核酸分子杂交2讲课文档.ppt
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核酸分子杂交第1页,共167页。
核酸分子杂交第2页,共167页。
(一)
(一)“戴帽安尾(穿靴)戴帽安尾(穿靴)”(核内)(核内)5加帽和多聚腺加帽和多聚腺苷酸化及其调控意义苷酸化及其调控意义1.mRNAcaping5加上加上GpppmNP帽子,帽子,tailing加上加上AA(50200bp)尾巴。
)尾巴。
意义(意义
(1)保护作用)保护作用保护保护mRNA免受核酸酶降解,免受核酸酶降解,
(2)标识作用)标识作用为翻译提供识别位点(为翻译提供识别位点(CBP)。
)。
2.rRNA不易被降解的机理可能是因为其组成核糖体不易被降解的机理可能是因为其组成核糖体是在核内组装的。
是在核内组装的。
3.tRNA合成后形成特殊的空间结构(三叶草,倒合成后形成特殊的空间结构(三叶草,倒L),可能抵抗降解,半寿期长。
),可能抵抗降解,半寿期长。
3第3页,共167页。
4第4页,共167页。
hnRNA内含子剪接位点的碱基顺序具有最强的保守性内含子剪接位点的碱基顺序具有最强的保守性5GTAG35第5页,共167页。
(二)
(二)mRNA的选择剪接对基因表达的调控作用的选择剪接对基因表达的调控作用1.mRNA的选择剪接有多种方式的选择剪接有多种方式选择剪接方式选择剪接方式要要点点
(1)外显子选择)外显子选择Optionexon或称外显子跳跃(或称外显子跳跃(exonskipping)全部保留或至少删除全部保留或至少删除1个或几个外显子。
个或几个外显子。
(2)内含子选择)内含子选择Optionintron内含子全部删除保留内含子全部删除保留1个(近来也个(近来也有内含子表达的报道)。
有内含子表达的报道)。
(3)互斥外显子)互斥外显子Mutuallyexclusiveexon2个外显互斥个外显互斥在同在同1个个成熟成熟mRNA只出现只出现1个。
个。
(4)内部剪接位点)内部剪接位点Internalsplicesite通过剪接供点或受点选择决定通过剪接供点或受点选择决定选择或剪切。
选择或剪切。
m7Gpppm7GpppintronexonexonAAAAAAP2596第6页,共167页。
7第7页,共167页。
2.可变剪接的调控机制可变剪接的调控机制SR蛋白家族的调控蛋白家族的调控n剪接体的形成与多种蛋白质和剪接体的形成与多种蛋白质和RNA复合体密切相关。
复合体密切相关。
在可变剪接上保守的在可变剪接上保守的SR磷蛋白家族因子的参与起重磷蛋白家族因子的参与起重要作用。
要作用。
nSR蛋白家族以不同的质的组成与量的差异选择特定的蛋白家族以不同的质的组成与量的差异选择特定的mRNA前体剪接位点,不同的前体剪接位点,不同的SR家族蛋白对适当的家族蛋白对适当的mRNA前体可以诱导出不同选择的剪接方式,在选择剪前体可以诱导出不同选择的剪接方式,在选择剪接上起决定作用。
接上起决定作用。
8第8页,共167页。
RNP的调节的调节nhnRNP-A1在不同组织中的含量变化很大,不参与组在不同组织中的含量变化很大,不参与组成性剪接。
在选择成性剪接。
在选择5和和3剪接点时具有可变剪接活性,剪接点时具有可变剪接活性,成为参与可变剪接的调节因子,在体内与成为参与可变剪接的调节因子,在体内与SR蛋白共同蛋白共同调节组织特异性的剪接。
调节组织特异性的剪接。
