发酵工程技术概论.ppt
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发酵工程技术概论.ppt
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第八章发酵工程技术概论,第一节概述,一、发酵工程(fermentationengineering)又称微生物工程:
通过微生物完整的细胞自催化完成生物化学反应过程,微生物既能正常生长又能过量积累目的产物,提供工业产品。
包括:
抗生素,氨基酸,维生素,有机酸,酶制剂,蛋白质,基因工程药物,核酸类等。
二、发酵工程发展的4个阶段
(1)厌氧发酵的生产过程:
如酒精,乳酸等。
(2)好氧(通气)发酵的生产过程:
如抗生素、氨基酸、酶制剂等。
第一阶段:
天然发酵阶段:
传统的酿酒、制酱等。
1675年荷兰人列文虎克发明了显微镜。
法国巴斯德在18571876持续研究发酵作用。
第二阶段:
19001940人工控制微生物发酵过程(纯培养阶段),新产品酵母,甘油,乳酸,柠檬酸,丙酮和丁醇(第一个工业发酵产品)第三阶段:
通气搅拌技术阶段(深层通气培养法),1942年青霉素工业化生产,1944年链霉素。
第四阶段:
利用基因工程菌进行发酵阶段。
三、发酵工程的研究内容生产菌种的培养和选育(菌种)培养基制备(培养基)发酵条件的优化与控制(搅拌通气,溶氧,发酵过程参数控制,反应器的设计)产物的分离、提取与精制等(纯化)菌种工艺设备,第二节优良菌种的选育,一、菌种选育的物质基础:
DNA二、自然选育(spontaneousmutation):
自发突变(正负)三、诱变育种:
人工诱变四、原生质体融合:
基因重组,三、诱变育种
(一)方法和原理1.诱变机制
(1)微小损伤突变:
碱基置换,码组移动
(2)染色体畸变:
易位,逆位,缺失,重复(3)染色体组突变:
数目变化(单倍体变多倍体)2.诱变剂及其作用方式:
物理诱变剂,化学诱变剂,生物诱变剂常用诱变剂p-263,
(二)诱变和筛选初步筛选是关键步骤1.自身耐药突变株:
耐受自身分泌的抗生素,提高产量2.结构类似物或前体类似物的耐受突变株:
解除反馈抑制3.营养缺陷型及其回复突变株,通过诱变导致某些基因的突变,而需要添加一些物质(氨基酸、核苷酸等)才能生长的突变体。
营养缺陷型的作用:
解除末端产物的反馈调节作用。
作为标记,在杂交育种中作为出发菌株有利于杂交重组的分析。
作为基因工程的受体菌,检出克隆基因的表达。
3.营养缺陷型及其回复突变株,诱变包括:
出发菌株的选择诱变剂种类和诱变剂剂量的选择合理的使用方法筛选包括:
初筛重复筛选突变株性能检测直到获得新的优良菌株。
四、原生质体融合原生质体(protoplast):
指除去细胞壁的细胞或是说一个被质膜所包围的裸露细胞。
1.一般程序2.影响融合的因素:
菌龄,培养基成分,PEG,外界因素(高渗溶液,酵母膏)3.原生质体融合育种:
真菌(蘑菇),细菌,植物(马铃薯、草莓、胡萝卜、烟草、矮牵牛、拟南芥、油菜、玉米、水稻、豌豆、甘蔗、柑桔、猕猴桃等),原生质体融合目前最成功且至今广为使用的是以PEG作为融合剂,对于所有种类的真菌而言,PEG诱导融合剂条件基本一致:
(1)原生质尽可能的幼嫩;
(2)原生质体要纯;(3)最适的高渗稳定剂;(4)用于融合的两菌株原生质体的浓度一般为107,两菌株总量为11;(5)PEG分子量为40006000,浓度为2540,(6)pH79在Ca2+存在下融合率可进一步提高。
融合子的检出原生质体融合后,如何筛选融合子,是原生质体技术应用的关键。
其方法有:
营养缺陷型互补选择抗药性选择灭活原生质体荧光染色分子标记选择还可借助形态标记,自然生态标记等来初判异源融合子。
第三节发酵的基本过程,一、菌种:
04休眠保存,砂土管12年二、种子的制备:
