,内容提示,高分辨熔解曲线(HighResolutionMelting)的定义高分辨熔解曲线在蚕的遗传育种中的应用筛查突变(mutationscanning)基因分型(MutationGenotyping)小片段+内标法(SmallAmpliconGenotyping)非标记探针法(UnlabeledProbeGenotyping,LunaProbe)SSR分析检测甲基化HRM仪器,2005LightScanner96/38496/384孔板8分钟/板2-6秒/样品温度均一性:
0.15oC数据采集速度:
大于100pts/秒升温速度:
0.1oC/秒,2010LS3232样品转盘,玻璃毛细管HRM检测60分钟内完成定量PCR和HRM检测HRM检测升温速度可以在0.050.90oC/秒之间调节在升温速度小于0.3/秒时,温度均一性:
0.05oC数据采集速度:
20pts/秒400pts/秒(与升温速度有关)0.3oC/秒升温速度=67pts/0.05oC/秒升温速度=400pts/,LightScanner高分辨溶解曲线应用,LunaProbes非标记探针基因分型,未知SNP扫描,SmallAmplicon小片段基因分型,HRM分析流程,在PCR反应前加入LCGreen荧光染料时间大约2小时(包含试剂准备)在LightScanner上进行高分辨溶解曲线分析大约需要5-10分钟数据分析和处理大约需要5-10分钟PCR产物可以直接进行下游的测序分析等(如需要)大约需要30-60分钟,LightScanner适于SNP分析,速度、通量LightScanner510分钟完成96/384孔板的PCR产物检测,20000个SNP/天可检测未知、已知突变,对已知突变进行Genotyping检测未知及已知突变准确性100%、特异性92.7%(400bp)重复性LightScanner重复性100%费用LightScanner检测SNP每个样品的荧光染料成本为1.6RMB操作LightScanner只需将PCR产物(96/384孔板)放入仪器内便可,软件自动基因分型,PCR产物不需要处理,谢谢!
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