nU5hnRNP在酵母中参与在酵母中参与5剪接点突变的可变剪接。
剪接点突变的可变剪接。
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外显子限定模型外显子限定模型n真核细胞真核细胞mRNA前体中内含子远远大于外显子,前体中内含子远远大于外显子,5与与3剪接位点可以跨越数万个核苷酸准确地组合在剪剪接位点可以跨越数万个核苷酸准确地组合在剪接体中。
接体中。
n有证据表明,在前速激肽原有证据表明,在前速激肽原mRNA前体的可变剪接前体的可变剪接中,外显子下游的中,外显子下游的5剪接位点可影响其上游内含子剪接位点可影响其上游内含子3的剪接。
的剪接。
10第10页,共167页。
选择剪接对基因表达的调控作用(实例)选择剪接对基因表达的调控作用(实例)
(1)Bax基因转录产物的选择剪接基因转录产物的选择剪接Bax基因编码产物是与细胞凋亡有关的分子,(基因编码产物是与细胞凋亡有关的分子,(Bax/Bcl2调亡调亡)Bax编码产生的编码产生的Pr.有几种(有几种(、等),结构略有差异,等),结构略有差异,差异的产生来自差异的产生来自mRNA的选择性剪接。
的选择性剪接。
Bax保留全部(保留全部(6个)外显子个)外显子共共192个密码子个密码子译译出出192AA多肽多肽Bax保留全部外显子和第保留全部外显子和第5个内含子(含终止码)个内含子(含终止码)共共218个密码子。
个密码子。
Bax保留保留1、3、4、5、6外显子,删除第外显子,删除第2个外显子个外显子译出译出151AA多肽。
多肽。
11第11页,共167页。
(三)(三)RNA编辑编辑nRNA编辑(编辑(RNAediting)是在)是在RNA分子上出现的一分子上出现的一种修饰现象。
主要指种修饰现象。
主要指mRNA在转录后因插入、缺失在转录后因插入、缺失或核苷酸的替换,改变了或核苷酸的替换,改变了DNA模板来源的遗传信模板来源的遗传信息,从而翻译出氨基酸序列不同的多种蛋白质。
息,从而翻译出氨基酸序列不同的多种蛋白质。
nRNA编辑似乎是中心法则的例外。
编辑扩大了遗编辑似乎是中心法则的例外。
编辑扩大了遗传信息,也可能是生物适应的一种保护措施。
传信息,也可能是生物适应的一种保护措施。
P26014第14页,共167页。
1.核苷酸的替换核苷酸的替换U替换替换n最典型的例子是载脂蛋白最典型的例子是载脂蛋白B的的RNA编辑。
编辑。
U替换使替换使Apo-B100CAA编码的谷氨酰胺编码的谷氨酰胺突变为突变为UAA的终止密码子,产生编码的终止密码子,产生编码Apo-B48的的mRNA。
在蛋白质水平上只保留了。
在蛋白质水平上只保留了Apo-B100分子分子N端脂蛋白装配结构域,缺端脂蛋白装配结构域,缺少了少了C端低密度脂蛋白受体结合区。
端低密度脂蛋白受体结合区。
15第15页,共167页。
16第16页,共167页。
AI替换替换n在在珠蛋白、珠蛋白、c-Myc、成纤维细胞生长因、成纤维细胞生长因子基因中都有因子基因中都有因AI替换使互补链的替换使互补链的U被被RNA酶酶A水解的现象。
水解的现象。
17第17页,共167页。
2.可读框的改变可读框的改变n可读框的改变主要是核苷酸的插入或缺可读框的改变主要是核苷酸的插入或缺失。
失。
nG或或C的插入则往往是因为模板上连续几的插入则往往是因为模板上连续几个个C(或(或G)之后,互补链因一种滑动力)之后,互补链因一种滑动力而被添加到而被添加到RNA中。