摇瓶种子罐扩大生产三、发酵:
培养基,发酵罐参数四、发酵液预处理五、提取精制,温度2637,压力0.30.5kg/cm2,搅拌速度,通气量0.31m3/m3,接种量5%20%,pH,培养基体积、粘度、泡沫情况、菌丝形态、溶氧浓度、CO2含量、总糖、氮、磷、产物含量等。
发酵周期一般28d,发酵罐参数,第四节发酵方式*,一、分批(间歇)发酵:
物料一次投入反应器中,灭菌、接种、发酵。
特点:
一次性;发酵过程中,营养不断减少,微生物不断增殖,环境非稳态;微生物生长的四个时期明显;应用广泛,改善(在线检测,计算机控制)。
二、补料分批发酵:
补加新鲜培养基。
特点:
可以解除底物抑制、产物抑制或克服微生物过度生长;提高有用产物的转化率;应用广泛,用于面包酵母、氨基酸、抗生素等工业;,三、连续发酵:
恒化器(基质恒)、恒浊器(菌体密度恒),连续进料出料平衡,保持恒定的发酵液密度。
易实现自动化生产,如啤酒,乙醇的发酵。
优点:
操作稳定;利于机械、自动化;提高设备的利用率;减少灭菌次数;易于过程优化。
缺点:
易染菌;微生物易变异;对产品类型的适应性不广;对设备及附件要求高。
第五节发酵工艺控制,培养基的影响及其控制温度的影响及其控制溶氧的影响及其控制pH的影响及其控制,一、培养基的影响及其控制1.碳源:
糖类,脂肪,有机酸,碳氢化合物(速效碳源葡萄糖;迟效碳源淀粉,乳糖)2.氮源:
无机氮源,有机氮源(速效氮源氨基酸,玉米浆;迟效氮源黄豆饼粉,花生饼粉、棉籽饼粉)。
速效促生长,迟效利代谢。
3.无机盐和微量元素4.水5.发酵培养基的配制
(1)提供必要的营养成分
(2)配制合适的浓度(3)主成分与其他成分的配比(4)控制合适的pH,培养基的主要成分
(1)碳源:
是组成培养基的主要成分之一(菌体干物质的50%以上是碳)。
主要功能:
提供能源;菌体成分;产物碳架;来源:
葡萄糖、糖蜜、淀粉及水解物是常用的碳源。
(2)氮源:
氮源也是培养基的主要成分之一(占干物质量的10%)。
主要功能:
构成细胞物质。
构成产物。
来源:
花生粉、黄豆饼粉、玉米浆、铵盐、硝酸盐、尿素和氨水等是常使用的氮源。
(3)无机盐及微量元素:
主要功能:
构成菌体成分(S)激活酶(Mg2+)辅酶或辅基的组成部分参与能量转移反应调节渗透压、pH、氧化还原电位来源:
无机盐、原料、灰分。
(4)特殊生长因子:
不可缺、量微,自身不能合成或量不够。
主要功能:
构成辅酶促进生命活动来源:
玉米浆、糖蜜、甜菜糖、麸皮、米糠。
(5)水:
水是物质溶解和生化反应的基础。
功能:
机体的重要组成成分;参加一些代谢反应;良好溶剂(介质)和热导体;,二、温度的影响及其控制1.影响发酵温度变化的因素
(1)生物热:
生长,呼吸,繁殖
(2)搅拌热:
摩擦(3)蒸发热:
(4)辐射热:
罐内外温差2.温度的选择与控制
(1)最适温度:
生长温度,生产温度变温发酵,如青霉素发酵305h2535h2085h2540h放罐;青霉素产量比25恒温发酵高14.7%。
(2)温度控制一般不需加热,冷却水(冷冻盐水)通过夹层循环冷却。
三、溶氧的影响及其控制1.溶氧的影响:
最适氧浓度溶氧对菌体生长和产物的性质及产量都影响谷氨酸发酵VB12发酵天冬酰胺酶发酵2.发酵过程的溶氧变化红霉素发酵:
前期,中期,后期溶氧异常下降(污染好气杂菌,菌体代谢异常),溶氧异常升高(污染噬菌体)3.溶氧浓度的控制供氧方面(提高氧传递);需氧量(菌体浓度,基质种类,培养条件),四、pH的影响及其控制1.pH对发酵的影响最适生长pH(36)最适生产pH2.pH的变化3.发酵pH的确定和控制
(1)发酵pH的确定:
菌种,培养基组成,培养条件,温度
(2)pH的控制:
补料,酸,碱,尿素,测定代谢曲线的pH变化,稳定工艺条件。
常用的控制方法有:
调整生理碱性和酸性盐类的比例;选择不同C、N的种类和比例;添加缓冲剂。
