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水母发光蛋白的发现及早期应用
水母发光蛋白的发现及早期应用
广西植物Guihaia294:
537-5402009年7月
重组水母发光蛋白及其在植物
钙离子信号检测中的应用
12
郝小花,张国增
1.湖南文理学院生命科学系,湖南常德415000;2.河南大学生命科学院,河南开封475000
摘要:
重组水母发光蛋白作为检测植物细胞钙信号的手段是近十几年发展起来的新方法,该文介绍了重组
2+2+2+
水母发光蛋白作为Ca检测探针的发展过程、测钙原理、Ca浓度检测方法、Ca浓度换算方法、优点与不
足、及在植物细胞钙离子信号检测中的研究进展。
并利用国外实验室提供的方法在国内首次得出冷激条件下
2+2+
植物细胞内细胞质中[Ca]和液泡膜附近[Ca]钙离子浓度动力学变化曲线。
cytmd
2+
关键词:
重组水母发光蛋白;钙浓度换算;[Ca];钙信号
cyt
中图分类号:
Q945,Q943文献标识码:
A文章编号:
10002314220090420537204
3
Recombinantaequorinluminousproteinandits
applicationinmeasuringcalciumsignalofplantcell
12
HAOXiao2Hua,ZHANGGuo2Zeng
1.DepartmentofLifeSciences,HunanArtandScienceCollege,Changde415000,China;
2.DepartmentofLifeSciences,HenanUniversity,Kaifeng475000,China
Abstract:
Recently,theapplicationofrecombinantaequorinluminousproteinhasappearedinmeasuringcalciumsignal
ofplantcellasanewmethod.Thispaperintroducedmainlythedevelopmentoftherecombinantaequorinluminous
proteinasaprobe,theprincipleandoperatesmethodofmeasuringcalciumconcentration,andhowtoconversionthe
calciumconcentration.Itsummarizedtheadvantagesanddeficienciesoftheprotein,andcollectedmainlytheprogress
indevelopmentstudiesinmeasuringcalciumsignalofplantcell.Meanwhile,usingthemethodprovidedbyotherla2
2+2+
boratory,theauthorsgotthecoldshockkineticsof[Ca]cytand[Ca]mdforthefirsttime.
2+
Keywords:
recombinantaequorinluminousprotein;conversiontothecalciumconcentration;[Ca]cyt;calciumsignal
2+
Ca作为普遍的第二信使在细胞信号转导过众多令人瞩目的成果。
在钙离子信号研究过程中,
程中起着非常重要的作用孙大业等,2001;常芳等,水母发光蛋白得到了广泛的应用,迅速地使钙离子
2+
2005,而人们对Ca在信号转导中作用的认识,则信号传导网络的研究打开了新的局面。
2+
很大程度上取决于[Ca]cyt测定技术的发展郭?