中。
18第18页,共167页。
19第19页,共167页。
20第20页,共167页。
3.向导向导RNAn向导向导RNA(gRNA)是一种线粒体内转录)是一种线粒体内转录的短的短RNA(约(约5570核苷酸),能以正核苷酸),能以正常碱基配对或常碱基配对或GU配对的方式,选择其配对的方式,选择其5末端末端“锚区锚区”在在mRNA上的互补序列,上的互补序列,为随后插入或缺失为随后插入或缺失U提供模板。
提供模板。
21第21页,共167页。
22第22页,共167页。
23第23页,共167页。
(四)(四)mRNA运输的调控运输的调控mRNA运输是受控制的。
运输是受控制的。
1.3H-udR显示约显示约20%mRNA胞浆,核内胞浆,核内RNA约在约在1小时小时内降解成内降解成小片段小片段2.核孔核孔9nm,但可运输,但可运输9nm颗粒(如核糖体颗粒(如核糖体15nm,在核内,在核内组装组装入胞作用)入胞作用)用用20nm金颗粒(金颗粒(goldsphere)包装小)包装小RNA(如(如tRNA或或5sRNA)注射到蛙卵(注射到蛙卵(frogoocyte)可迅速可迅速过核孔到过核孔到胞浆。
但注射入浆胞浆。
但注射入浆则不能入核说明则不能入核说明mRNA主动运输入胞,但机制不清楚。
主动运输入胞,但机制不清楚。
P26124第24页,共167页。
n翻译起始的调控翻译起始的调控未受精卵:
隐蔽未受精卵:
隐蔽mRNA(maskedmRNA);受精:
;受精:
招募因子招募因子(recruitmentfactor),激活隐蔽,激活隐蔽mRNA阻遏蛋白的调控:
阻遏蛋白的调控:
铁结合调节蛋白铁结合调节蛋白(regulatoryiron-bindingprotein)翻译起始因子的调控:
翻译起始因子的调控:
eIF-2,血红素对珠蛋白,血红素对珠蛋白合成的调节合成的调节5AUG对翻译的调控作用:
减少正常对翻译的调控作用:
减少正常AUG启动启动翻译的作用,使翻译维持在较低水平翻译的作用,使翻译维持在较低水平mRNA5端非编码区长度对翻译的影响端非编码区长度对翻译的影响翻译水平的调控翻译水平的调控25第25页,共167页。
翻译水平的调控翻译水平的调控n原核生物原核生物mRNAmRNA的半衰期很短,在翻译水平的半衰期很短,在翻译水平上的调控对于基因表达的影响也很小。
上的调控对于基因表达的影响也很小。
mRNAmRNA的二级结构控制着翻译的起始,核糖的二级结构控制着翻译的起始,核糖体蛋白的自体控制对蛋白质的合成起抑制体蛋白的自体控制对蛋白质的合成起抑制作用。
作用。
n真核生物真核生物mRNAmRNA的半衰期比原核生物长的多,的半衰期比原核生物长的多,因此翻译过程受调控的机会也较多。
因此翻译过程受调控的机会也较多。
26第26页,共167页。
n翻译水平的调控是真核生物基因表达多翻译水平的调控是真核生物基因表达多级调控的重要环节之一。
真核生物翻译级调控的重要环节之一。
真核生物翻译水平调控最普遍的机制是起始因子的磷水平调控最普遍的机制是起始因子的磷酸化。
酸化。
n蛋白质合成装置各元件装配活力的改变蛋白质合成装置各元件装配活力的改变是导致蛋白质翻译速率变化的主要因素。
是导致蛋白质翻译速率变化的主要因素。
翻译的速度和细胞生长的速度是密切协翻译的速度和细胞生长的速度是密切协调的。
调的。
27第27页,共167页。
