动物肝脏中DNA的提取及检测实验报告.docx

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动物肝脏中DNA的提取及检测实验报告

动物肝脏中DNA的提取及检测

一、前言

脱氧核糖核酸

脱氧核糖核酸〔DNA，为英文Deoxyribonucleic acid的缩写〕，又称去氧核糖核酸，是脱氧核糖核酸染色体的主要化学成分，同时也是组成基因的材料。

有时也被称为“遗传微粒〞，原因是在繁殖过程中，父代会把它们自己DNA的一局部复制传递到子代中，从而完成性状的传播。

DNA是高分子聚合物，DNA溶液为高分子溶液，具有很高的粘度，可被甲基绿染成绿色。

DNA对紫外线〔260nm〕有吸收作用，利用这一特性，可以对DNA进行含量测定。

当核酸变性时，吸光度升高，称为增色效应；当变性核酸重新复性时，吸光度又会恢复到原来的水平。

较高温度、有机溶剂、酸碱试剂、尿素、酰胺等都可以引起DNA分子变性，即DNA双链碱基间的氢键断裂，双螺旋结构解开—也称为DNA的解螺旋。

在细胞内，DNA能与蛋白质结合形成染色体，整组染色体那么统称为染色体组。

对于人类而言，正常的体细中含有46条染色体。

染色体在细胞分裂之前会先在分裂间期完成复制，细胞分裂间期又可划分为：

G1期-DNA合成前期、S期-DNA合成期、G2-DNA合成后期。

对于真核生物，如动物、植物及真菌而言，染色体主要存在于细胞核内；而对于原核生物，如细菌而言，那么主要存在于细胞质中的拟核内。

染色体上的染色质蛋白，如组织蛋白，能够将DNA进行组织并压缩，以帮助DNA与其他蛋白质进行交互作用，进而调节基因的转录。

脱氧核糖核酸的结构

DNA的结构：

DNA的结构一般可划分为一级结构、二级结构、三级结构和四级结构四个水平。

DNA是一种长链聚合物，组成单位为四种脱氧核苷酸，即腺嘌呤脱氧核苷酸〔dAMP脱氧腺苷〕、胸腺嘧啶脱氧核苷酸〔dTMP脱氧胸苷〕、胞嘧啶脱氧核苷酸〔dCMP脱氧胞苷〕、鸟嘌呤脱氧核苷酸〔dGMP脱氧鸟苷〕。

而脱氧核糖〔五碳糖〕与磷酸分子借由酯键相连，组成其长链骨架，排列在外侧，四种碱基排列在内侧。

每个糖分子都与四种碱基里的其中一种相连，这些碱基沿着DNA长链所排列而成的序列，可组成遗传密码，指导蛋白质的合成。

读取密码的过程称为转录，是以DNA双链中的一条单链为模板转录出一段称为mRNA〔信使RNA〕的核酸分子。

DNA是由许多脱氧核苷酸按一定碱基顺序彼此用3’，5’-磷酸二酯键相连构成的长链。

大多数DNA含有两条这样的长链，也有的DNA为单链，如大肠杆菌噬菌体φX174、G4、M13等。

DNA有环形DNA和链状DNA之分。

在某些类型的DNA中，5-甲基胞嘧啶可在一定限度内取代胞嘧啶，其中小麦胚DNA的5-甲基胞嘧啶特别丰富。

在某些噬菌体中，5-羟甲基胞嘧啶取代了胞嘧啶。

40年代后期，查加夫〔E.Chargaff〕发现不同物种DNA的碱基组成不同，但其中的腺嘌呤数等于其胸腺嘧啶数〔A=T〕，鸟嘌呤数等于胞嘧啶数〔G=C〕，因而嘌呤数之和等于嘧啶数之和，一般用几个层次描绘DNA的结构。

浓盐法从动物组织中提取DNA

核酸和蛋白质在生物体中常以核蛋白〔DNP/RNP〕的形式存在，其中DNP能溶于水及高浓度盐溶液，但在0.14M的盐溶液中溶解度很低，而RNP那么可溶于低盐溶液，因此可利用不同浓度的NaCl溶液将其从样品中分别抽提出来。

