Illumina测序介绍.pptx
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Illumina测序介绍.pptx
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Illumina测序技术概述,课程结束时:
清楚了解Illumina测序流程中的主要步骤能够描述簇生成(ClusterGeneration)的过程理解边合成边测序(SequencingbySynthesis)的原理,课程目标,IlluminaSequencingWorkflow,Illumina测序流程,文库制备,簇生成,测序,数据分析,IlluminaSequencingWorkflow,Illumina测序流程,文库制备,簇生成,测序,数据分析,双端标签文库,文库制备是决定测序实验成功与否的关键步骤,与流动槽(FlowCell)结合的区域,Read1和Read2测序引物结合的区域,插入片段,标签序列区域(Index),IlluminaSequencingWorkflow,Illumina测序流程,文库制备,簇生成,测序,数据分析,WhatisaFlowCell?
Eachlaneisrandomlycoatedwithalawnofoligosthatarecomplementarytolibraryadapters每条通道中都随机植入了能与文库接头互补结合的大量短DNA片段,流动槽(FlowCell)是什么?
Aflowcellisathickglassslidewithchannelsorlanes一种含有通道的厚玻璃片,簇生成,SingleDNALibrary单个DNA文库分子,AmplifiedClonalCluster扩增后的DNA克隆簇,HybridizeFragment&Extend,片段杂交与延伸,DenatureDouble-StrandedDNA,Discard洗去丢弃,双链DNA变性,Single-StrandedDNA,单链DNA,BridgeAmplification,桥式PCR扩增,BridgeAmplification,桥式PCR扩增,DenatureDouble-StrandedBridge,双链DNA桥式结构变性,BridgeAmplification,桥式PCR扩增,BridgeAmplification,桥式PCR扩增,Linearization,线性化,ReverseStrandCleavage,反链切除,Blocking,DNA链封闭,Read1PrimerHybridization,Sequencingprimer测序引物,Read1引物杂交,IlluminaSequencingWorkflow,Illumina测序流程,文库制备,簇生成,测序,数据分析,SequencingBySynthesis,边合成边测序(SBS),ReversibleTerminatorChemistry,可逆阻断,3阻断基团,切除位点,荧光基团,去阻断后自由的3OH端,ClustersDNA簇,TTTTTTTGT,TGCTACGAT,Theidentityofeachbaseofaclusterisreadofffromsequentialimages根据每个点每轮反应读取的荧光信号序列,转换成相应的DNA序列,照相读取序列,FourChannelSBSChemistry:
GA,HiSeq,MiSeq四通道SBS,每种DNA碱基具有独特的荧光波长(不同的颜色),双通道SBS测序仅使用2张图像测序簇中掺入核苷酸T时仅在绿色通道中出现测序簇中掺入核苷酸C时仅在红色通道中出现测序簇中掺入核苷酸A时在绿色和红色通道中都出现测序簇中掺入核苷酸G时在绿色和红色通道中都不出现将测序簇在两种通道中的荧光强度坐标以图表画出,即可相应地读出不同碱基,TwoChannelSBSNextSeq双通道SBS,PairedEndSequencing,双末端测序,Reference参考序列Single-reads单端序列信息Paired-reads双端序列信息,SequencingwithPairedEnds,双末端测序,Sequencedstrand测序生成链,Blocked3-ends被阻断的3端,PairedEndSequencing双末端测序,Discard洗去丢弃,Bridgeformation桥式结构,PairedEndSequencing,双末端测序,DoublestrandedDNA双链DNA(桥式结构),PairedEndSequencing,双末端测序,Originalforwardstrand原始的正链,PairedEndSequencing,双末端测序,ReversestrandTemplate反义链模板,Blocked3-ends阻断3端,Sequencingprimer测序引物,PairedEndSequencing,双末端测序,SequencingBySynthesis2ndRead,Read2边合成边测序,SequencingPairedEndLibrarieswithSingleIndexRead,单标签(SingleIndex)双末端测序,1,2,3,MultiplexSequencingUtilizes3SequencingReads,SingleIndexSequencingUtilizes3SequencingReads单index双末端测序使用3种测序引物,3次序列读取,SequencingwithPairedEnds,双末端测序(单标签),正向序列读取,索引序列读取,反向序列读取,SequencingPairedEndLibrarieswithDualIndexRead,双标签(DualIndex)双末端测序,DualIndexSequencingUtilizes4SequencingReads双标签双末端测序包含4次测序读取,但是只用到3条不同测序引物(反向索引序列的读取使用了流动槽上锚定的P5序列),SequencingPairedEndLibrarieswithDualIndexRead,双末端测序(双标签)适用于GAIIx,MiSeq,HiSeq1500/2000/2500,正向序列读取,正向索引序列读取,反向索引序列读取,反向序列读取,仅进行化学合成,不照相,PairedEndTurnaround序列翻转,DualIndexSequencingUtilizes4SequencingReads双索引双末端测序包含4次测序读取,用到4条不同测序引物,SequencingPairedEndLibrarieswithDualIndexRead,双末端测序(双标签)适用于NextSeq,HiSeq3000/4000,1,2,3,4,正向序列读取,正向索引序列读取,反向索引序列读取,反向序列读取,PairedEndTurnaround序列翻转,IlluminaSequencingWorkflow,Illumina测序流程,文库制备,簇生成,测序,数据分析,DataAnalysisOverview,数据分析总览,AlignmentsandVariantDetection序列比对和突变检测,Images/TIFFfiles图片文件,Software,Outputs,PrimaryandSecondaryAnalysisOverview,AnalysisType,PrimaryAnalysis初级分析,SecondaryAnalysis二级分析,Sequencing测序,ICS/RTA,ICS/RTA,HiSeqAnalysisSoftware,初级和二级数据分析总览,Summary,总结,文库制备,簇生成,测序,数据分析,问题?
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