一、翻译因子磷酸化调控n蛋白质合成因子的磷酸化状态与其对蛋白质生物蛋白质合成因子的磷酸化状态与其对蛋白质生物合成的激活或抑制作用密切相关。
合成的激活或抑制作用密切相关。
n11eIF-4FeIF-4F通过亚单位的可逆磷酸化对蛋白质生物合通过亚单位的可逆磷酸化对蛋白质生物合成进行调控。
成进行调控。
eIF-4E(eIF-4E()和和eIF-4G(eIF-4G(/P220)/P220)亚基的亚基的磷酸化对蛋白质的生物合成有激活作用。
磷酸化对蛋白质的生物合成有激活作用。
28第28页,共167页。
29第29页,共167页。
22其他因子磷酸化对翻译的激活作用其他因子磷酸化对翻译的激活作用neIF-4BeIF-4B在促有丝分裂剂作用下,随在促有丝分裂剂作用下,随eIF-4FeIF-4F和核糖体和核糖体蛋白蛋白S6S6一起,在细胞内被磷酸化,激活起始因子一起,在细胞内被磷酸化,激活起始因子eIF-4AeIF-4A和和eIf-4BeIf-4B的活性。
的活性。
33eIF-2eIF-2的磷酸化对翻译的抑制作用的磷酸化对翻译的抑制作用neIF-2eIF-2亚基的磷酸化会导致亚基的磷酸化会导致eIF-2eIF-2与与eIF-2BeIF-2B紧密结紧密结合,直接影响了合,直接影响了eIF-2eIF-2的再利用,引起翻译起始作用的再利用,引起翻译起始作用受阻,从而抑制蛋白质的生物合成。
受阻,从而抑制蛋白质的生物合成。
30第30页,共167页。
阻遏阻遏Pr.的调控作用的调控作用进入胞浆并非所有的进入胞浆并非所有的mRNA分子分子立即与核糖体结合立即与核糖体结合翻译成翻译成Pr.一些特定的翻译抑制一些特定的翻译抑制Pr.可结合到可结合到mRNA5,抑制翻译。
抑制翻译。
如:
如:
铁铁Pr.(ferritin)mRNA5端非编码区约端非编码区约30个核甘酸序个核甘酸序列称为铁反应元件(列称为铁反应元件(iron-responseelement)可折叠成可折叠成1个茎环(发夹结构)个茎环(发夹结构)可结合可结合1个铁结合调节蛋白个铁结合调节蛋白(regulatoryiron-bindingpro)。
)。
31第31页,共167页。
33
(1)有铁)有铁不抑制,快译运输工具。
不抑制,快译运输工具。
(2)无铁结合可运)无铁结合可运铁结合铁结合Pr.结合结合mRNA抑制翻译。
抑制翻译。
铁结合调节蛋白铁结合调节蛋白32第32页,共167页。
Met40S60S60SmRNAeIF-2B、eIF-3、eIF-6elF-3ATPADP+PielF4E,elF4G,elF4A,elF4B,PABMetMet-tRNAiMetelF-2GTP真核生物肽链合真核生物肽链合成起始过程成起始过程60S60S40SMetGDP+Pi各种各种elF释放释放elF-5MetMet80S起始起始复合物复合物33第33页,共167页。
34第34页,共167页。
35第35页,共167页。
翻译起始因子翻译起始因子(eIF2)的调控的调控36第36页,共167页。
(2)
(2)翻译起始因子调节蛋白质合成的速度翻译起始因子调节蛋白质合成的速度无活无活性的性的elF-2elF-2elF-2elF-2有活性的有活性的elF-2elF-2PPPPP37第37页,共167页。
5-AuG对翻译的调控作用对翻译的调控作用
(1)按)按Pr.生物合成模型,生物合成模型,90%真核真核mRNA符合第符合第1AUG规律规律译出正常译出正常Pr.
