食品检验检疫新技术.ppt
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第四章第四章食品检验检疫新技术食品检验检疫新技术第一节第一节免疫学检测技术免疫学检测技术1.1.基本概念基本概念抗抗原原:
凡凡能能刺刺激激机机体体产产生生抗抗体体和和致致敏敏淋淋巴巴细细胞胞,并并能能与之结合引起特异性免疫反应的物质称为抗原。
与之结合引起特异性免疫反应的物质称为抗原。
抗抗体体:
在在抗抗原原刺刺激激下下产产生生的的,并并能能与与之之特特异异性性结结合合的的免疫球蛋白。
免疫球蛋白。
血血清清学学试试验验:
抗抗原原抗抗体体在在体体外外发发生生的的特特异异性性结结合合反反应应、抗抗原原抗抗体体的的反反应应一一般般都都要要用用血血清清,故故称称为为血血清清学学试试验或血清学反应。
验或血清学反应。
免免疫疫学学检检测测方方法法的的原原理理:
是是借借助助抗抗原原和和抗抗体体在在体体外外特特异异性性结结合合后后出出现现的的各各种种现现象象,对对标本中的抗原或抗体进行定量或定性的检测。
标本中的抗原或抗体进行定量或定性的检测。
可以作为抗原进行检测的物质分为以下四可以作为抗原进行检测的物质分为以下四类:
类:
各种微生物及其大分子产物;各种微生物及其大分子产物;生物体内各种大分子物质;生物体内各种大分子物质;人和动物细胞的表面分子;人和动物细胞的表面分子;各种半抗原物质。
各种半抗原物质。
酶酶联联免免疫疫吸吸附附试试验验是是在在免免疫疫酶酶技技术术的的基基础础上上发发展展起起来来的的一一种种新新型型的的免免疫疫测测定定技技术术,其其基基本本原原理理是是抗抗体体(抗抗原原)与与酶酶结结合合后后,仍仍能能和和相相应应的的抗抗原原(抗抗体体)发发生生特特异异性性反反应应,将将待待检检测测样样品品事事先先吸吸附附在在固固相相载载体体表表面面称称为为包包被被;加加入入酶酶标标抗抗体体(抗抗原原),酶酶标标抗抗体体(抗抗原原),与与吸吸附附在在固固相相载载体体上上的的相相应应的的抗抗原原(抗抗体体)发发生生特特异异性性反反应应,形形成成酶酶标标记记的的免免疫疫复复合合物物,不不能能被被缓缓冲冲液液洗洗掉掉;当当加加入入酶酶的的底底物物时时,底底物物发发生生化化学学反反应应,呈呈现现颜颜色色变变化化,颜颜色色的的深深浅浅与与待待测测抗抗原原或或抗抗体体的的量量相相关关,借借助助分分光光光光度度计计的的吸吸光光度度计计算算抗抗原原(抗抗体体)的的量量,也可用肉眼定性观察。
也可用肉眼定性观察。
抗抗原原抗抗体体的的特特异异性性和和敏敏感感性性,使使得得食食品品在在未未经经分分离离提提取取的的条条件件下下,即即可可进进行行定定量量和和定定性性分分析析,而而一一般般的的化化学学分分析析都都需需要要经经过过分分离离提提取取等等复复杂杂过过程程。
近近年年来来,该该项项技技术术主主要要用用于于细细菌菌及及毒毒素素、真真菌菌及及毒毒素素、病病毒毒和和寄寄生生虫虫的的检检测测;用用于于蛋蛋白白质质、激激素素、其其他他生生理理活活性性物物质质、兽兽药药残残留留、农农药药残残留留、抗抗生生素素等等的的检检测。
测。
第二节第二节核酸提取方法与探针技术核酸提取方法与探针技术样品增菌后的核酸提取方法:
样品增菌后的核酸提取方法:
热裂解法热裂解法反复冻融法反复冻融法酶裂解法酶裂解法微波法微波法化学裂解法化学裂解法超声破碎法超声破碎法样品无需增菌的核酸提取方法:
样品无需增菌的核酸提取方法:
IMS法(免疫磁珠法)法(免疫磁珠法)FTA滤膜吸附法滤膜吸附法病毒核酸的提取:
病毒核酸的提取:
异异硫硫氰氰酸酸胍胍-SiO2法法:
异异硫硫氰氰酸酸胍胍可可以以裂裂解解细细胞胞壁壁,并并灭灭活活核核酸酸酶酶,释释放放出出来来的的核核酸酸被被经经处处理理的的SiO2所所吸吸附附,从而达到纯化目的。
从而达到纯化目的。
Glycine-PEG-Tri-reagent-poly(dT)法法:
通通过过调调节节PH和和PEG沉淀核酸,再用沉淀核酸,再用poly(dT)纯化核酸。
纯化核酸。
探针的标记物分类:
探针的标记物分类:
放射性同位素放射性同位素非放射性标记物:
非放射性标记物:
是通过酶促反应将特定的是通过酶促反应将特定的底物转变为声色物质或化学发光物而达到放大底物转变为声色物质或化学发光物而达到放大信号的目的。
常用的标记物金属、荧光染料、信号的目的。