等,2003。
最近十几年来出现的新型探针有Ae2
1水母发光蛋白的发现及早期应用
quorin水母发光蛋白,yellowcameleon2.1等
Sanders等,1999。
而Aequorin发展最快也最受Shimomura等1962首先从维多利亚多管水
人们的关注。
Aequorin作为检测钙离子新型探针母Aequoreavictoria中分离出一种蛋白aequor2
2+
的使用,极大地推动了人们对Ca在细胞信号转导in,该蛋白在无氧情况下可以发射出波长为469
过程中作用的认识进程。
十几年来,国内外取得了nm的蓝色光。
与荧光素酶不同的是,该蛋白发光
3收稿日期:
2008203224修回日期:
2008209217
基金项目:
湖南省自然科学基金06JJ50042[SupportedbytheNaturalScienceFoundationofHunanProvince06JJ50042]
作者简介:
郝小花19792,女,河南巩义人,硕士,主要研究方向为植物生理与分子生物学,E2mailyybxiaohua@163.com。
原平皓生物
yph-biocom
原平皓生物
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原平皓生物
yph-biocom538广西植物29卷
时不需要低分子量的有机物质做为底物或者辅助因水母发光蛋白可以重组成有生物活性的水母发光蛋
子,所以当时被称为光蛋白photoprotein。
后来的白,此次发现为水母发光蛋白的广泛应用打下了坚
研究发现光蛋白是由约22KD的脱辅基水母发光实的基础。
蛋白apoaequorin、氧分子和辅基腔肠荧光素co2由此,水母发光蛋白在多种细胞类型哺乳动物
elenterazine三部分形成的复合物。
其中脱辅基水细胞、植物、酵母等中得到表达,产生脱辅基水母发
2+
母发光蛋白由189个氨基酸组成,具有3个Ca结光蛋白Inouye等,1986;Rizzuto等,1992。
检测
2+
合的EFhand结构。
腔肠荧光素coelenterazine细胞内Ca浓度变化时,将腔肠素加入到细胞溶液
是一个分子量约400Da的疏水基团,它可以自由穿后,腔肠素自由穿过细胞膜进入细胞与细胞内翻译、
2+
越细胞膜。
当3个Ca与水母发光蛋白结合后,引表达的脱辅基水母发光蛋白组合,形成功能性的水
起脱辅基水母发光蛋白和腔肠荧光素之间的共价键母发光蛋白,上述过程称为重组recombinant。
水
破裂,腔肠荧光素被氧化为coelenteramide,并释放母发光蛋白和腔肠素重组后就可以检测不同刺激条
2+
件下细胞中Ca浓度的瞬时变化。
出CO2和一个质子,同时放出波长为469nm的蓝
μ
色光。
即:
Knight等1993用体内重组实验证明2mol/L
的腔肠素黑暗过夜处理烟草和没处理的烟草相比腔
肠素对烟草不产生毒性。
而且不断的研究发现,水
母发光蛋白能忍受一定范围高、低温的刺激,44℃
时水母发光蛋白仍保持稳定状态,但是50℃约
Charbonneau等,1985。
44%的水母发光蛋白被破坏;0℃的低温不影响水
此发射光可以通过生物发光仪来进行检测,反
母发光蛋白的生物活性。
异博定、La、Ga、EGTA、
2+2+
应的速度取决于Ca的浓度。
当Ca的浓度足够
TEA的处理对于拟南芥也不会造成伤害Knight
μ
高时大于100mol/L,反应速度达到最快,所有
等,1997。
的水母发光蛋白都发生反应并释放出质子,同时发
此后,人们相继应用水母发光蛋白这一测钙手
2+
出波长为469nm的蓝色光。
当Ca浓度较低时,
段测定了拟南芥烟草大豆等多种植物细胞在感受外
则仅有部分水母发光蛋白发生反应。
界不同的刺激过程中细胞质内的钙信号情况。
研究
此外,水母发光蛋白不能渗透通过完整细胞的
表明,机械或吹拂、激烈摇晃、震动触摸、低渗胁
细胞膜,因此早期实验中所用的水母发光蛋白是从
迫、冷热冲击、有氧和无氧胁迫、盐渍和干旱都可导
2+
水母中提取出来,通过显微注射的方法将水母发光
致[Ca]cyt水平快速而短暂的变化。
变化的持续时
2+
2+
蛋白注射到细胞内,用来监测细胞内Ca的动态平
间对每种信息而言是特有的,不同的[Ca]cyt变化
衡Shimomura,1997。
1967年Ridgway&Ash2
引发不同的生理反应。
从而确立了水母发光蛋白在