将抽提得到的DNP用SDS处理可将其别离DNA和蛋白质，用氯仿-异戊醇将蛋白质沉淀除去可得DNA上清，参加冷乙醇即可将其呈纤维状析出。

肝脏细胞

肝脏是由肝细胞组成，肝细胞极小，肉眼看不到，必须通过显微镜才能看到。

人肝约有25亿个肝细胞，5000个肝细胞组成一个肝小叶，因此人肝的肝小叶总数约有50万个。

肝细胞为多角形，直径约为20-30/加（微米），有6-8个面，不同的生理条件下大小有差异，如饥饿时肝细胞体积变大。

每个肝细胞外表可分为窦状隙面、肝细胞面和胆小管面三种。

肝细胞里面含有许许多多复杂的细微结构:

如肝细胞核、肝细胞质、线粒体、内质网、溶酶体、高尔基氏体、微粒体及饮液泡等组成。

二、实验目的

1.掌握浓盐法从动物组织中提取DNA的原理与技术

三、实验原理

核酸和蛋白质在生物体中常以核蛋白〔DNP/RNP〕的形式存在，其中DNP能溶于水及高浓度盐溶液，但在0.14M的盐溶液中溶解度很低，而RNP那么可溶于低盐溶液，因此可利用不同浓度的NaCl溶液将其从样品中分别抽提出来。

将抽提得到的DNP用SDS处理可将其别离DNA和蛋白质，用氯仿-异戊醇将蛋白质沉淀除去可得DNA上清，参加冷乙醇即可将其呈纤维状析出。

四、实验器材和材料试剂

实验器材：

①匀浆器

②量筒

③离心机

④离心管

⑤试管

⑥吸管

⑦恒温水浴锅

实验材料：

①猪肝

实验试剂：

①0.1mol/LNaCl-0.05mol/L柠檬酸钠溶液〔pH6.8〕

②95%乙醇〔A.R.〕

③NaCl固体〔A.R.〕

④5%SDS溶液〔5gSDS定容至100ml〕

⑤V（氯仿）：

V〔异戊醇〕20：

1的混合液

五、实验操作

1.称量

①称取一定质量的猪肝，参加2倍肝重的0.1mol/LNaCl-0.05mol/L柠檬酸钠缓冲液并用匀浆器磨碎〔已完成〕。

2.提取DNA

①量取肝糜4ml于10毫升离心管，在4000r/min下离心10min，沉淀中再参加8ml缓冲液于4000r/min离心5min；

②弃上清，取沉淀；

③将沉淀用10ml柠檬酸钠缓冲液完全洗入干净的小烧杯、参加5ml氯仿-异戊醇混合液、1mlSDS，振荡30min〔保鲜膜封口〕；

④缓慢参加固体NaCl〔约0.9g〕，使其最终浓度为1mol/L；

⑤将溶液分装到2个10毫升离心管中，在4000r/min离心5min，取上清水相；

⑥在上述水相溶液中分别加等体积冷95%乙醇，边加边用玻棒慢慢朝一个方向搅动，将缠绕在玻棒上的凝胶状物用滤纸吸去多余的乙醇，即得DNA粗品；

⑦用8ml蒸馏水溶解DNA粗品于10ml离心管中。

3.标准曲线的绘制

按下表参加各种试剂，混匀，于60℃恒温水浴锅45min，冷却后，在595nm波长下于分光光度计比色测定，以吸光度对DNA浓度作图，制作标准曲线。

0

1

2

3

4

5

标准DNA溶液/ml

0.0

0.4

0.8

1.2

1.6

2.0

蒸馏水/ml

2.0

1.6

1.2

0.8

0.4

0

二苯胺试剂/ml

4.0

4.0

4.0

4.0

4.0

4.0

A595nm

4.样品的测定

将DNA粗品定容至25ml容量瓶，再取DNA样液1.0ml，参加蒸馏水1.0ml，混匀。

然后准确参加二苯胺试剂4.0ml，混匀，于60℃恒温水浴锅45min，冷却后，595nm波长下于分光光度计比色测定，根据所测的吸光度对照标准曲线求得DNA的质量〔ug〕。