常用的标记物金属、荧光染料、地高辛、生物素和酶等,可通过酶促反应、光地高辛、生物素和酶等,可通过酶促反应、光促反应或化学修饰等方法标记到核酸分子上。
促反应或化学修饰等方法标记到核酸分子上。
探针技术探针技术探针的标记方法:
探针的标记方法:
缺口平移法缺口平移法随机引物法随机引物法末端标记法末端标记法PCR标记法标记法第三节第三节PCRPCR检测技术检测技术PCRPCR即聚合酶链反应的简称。
即聚合酶链反应的简称。
PCRPCR是在体外模拟是在体外模拟DNADNA复制的过程,在体外合适的条件下以单链复制的过程,在体外合适的条件下以单链DNADNA为模为模板,以人工设计和合成的寡核苷酸为引物,利用热稳板,以人工设计和合成的寡核苷酸为引物,利用热稳定的定的DNADNA聚合酶延聚合酶延55-3-3方向渗入单核苷酸来特异性方向渗入单核苷酸来特异性的扩增的扩增DNADNA片段的技术。
整个反应过程通常由片段的技术。
整个反应过程通常由20-4020-40个个PCRPCR循环组成,每个循环由变性、退火、延伸三个步循环组成,每个循环由变性、退火、延伸三个步骤组成。
骤组成。
PCR的种类:
的种类:
(1)多重)多重PCR
(2)免疫)免疫PCR(3)PCR-SSCP分析技术分析技术(4)实时荧光定量)实时荧光定量PCR(5)反转录)反转录PCR(6)不对称)不对称PCR(7)反向)反向PCRPCR检测技术的应用:
检测技术的应用:
(1)检测产单核细胞李斯特菌)检测产单核细胞李斯特菌
(2)检测金黄色葡萄球菌)检测金黄色葡萄球菌(3)检测沙门氏菌)检测沙门氏菌(4)检测致泻大肠杆菌)检测致泻大肠杆菌第四节第四节基因芯片技术基因芯片技术基基因因芯芯片片又又称称DNA微微阵阵列列,是是指指由由按按照照预预定定位位置置固固定定在在固固相相载载体体上上很很小小面面积积内内的的千千万万个个核核酸酸分分子子所所构构成成的的微微点点阵阵阵阵列列。
在在一一定定条条件件下下,载载体体上上的的核核酸酸分分子子可可以以与与来来自自样样品品的的互互补补核核酸酸片片段段杂杂交交。
如如果果把把样样品品中中的的核核酸酸点点段段进进行行标标记记,在在专专用用的的芯芯片片阅阅读读仪仪上就可以检测到杂交信号。
上就可以检测到杂交信号。
基因芯片技术可以应用于转基因食品的检测中。
基因芯片技术可以应用于转基因食品的检测中。
基因芯片的分析步骤基因芯片的分析步骤
(1)样品活化样品活化
(2)靶靶DNA的选择的选择(3)PCR扩增扩增(4)玻片的活化玻片的活化(5)芯片的制备芯片的制备(6)杂交杂交(7)洗涤洗涤(8)扫面玻片和数据处理扫面玻片和数据处理检测转基因食品基因芯片的制备方法:
检测转基因食品基因芯片的制备方法:
1.1.选选择择目目的的片片段段根根据据食食品品原原料料来来源源的的具具体体情情况况选选择择不不同同基基因因或或其其片片段段作作为为检检测测对对象象,分分别别设设计计扩扩增增引引物物,PCRPCR扩扩增增获得探针,将探针纯化,浓缩后点样于固相支持物上。
获得探针,将探针纯化,浓缩后点样于固相支持物上。
2.2.转基因食品转基因食品DNADNA的提取的提取3.3.目的片段的扩增和标记目的片段的扩增和标记4.4.杂交和洗涤杂交和洗涤5.5.杂杂交交结结果果的的检检测测:
以以基基因因芯芯片片扫扫描描仪仪在在一一定定波波长长进进行行扫扫描检测。
描检测。
第五节第五节生物传感器生物传感器生生物物传传感感器器由由一一种种含含有有固固定定化化生生物物活活性性物物质质(如如酶酶、抗抗体体、全全细细胞胞、细细胞胞器器或或其其他他联联合合体体)做做敏敏感感元元件件,配配上上适适当当的的换换能能器器所所构构成成的的分分析析工工具具(或或分分析析系系统统)称称为为生生物物传传感感器器。
它它可可将将生生化化信信号号转转化化为为数数量量化化的的电电信信号。
号。
生物传感器一般由两个主要部分组成:
生物传感器一般由两个主要部分组成:
一是生物一是生物分子识别元件(感受器),分子识别元件(感受器),是具有分子识别能力的生是具有分子识别能力的生物活性物质(如酶、抗体、组织切片、细胞、细胞器、物活性物质(如酶、抗体、组织切片、细胞、细胞器、细胞膜、核酸、有机物分子等);细胞膜、核酸、有机物分子等);二是信号转换器二是信号转换器(换能器)(换能器)主要有电化学电极、光学检测元件、热敏主要有电化学电极、光学检测元件、热敏电阻、场效应晶体管、压电石英晶体及表面等离子共电阻、场效应晶体管、压电石英晶体及表面等离子共振元件等。