ley1967就首次将纯化的水母发光蛋白显微注射
检测植物细胞钙信号中的地位。
到动物细胞中,并检测到了肌纤维细胞中钙信号的
瞬时变化。
但该方法对实验技术要求较高,因此限
3钙离子浓度的换算
制了水母发光蛋白的应用。
在此后20年间,其应用
2+
仅限于从水母中提取、纯化发光蛋白,并显微注射到
水母发光蛋白一旦和Ca反应即丧失发光功
2+
细胞内用以研究感兴趣的钙信号。
能,因此当一部分水母发光蛋白与Ca反应时,被
2+
消耗水母发光蛋白的发光强度能反映出Ca浓度
2水母发光蛋白的cDNA克隆及
变化,而且被消耗的水母发光蛋白的发光强度与
2+
Ca浓度之间存在一种线形关系Knight等,
体外表达
1997。
因此通过生物发光仪检测水母发光蛋白发
2+
1985年,Prasher等1985从维多利亚多管水
光强度就可以换算出Ca的相对浓度Cobbold&
母中克隆并分离出了脱辅基水母发光蛋白的cD2Rink,1987。
换算公式为:
pCa0.332588-logk
NA,并将其在大肠杆菌中表达,再孵育可自由穿越+5.5593
细胞膜的辅基腔肠荧光素后,腔肠荧光素和脱辅基K是一个常量,即每秒种记录的发光总和
原平皓生物
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原平皓生物
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原平皓生物
yph-biocom4期郝小花等:
重组水母发光蛋白及其在植物钙离子信号检测中的应用539
2+
Knight等,1991。
由此,人们可以得到直观的相
水母发光蛋白还能用来连续几周测定[Ca]cyt
2+
对钙离子浓度,单位为微摩尔μmol/L。
生物发光
的变化。
比如,查到在白光和红光下[Ca]cyt的节
2+
仪的检测一般可设定为每秒记录5次,按照预测的
奏性震荡,在黑暗下消失;相反,叶绿体中Ca的节
细胞反应时间,记录相应的时长,得到原始数据。
目
奏性震荡却始于黑暗开始时。
细胞内两个不同部分
2+
前,国内已有计算机专业人员将此计算方法编写程
[Ca]的差别可能是形成光周期机理的基础。
此
2+
序可对输出的大量原始数据进行快速的批量处理。
外,利用水母发光蛋检测Ca浓度变化可在整体水
平进行,也可在任何类型的细胞中进行。
4细胞内定位表达及新应用
作为一个蛋白质,加上特异性的靶序列后,这种
重组蛋白可以精确地在细胞内定位,这是人们对水
母发光蛋白感兴趣的另一个重要原因Haley等,
1995。
用这种方法,可将水母发光蛋白定位于细胞
2+
内不同部位,成为研究Ca信号时空复杂性的新
工具。
Knight等1991构建了表达脱辅基水母发光
蛋白定位于细胞质的质粒pMAQ。
并得到了转化
图1冷激条件下,细胞质CYT中、液泡膜附近MD钙
的烟草Nicotianaplumbaginifolia植株,利用转
离子浓度变化动力学曲线每个结果重复5次以上
2+2+
Fig.1[Ca]cytand[Ca]mdColdShockKinetics
基因植物报告了触摸、冷休克和真菌激发子等因子
2+
Tracesareaveragesoffiveindividualseedlings
刺激时细胞质中Ca浓度的变化。
而且该实验也
μ
证明2mol/L的腔肠荧光素过夜处理烟草,对烟
2000年,Knight利用水母发光蛋白的细胞内特
草也不会产生毒性。
异表达载体Kiegle等,2000转化拟南芥,从而得到
1996年,Knight等1996又构建了表达脱辅基
在拟南芥根的表皮、表皮和皮层伸长区、内皮、中柱
水母发光蛋白定位于液泡的细胞质面的质粒
鞘等部位定位表达脱辅基水母发光蛋白的植株,在
HVA122.2,并检测得到了冷刺激下细胞质中钙离
一定的刺激条件下,得到不同的钙离子浓度变化的
子浓度的变化,得到了液泡膜附近钙离子浓度变化动力学曲线,证实对于一定的刺激,不同类型的细胞
的动力学曲线。
反应也不同。
本文利用HeatherKnight教授提供的载体,通
水母发光蛋白除在检测植物细胞内钙离子浓度
过Floraldip法转化拟南芥Arabidopsisthaliana
方面有很大的应用和发展之外,在其它方面的应用
野生型Columbiacol20,获得在细胞质中和液泡膜
也十分广阔。
以前因为技术困难,很少有人注意植
附近特异表达脱辅基水母发光蛋白的植株。