(2)5AUG可以减少正常可以减少正常AUG翻译起始作用翻译起始作用使翻译维持使翻译维持在较低水平。
原癌基因中是控制原癌基因表达的重要因素在较低水平。
原癌基因中是控制原癌基因表达的重要因素缺失缺失导致某些原癌基因翻译激活。
导致某些原癌基因翻译激活。
5-AUG(1个或数个个或数个)第第1-AUG非编码区非非编码区非正常开放阅正常开放阅读框读框编码区正常编码区正常开放阅读框开放阅读框53mRNA38第38页,共167页。
nmRNA稳定性调节稳定性调节3端非编码区结构影响其稳定性:
端非编码区结构影响其稳定性:
3端富含端富含A和和U的结构,引起的结构,引起mRNA不稳定不稳定蚕蛹羽化成蛾后,需大量蛋白水解酶溶解蚕蚕蛹羽化成蛾后,需大量蛋白水解酶溶解蚕丝蛋白,丝蛋白,mRNA半衰期达半衰期达100小时,其他仅小时,其他仅2.5小时小时翻译水平的调控翻译水平的调控39第39页,共167页。
mRNA降解的机制降解的机制40第40页,共167页。
小分子小分子RNA(lin-4)对翻译水平影响)对翻译水平影响Lin-14核核Pr.调控生长发育的时间选择调控生长发育的时间选择Lin-4产生产生2个小分子个小分子RNA:
1个长度个长度22个核苷酸,另个核苷酸,另1个在个在3端延长至端延长至40个核苷酸个核苷酸Lin-4RNA结合结合Lin14mRNA3UTR中的特异顺序中的特异顺序去掉去掉这种顺序这种顺序mRNA就不会被抑制翻译。
就不会被抑制翻译。
n小分子小分子RNA对翻译水平的影响对翻译水平的影响41第41页,共167页。
n新生肽链的水解:
酶解新生肽链的水解:
酶解肽链肽链N端的第一个氨基酸:
稳定化氨基酸(端的第一个氨基酸:
稳定化氨基酸(Met、Ser、Thr、Ala、Val、Cys、Gly、Pro)与去)与去稳定氨基酸稳定氨基酸n肽链中氨基酸的共价修饰:
磷酸化、甲基化、酰基化肽链中氨基酸的共价修饰:
磷酸化、甲基化、酰基化n通过信号肽通过信号肽(signalpeptide)分拣、运输、定位分拣、运输、定位翻译后水平的调控翻译后水平的调控42第42页,共167页。
蛋白质合成后的靶向输送(蛋白质合成后的靶向输送(proteintargeting)n蛋白质合成后的去向蛋白质合成后的去向留在胞浆留在胞浆进入核、线粒体或其它细胞器进入核、线粒体或其它细胞器分泌至体液,输送至靶器官分泌至体液,输送至靶器官n靶向输送靶向输送-蛋白质合成后,定向地到达其执行蛋白质合成后,定向地到达其执行功能的目标地点功能的目标地点43第43页,共167页。
n分泌性蛋白质分泌性蛋白质(secretoryproteins)穿过合成所在的细胞到其它组织细胞去的蛋白质穿过合成所在的细胞到其它组织细胞去的蛋白质n信号肽信号肽(signalpeptide)N-端的一段疏水氨基酸端的一段疏水氨基酸1040个氨基酸个氨基酸把合成的蛋白质移向胞膜并与胞膜结合,然后把把合成的蛋白质移向胞膜并与胞膜结合,然后把合成的蛋白质送出胞外合成的蛋白质送出胞外N-N端碱性端碱性疏水核心区疏水核心区加工区加工区-C碱性氨基酸碱性氨基酸极性和小极性和小侧链氨基酸侧链氨基酸分泌蛋白分泌蛋白44第44页,共167页。
信号肽信号肽识别颗识别颗粒粒信号肽信号肽(signalpeptide)46第46页,共167页。
外膜外膜转运转运体体内膜内膜转运转运体体线粒体蛋白的靶向输送线粒体蛋白的靶向输送47第47页,共167页。