振元件等。
当当待待测测物物与与分分子子识识别别元元件件特特异异性性结结合合后后,所所产产生生的的复复合合物物通通过过信信号号转转换换器器转转变变为为可可以以输输出出的的电电信信号号、光信号等,从而达到分析检测的目地。
光信号等,从而达到分析检测的目地。
生物传感器的工作原理生物传感器的工作原理(11)将化学变化转变成电信号)将化学变化转变成电信号(22)将热变化转换成电信号)将热变化转换成电信号(33)将光信号转变为电信号)将光信号转变为电信号(44)直接产生电信号形式)直接产生电信号形式常见的生物传感器及其应用常见的生物传感器及其应用酶酶传传感感器器:
酶酶传传感感器器是是由由固固定定化化酶酶和和电电化化学学器器件件构构成成,通通过过电电极极反反应应检检测测出出与与酶酶反反应应有有关关的的物物质质,并并转转换换为为电电信信号号,从从而而检检测测试试液液中中的的特特定定成成分分的的浓浓度度。
酶酶传传感感器器是是间间接接型型传传感感器器,他他不不是是直直接接测测量量待待测测物物质质,而而是是通通过过与与反反应应有有关关的的物物质质间间接接地地测测量量待待测物质。
测物质。
常见的生物传感器及其应用常见的生物传感器及其应用组组织织感感器器:
是是以以动动植植物物组组织织薄薄片片中中的的生生物物催催化化层层与与基基础础敏敏感感膜膜电电极极结结合合而而成成,该该催催化化层层以以酶酶为为基基础础,基本原理与酶传感器相同。
基本原理与酶传感器相同。
常见的生物传感器及其应用常见的生物传感器及其应用微微生生物物传传感感器器微微生生物物传传感感器器由由包包括括微微生生物物的的膜膜状状感感受受器器和和电电化化学学换换能能器器组组合合而而成成,可可以以分分为为:
以以微微生生物物呼呼吸吸活活性性(氧氧消消耗耗量量)为为指指标标的的呼呼吸吸活活性性测测定定型型传传感感器器,以以微微生生物物的的代代谢谢产产物物(电电极极活活性性物物质质)为为指标的电极活性物质测定型传感器。
指标的电极活性物质测定型传感器。
微生物传感器在食品工业和环境检测中均有应用。
微生物传感器在食品工业和环境检测中均有应用。
免免疫疫传传感感器器:
利利用用抗抗体体能能够够识识别别抗抗原原并并和和被被识识别别抗抗原原结结合合的的功功能能,借借此此开开发发的的生生物物传传感感器器为为免免疫疫传传感感器器。
免免疫疫传传感感器器是是以以免免疫疫测测定定法法的的原原理理为为基基础础构构成成的的,可可分分为为标标识识免免疫疫方方式式和和非非标标识识免免疫疫方方式式。
可可以以识识别别肽肽或或蛋蛋白白质质等高分子之间微小的结构差异。
等高分子之间微小的结构差异。
免疫传感器的应用:
免疫传感器的应用:
(1)检检测测食食品品中中的的毒毒素素毒毒素素的的检检测测主主要要集集中中在在伏伏马马菌菌素素、葡葡萄萄球球菌菌肠肠毒毒素素、黄黄曲曲霉霉毒毒素素、肉肉毒毒毒毒素素等等上上,所所用用传传感感器器大大多多数采用光纤免疫传感器。
数采用光纤免疫传感器。
(2)检检测测食食品品中中的的细细菌菌以以电电化化学学为为基基础础的的免免疫疫传传感感器器已已成成功用于检测细菌毒素蛋白质。
功用于检测细菌毒素蛋白质。
DNA生生物物传传感感器器DNA生生物物传传感感器器包包括括两两部部分分,分分子子识识别别器器件件(DNA)和和换换能能器器。
其其设设计计原原理理是是在在电电极极上上固固定定一一条条含含有有十十几几至至上上千千条条核核苷苷酸酸的的单单链链DNA,通通过过DNA分分子子杂杂交交,对对另另一一条条含含有有互互补补碱碱基基序序列列的的DNA进进行行识识别别,结结合合成成双双连连DNA。
杂杂交交反反应应在在敏敏感感元元件件上上直直接接完完成成,换换能能器器能能将将杂杂交交过过程程所所产产生生的的变变化化转转变变成成电电信信号号。
根根据据杂杂交交前前后后电电信信号号的的变变化化量量,推推测测出被检测的出被检测的DNA量。
量。
DNA生生物物传传感感器器的的应应用用:
应应用用于于细细菌菌病病、病病毒毒病病、中毒病、肿瘤病等疾病的检测方面。
中毒病、肿瘤病等疾病的检测方面。
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