参照文
物细胞信号传导过程中线粒体钙离子的作用。
2003
献提供的方法Cobbold&Rink等,1987;Knight
年,David等2003通过能稳定表达水母发光蛋白
等,1996,得到了冷刺激coldshock下细胞质和液的拟南芥,并定点到线粒体中以用于研究分析植物
2+
泡膜附近钙离子浓度变化的动力学曲线图1此
线粒体中钙离子变化和揭示[Ca]m的独立调节。
实验在河南大学植物逆境生物学实验室完成。
同样,钙离子信号途径在丝状真菌中的情况了解得
水母发光蛋白能进行选择性的定位,因此该方
非常少。
2004年,Nelson发展了一种基于重组水母
2+2+
法明显优于利用Ca荧光染料的方法标定Ca浓
发光蛋白的方法来进行此研究Nelson&Kozlova,
度。
目前水母发光蛋白已被成功定位于细胞核
2004。
通过密码子优化,已得到高水平表达水母蛋
Pouly等,2001、叶绿体Sai&Johnson,2002、细
白的Neurosporacrassa,Aspergillusniger和As2
胞外基质Gao等,2004及植物液泡的细胞质面pergillusawamori菌株。
Knight等,1996。
并已得到转化植株。
通过对这
2007年,舒柏华等2007利用水母发光蛋白生
些转化植株的研究,证实细胞器能和特异的
物发光分析技术建立了一种PCR产物定量检测技
2+
[Ca]cyt信号结合。
术。
实验证实,该定量检测技术是一种灵敏的、可靠
原平皓生物
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原平皓生物
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原平皓生物
yph-biocom540广西植物29卷
2+
的、非放射性的基因微量定量方法。
Ca浓度应用范围和测量准确度。
但实际上,半合
成的水母发光蛋白缺少稳定性且量子产率明显低于
天然的水母发光蛋白,因此限制了其应用Shimo2
5优缺点及展望
mura等,1993;Montero等,1997。
对于植物细胞而言,叶绿体有自发的荧光,同时通过水母发光蛋白基因与细胞特定区域定位信
植物体内也存在其它微弱荧光。
但这两种荧光的强号构建的重组基因和在植物体内重组表达,使该技
度与植物体内重组的水母发光蛋白的发光强度相比术既能检测细胞质内钙离子的变化,又能准确定位
2+
非常微弱,对于应用水母发光蛋白检测细胞内Ca到大多数的亚细胞结构等细胞器,进而检测这些细
浓度的变化不会产生太大干扰Knight等,1993。
胞器中的钙离子变化。
这对植物细胞钙信号的局部
将水母发光蛋白转入到植物中,获得细胞内稳定表与整体变化的研究无疑是一个推动,大大促进了植
达水母发光蛋白的转基因植物,可以在整体水平上物细胞钙信号的研究进程。
在其它方面,如舒柏华
2+
简便而快速地测定细胞内Ca浓度的瞬间变化。
等利用水母发光蛋白与PCR相结合,建立的PCR
避免了以原生质体为材料的诸多不便,同时也使实产物定量检测技术就是在新领域的新发展。
但一段
验得以在更接近自然状态的情况下进行。
时间内,水母发光蛋白还需一定的改进和完善。
重组水母发光蛋白之所以在测定植物细胞钙信
参考文献:
号中得到广泛应用,主要是因该方法有以下优点:
孙大业,郭艳林,马力耕,等.2001.细胞信号转导[M].第3
1对细胞无伤害,不影响其正常的生长发育;2不
版.北京:
科学出版社,211
外泌,不在细胞内区室化或凝集,能在较长时间内检
ChangF常芳,CuiSJ崔素娟2005.Recombinantluminouspro2
测钙离子信号;3不需激发光源,因而消除了细胞teinanditsapplicationinmeasuringcalciumsignalofplantcell重
组发光蛋白及其在植物细胞钙信号检测中的应用[J].Plant
自发荧光的干扰;4加信号肽后能准确定位。
因
PhysiolCommun植物生理学通讯,411:
77-83
此,在钙离子信号研究过程中,水母发光蛋白迅速得
CharbonneauH,WalshKA,McCannRO,etal.1985.Aminoacid
到广泛应用,并极大地推进了钙离子信号研究进程。
sequenceofthecalcium2dependentphotoproteinaequorin[J].