细胞核蛋白的靶向输送细胞核蛋白的靶向输送48第48页,共167页。
分子生物学分子生物学MolecularBiology核酸的分子杂交核酸的分子杂交NucleicAcidHybridizationDepartmentofbiochemistryandmolecularbiology49第49页,共167页。
碱基核苷核苷酸RNA腺嘌呤(腺嘌呤(A)腺苷腺苷腺苷酸腺苷酸(AMP)鸟嘌呤(鸟嘌呤(G)鸟苷鸟苷鸟苷酸鸟苷酸(GMP)胞嘧啶(胞嘧啶(C)胞苷胞苷胞苷酸胞苷酸(CMP)尿嘧啶(尿嘧啶(U)尿苷尿苷尿苷酸尿苷酸(UMP)DNA腺嘌呤(腺嘌呤(A)脱氧腺苷脱氧腺苷脱氧腺苷酸脱氧腺苷酸(dAMP)鸟嘌呤(鸟嘌呤(G)脱氧鸟苷脱氧鸟苷脱氧鸟苷酸脱氧鸟苷酸(dGMP)胞嘧啶(胞嘧啶(C)脱氧胞苷脱氧胞苷脱氧胞苷酸脱氧胞苷酸(dCMP)胸腺嘧啶(胸腺嘧啶(T)脱氧胸苷脱氧胸苷脱氧胸苷酸脱氧胸苷酸(dTMP)DNA和和RNA的碱基的碱基核苷和相应的核苷酸核苷和相应的核苷酸50第50页,共167页。
核苷酸之间连接核苷酸之间连接51第51页,共167页。
DDNNAA双双螺螺旋旋结结构构52第52页,共167页。
BasepairingoccursinduplexDNAandalsoinintra-andinter-molecularinteractionsinsingle-strandedRNA(orDNA).53第53页,共167页。
ContentofTable一、一、核酸分子杂交技术的原理核酸分子杂交技术的原理二、二、核酸探针的制备核酸探针的制备三、三、核酸探针的标记核酸探针的标记四、四、核酸分子杂交技术核酸分子杂交技术五、五、DNA芯片技术芯片技术54第54页,共167页。
一、核酸分子杂交技术的原理一、核酸分子杂交技术的原理有互补特定核苷酸序列的单链有互补特定核苷酸序列的单链DNA或或RNA混在一起混在一起时,其相应同源区段将会退火形成双链结构。
时,其相应同源区段将会退火形成双链结构。
如把一段已知基因(如把一段已知基因(DNA或或RNA)的核酸序列用合适)的核酸序列用合适的标记物(如放射性同位素、生物素等)予以标记,当的标记物(如放射性同位素、生物素等)予以标记,当作探针(作探针(probe),与变性后的单链基因组与变性后的单链基因组DNA或或RNA等等进行杂交。
进行杂交。
用合适方法(如放射自显影或免疫组织化学等技用合适方法(如放射自显影或免疫组织化学等技术)把标记物检测出来,就可确定靶核苷酸序列的拷术)把标记物检测出来,就可确定靶核苷酸序列的拷贝数及表达丰度等。
贝数及表达丰度等。
55第55页,共167页。
56第56页,共167页。
57第57页,共167页。
nDNADNA变性变性是指核酸双螺旋碱基对的氢键断裂,双链变成单链,从而使核酸的天然构象和性质发生改变。
变性时维持双螺旋稳定性的氢键断裂,碱基间的堆积力遭到破坏,但不涉及到其一级结构的改变。
n凡能破坏双螺旋稳定性的因素,如加热、极端的pH、有机试剂甲醇、乙醇、尿素及甲酰胺等,均可引起核酸分子变性。
58第58页,共167页。
n溶液粘度降低。
DNA双螺旋是紧密的刚性结构,变性后代之以柔软而松散的无规则单股线性结构,DNA粘度因此而明显下降。
n溶液旋光性发生改变。
变性后整个DNA分子的对称性及分子局部的构性改变,使DNA溶液的旋光性发生变化。
n增色效应。
指变性后DNA溶液的紫外吸收作用增强的效应。