第六节发酵产物的提取,吸附法沉淀法溶剂萃取法离子交换法,培养液预处理的目的在于改变培养液的性质,使其便于过滤和提取。
细胞破碎的方法有机械、生物和化学等各种方法。
精制一、吸附法:
吸附剂(活性炭,白陶土,氧化铝)在一定的pH条件下使发酵液中的抗生素被吸附,然后改变pH,以适当的洗脱剂(一般是有机溶剂)把抗生素从吸附剂上解吸下来,以达到浓缩和提纯的目的。
如丝裂霉素还可以脱色和除热原优点:
操作简单,成本低,缺点:
吸附不稳定,选择性不高,不能连续生产,影响卫生,新型吸附剂(大孔树脂),二、沉淀法:
抗生素等电点沉淀或与酸、碱、离子形成复盐沉淀析出,改变pH重新溶解。
如土霉素,四环素,金霉素优点:
设备简单,节省溶剂,收率高缺点:
过滤较困难三、溶剂萃取法:
改变pH,改变溶剂,改变溶解度青霉素,红霉素,洁霉素,赤霉素,麦迪霉素,新生霉素,更新霉素,创新霉素。
带溶剂(溴代十五烷基吡啶PPB)形成复盐。
优点:
产品纯度高,浓缩倍数大,能连续生产,周期短缺点:
溶剂耗量大,成本高,设备要求高(溶剂回收,防火防爆),四、离子交换法带负电荷的酸性抗生素用阴离子交换树脂:
万古霉素,杆菌肽带正电荷的碱性抗生素用阳离子交换树脂:
链霉素,卡那霉素,巴龙霉素,庆大霉素优点:
设备简单,节省溶剂,操作方便缺点:
pH变化大,周期长,理想的微生物细胞生物反应器的基本要求,1.生物反应器的材料无毒,稳定性好,一般用不锈钢制成2.生物反应器的结构:
满足传质、传热、混合的功能3.密封良好,避免污染4.自动检测、调节控制精度高5.搅拌器转速和通气应适当6.容器内表面光滑,无死角,利于清洁、灭菌7.拆装、连接、清洁方便,能耐高压蒸汽消毒8.设备成本低,第七节发酵设备,主要参数的检测和控制方法,温度,空气过滤pH,灭菌系统,溶氧搅拌进出液流量,第八节发酵工程产品的制造实例,一、青霉素:
用发酵法制母体化合物二、L-赖氨酸三、维生素B2,一、基因工程在抗生素生产中的应用二、基因工程在氨基酸生产中的应用三、基因工程在维生素生产中的应用,第九节基因工程在发酵工程中的应用,一、基因工程在抗生素生产中的应用1、几种典型的抗生素生物合成基因簇的结构特点链霉素(G+C含量70%)青霉素、红霉素、氯霉素、链霉素、土霉素等,抗生素生物合成基因大多处于一个基因簇中(约1030个基因)抗生素生物合成基因除定位在染色体上,还有的定位在质粒上,如次甲霉素A生物合成基因定位在天蓝色链霉菌的SCP1质粒上。
2、克隆抗生素生物合成基因的策略和方法在标准宿主系统中克隆检测单基因产物(鸟枪法)阻断变株法突变克隆法:
基因重组直接克隆法:
克隆整套生物合成基因,如头霉素C克隆抗生素抗性基因法:
抗性基因与合成基因连锁寡核苷酸探针法:
同源基因杂交法:
结构类似的抗生素有同源的生物合成基因,3、提高抗生素产量
(1)增加参与生物合成限速阶段基因的拷贝数
(2)通过调节基因的作用(3)增加抗性基因4、改善抗生素的组分5、改进抗生素生产工艺:
克隆血红蛋白基因到抗生素产生菌中,提高细胞氧的利用率。
6、产生杂合抗生素
(1)生物合成途径中某个酶基因突变
(2)引入一个酶基因(3)利用底物特异性不强的酶催化形成新产物7、组合生物合成微生物次级代谢产物合成是多酶体系参与的,特点是:
(1)通过多个催化功能的组合完成复杂化合物的合成
(2)化合物为天然产物(3)适用于化学合成困难的复杂化合物聚酮(酮体)合成酶(polyketidesynthase,PKS),二、基因工程在氨基酸和维生素生产中的应用1、在氨基酸生产中的应用2、在维生素生产中的应用,第十节发酵工程的发展展望,1.采用基因工程,细胞工程技术选育菌种2.研究发酵过程,确定最适生产参数3.设计合适的反应器和分离技术4.工业自动化,连续化生产,
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