Biochemistry,24:
6762-6771
在试验过程中,也存在一些问题,虽然水母发光
CobboldPH,RinkTJ1987.Fluorescenceandbioluminescence
蛋白可以在植物体内广泛或选择性表达,但腔肠荧
measurementofcytoplasticfreecalcium[J].BiochemJ,248:
313
光素的过膜渗透可能不太理想。
腔肠荧光素可能很
-328
2+
难进入深层组织细胞,对Ca浓度的检测可能存在DavidC.Logan,MarcR.Knight.2003.Mitochondrialandcy2
tosoliccalciumdynamicsaredifferentiallyregulatedinplants[J].
一些影响。
同时,由于细胞壁的物质障碍,使得植物
PlantPhysiol,133:
21-24
表层2~3层以下细胞发出的荧光无法测量,发光读
GaoDJ,KnightMR,TrewavasAJ2004.Self2reportingArabi2
2+
数主要来自于表层细胞Rizzuto等,1992。
因此,
dopsisexpressingpHandCaindicatorsunveiliondynamicsin
thecytoplasmandintheapoplastunderabioticstress[J].Plant
也有研究者利用悬浮培养的细胞进行试验,并证明
Physiol,34:
898-908
螯合细胞外的钙离子可以诱发细胞内钙库钙离子的
GuoW郭?
RenZY任兆玉,HouX侯洵2003.Fluores2
释放Stephen等,2001。
同时,aequorin也还存在
cencemethodsforanalyzingintracellularsecondmessenger2calci2
其它的一些不足:
1需预先与发光辅基进行重组;umion细胞内第二信使?
?
?
钙离子荧光测定方法的研究进
展[J].LaserJ激光杂志,241:
1-5
2测钙过程中发光辅基为不可逆消耗;3产生的
HaleyA,RussellAJ,WoodN,etal.1995.Effectsofmechaniscal
光信号较弱需要用高灵敏度的生物发光仪检测;4
signalingonplantcellcytosoliccalcium[J].ProceedingsNa2
不适用于单个细胞中钙信号的研究。
tionalAcademySci,USA,92:
4124-4128
InouyeS,SakakiY,GotoT,etal.1986.Expressionofapoaequor2
对于辅基腔肠素来说,目前除了标准的腔肠荧
incomplementaryDNAinEscherichiacoli[J].Biochemistry,
光素外,还合成了几种腔肠荧光素的类似物:
h2co2
25:
8425-8429
elenterazine、ip2coelenterazine、coelenterazine18及
KiegleE,MooreCA,HaseloffJ,etal.2000.Cell2type2specificcal2
e2coelenterazineKnight等,1991。
这些腔肠荧光ciumresponsestodrought,saltandcoldintheArabidopsisroot
[J].PlantJ,23:
267-278
素类似物重组的半合成水母发光蛋白具有不同的光
KnightH,TrewavasAJ,KnightMR.1996.Coldcalciumsignal2
2+
发射特征和Ca敏感
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