在DNA双螺旋结构中碱基藏入内侧,变性时DNA双螺旋解开,于是碱基外露,碱基中电子的相互作用更有利于紫外吸收,故而产生增色效应。
59第59页,共167页。
n复性指变性DNA在适当条件下,二条互补链全部或部分恢复到天然双螺旋结构的现象,它是变性的一种逆转过程。
热变性DNA一般经缓慢冷却后即可复性,此过程称之为退火(annealing)。
这一术语也用以描述杂交核酸分子的形成。
DNA的复性不仅受温度影响,还受DNA自身特性等其它因素的影响。
60第60页,共167页。
应应用:
用:
1)检测特定生物有机体之间是否存在亲缘)检测特定生物有机体之间是否存在亲缘关系;关系;2)用来揭示核酸片段中某一特定基因的)用来揭示核酸片段中某一特定基因的存在与否、拷贝数及表达丰度。
存在与否、拷贝数及表达丰度。
61第61页,共167页。
影响杂交的因素影响杂交的因素n核酸分子的浓度和长度核酸分子的浓度和长度n温度温度n离子强度离子强度n杂交液中的甲酰胺杂交液中的甲酰胺n核酸分子的复杂性核酸分子的复杂性n非特异性杂交反应非特异性杂交反应62第62页,共167页。
1、核酸分子的浓度和长度:
、核酸分子的浓度和长度:
浓度越大,复性速度越快浓度越大,复性速度越快分子越大,复性速度越慢分子越大,复性速度越慢单链探针,浓度增加,杂交效率增加单链探针,浓度增加,杂交效率增加双链探针,浓度控制在双链探针,浓度控制在0.10.5g,浓度,浓度过高影响杂交效率过高影响杂交效率63第63页,共167页。
2、温度:
、温度:
(1)DNA/DNA杂交,适宜温度较杂交,适宜温度较Tm值低值低2025
(2)RNA/DNA或或RNA/RNA杂交,加甲酰胺杂交,加甲酰胺降低降低Tm值值(3)用寡核苷酸探针杂交,适宜温度较)用寡核苷酸探针杂交,适宜温度较Tm值低值低564第64页,共167页。
3、离子强度:
、离子强度:
(1)低盐浓度时杂交率较低,随着盐浓度增加,)低盐浓度时杂交率较低,随着盐浓度增加,杂交率增加杂交率增加
(2)高浓度的盐使碱基错配的杂交体更稳定,)高浓度的盐使碱基错配的杂交体更稳定,当进行序列不完全同源的核酸分子杂交时,必须当进行序列不完全同源的核酸分子杂交时,必须维持杂交反应液中较高的盐浓度和洗膜溶液的盐维持杂交反应液中较高的盐浓度和洗膜溶液的盐浓度浓度65第65页,共167页。
4、甲酰胺:
、甲酰胺:
(1)甲酰胺能降低核酸杂交的)甲酰胺能降低核酸杂交的Tm值,能降低杂交值,能降低杂交液的温度,低温时探针与待测核酸杂交更稳定,当待液的温度,低温时探针与待测核酸杂交更稳定,当待测核酸与探针同源性不高时,加测核酸与探针同源性不高时,加50%甲酰胺溶液在甲酰胺溶液在3542杂交杂交
(2)如待测核酸序列与探针同源性高时,则用)如待测核酸序列与探针同源性高时,则用水溶液在水溶液在68杂交杂交66第66页,共167页。
5、核酸分子的复杂性:
、核酸分子的复杂性:
(1)核酸的复杂性是指存在于反应体系中不同)核酸的复杂性是指存在于反应体系中不同顺序的总长度顺序的总长度
(2)Cot与反应体系中核酸复杂性成正比与反应体系中核酸复杂性成正比(3)两个)两个DNA样品浓度绝对一致时,变性后的相样品浓度绝对一致时,变性后的相对杂交率取决于对杂交率取决于DNA的相对复杂性的相对复杂性67第67页,共
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