5.计算100g猪肝中DNA含量

w=m1/m2×100%

w：

DNA的质量分数〔%〕

m1：

样液中测得的DNA的质量〔ug〕

m2：

样液中所含样品的质量〔ug〕

六、实验数据处理

1.标准曲线

0

1

2

3

4

5

标准DNA溶液/ml

0.0

0.4

0.8

1.2

1.6

2.0

蒸馏水/ml

2.0

1.6

1.2

0.8

0.4

0

二苯胺试剂/ml

4.0

4.0

4.0

4.0

4.0

4.0

A595nm

0

0.039

0.09

0.146

0.197

0.249

DNA含量/ug

0

80

160

240

320

400

2.实验结果处理

猪肝质量为2.04g

DNA提取液体积为12.53ml

序号

1

2

3

A595nm

0.102

0.102

0.101

平均A595nm

0.102

样液中DNA含量/ug

171.4

样液中样品质量/g

0.1628

根据公式

w=m1/m2×100%

得：

w=0.1053％

那么100g猪肝中DNA含量为：

w×100=0.1053g

七、思考题

1.实验中的乙醇、SDS、氯仿-异戊醇、NaCl、柠檬酸钠分别有什么作用？

答：

①柠檬酸的钠盐在实验中既充当DNA酶的抑制剂，也是pH缓冲溶液；

②SDS是外表活性剂，可以让蛋白质与DNA分开；

③氯仿是有机溶剂，可以使蛋白质聚集沉淀，便于别离出去；

④异戊醇是消泡剂，可以减少泡沫的发生；

⑤氯仿-异戊醇的作用是使蛋白质变性、膜溶解；

⑥NaCl固体溶解使得试液成为高浓度的盐溶液，在这样的环境中DNA核蛋白能溶解，RNA核蛋白那么溶解度很低，可以利用这一性质别离两种核酸。

八、实验考前须知

1.DNA主要集中在细胞核中，因此，通常选用细胞核含量比例大的生活组织作为提取制备DNA的材料，小牛胸腺组织中细胞核比例较大，因而DNA含量丰富，同时其脱氧核苷酸酶活性较低，制备过程中DNA被降解的可能性相对较低，所以是制备DNA的良好材料，但其来源较困难，脾脏或肝脏易获得，也是实验室制备DNA常用的材料，本实验用新鲜肝脏作为实验材料。

2.为了防止大分子核酸在提取过程中被降解，须采取以下措施：

整个过程必须在低温下进行，可参加某些物质抑制核酸酶的活性，如柠檬酸钠、EDTA、SDS等，EDTA是抑制核酸酶的活性最好的抑制剂。

3.从核蛋白中脱去蛋白质的方法很多，经常采用的有：

氯仿-异丙醇法、苯酚法、去垢剂法等，他们均能使蛋白质变性和核蛋白解聚，并释放出核酸。

4.使用离心机时，对称放置的离心管必须用天平调平衡。

5.防止剧烈振荡，如研磨过程、搅拌过程等。

九、实验结果误差分析及讨论

经过对本次实验结果进行分析，得出100g猪肝中DNA含量大约为0.1053g的结论，在上网查阅相关资料后发现：

猪肝中DNA含量与本次试验实际操作测量得出的结果大致相互吻合。

由此可知，本次试验结果是相比照拟成功的，较为粗略地测量出猪肝中DNA的含量，并且较为熟练地掌握了浓盐法从动物组织中提取DNA的原理与技术，根本到达了本次实验的目的。

但是本次实验结果只是粗略测量，并未到达精确测量猪肝中DNA的含量，且实验数据较理论值偏低，这是由于某些误差导致，在实验过程中些许因素可能会导致实验结果数据有偏差，经分析得出以下几点：

①在称取猪肝后参加柠檬酸钠缓冲液进行研磨的过程中，由于猪肝组织外表较滑不易磨碎，且研磨至最后依旧有小局部猪肝组织块残留，因此可能导致猪肝中DNA提取不充分，致使实验数据较理论值偏低；

②研磨过程中，可能由于操作不当，导致局部液体溅出，因此可能使得提取液中局部DNA损失，导致实验数据偏低；

③在粗提取DNA操作中，频繁地将DNA提取液转移至各个仪器内，可能有极小局部DNA提取液未倒净，残留在仪器壁上损耗掉，导致实验误差；

④在使用移液枪的过程中，可能因为操作不当或移液枪经常错误使用，出现仪器误差，导致吸取的DNA样液不精确，出现实验误差；

⑤在水相中参加乙醇析出DNA时，不是所有DNA均析出，有小局部依旧融在溶液，导致提取出的DNA含量偏低；

⑥标准曲线制作过程中出现些许误差；

总的来讲，本次试验结果是相比照拟成功的，较为粗略地测量出猪肝中DNA的含量，并且较为熟练地掌握了浓盐法从动物组织中提取DNA的原理与技术，根本到达了本次实验的目的。

在今后的实验中会着重注意实验操作的严谨性，严格按照实验前拟定完全的实验步骤进行，保证将实验操作过程中可能出现的误差概率降到最低，尽可能到达预期的实验效果，完成自我的学习及锻炼过程。