姜黄中姜黄素类化合物的提取与分离研究_.doc
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北京大学政学者论文集(2001年)姜黄中姜黄素类化合物的提取与分离研究
姜黄中姜黄素类化合物的提取与分离研究
ResearchonExtractionandSeparationofCurcuminsfromCurcumalonga
化学与分子工程学院98级张智渊
摘要
研究了用75%乙醇提取姜黄中姜黄素类化合物的方法,以及采用CHCl3、CH3OH和HCOOH的混合溶液(比例为96:
4:
0.1)为淋洗剂,用快速吸附柱层析的方法分离姜黄中的姜黄素类化合物。
分离所得溶液用TLC鉴定后,用紫外-可见分光光度法测定其中三种主要有效成分的含量,绘出淋洗曲线。
姜黄素与去甲氧基姜黄素的分离度和去甲氧基姜黄素与去二甲氧基姜黄素的分离度分别为1.1和3.2。
关键词:
姜黄素快速吸附柱层析TLC
Abstract
Researchonextractionofcurcuminsby75%ethanolwithultrasonicfromCurcumalongawascarriedout.Fromthedata(Table1~2,Figure2)wefoundthatonehourisanappropriatetimefortheextraction.Then,arapidadsorptionchromatographywasusedtoseparatethecurcuminsinthesolution,whichmainlyincludescurcumin
(1),demethoxycurcumin
(2)andbisdemethyoxycurcumin(3).Thesolutionwasthenconcentratedbyheatingandloadedonthetopofdihydrogenphosphateimpregnatedsilicagelinaglasscolumn(20mmdiameter,450mmheight).Thecolumnwaseluted(2.5mLmin-1)withchloroform-methanol-formicacid(96:
4:
0.1)(5mLfractions,beganat45mL)togive1(F2~F4),2(F10~F12)and3(F14~F19),whichwereidentifiedbyTLC.EachspotonthephosphateimpregnatedsilicagelTLCplateswasthenexcavatedandimpregnatedin5.0mLacetoneinatuberespectively.After4hours,theUVabsorbencyofeachsolutionwasmeasuredandtheelutioncurvewasshown(Figure3).FromthecurvetheseparationfactorswereeducedasR12=1.1,R23=3.2.Wemustadmittheresultuptonowisnotverysatisfactory,however,wewillkeeponimprovingtheconditiontomakehigherseparationfactorR12andtoseparatemuchmoresinglefractionofcurcumins.
Keywords:
curcumins;adsorptionchromatography;TLC;Curcumalonga.
一、前言
近年来,姜黄素类化合物(curcumins)的研究工作在国内外都颇受重视。
它们是中药姜黄的主要有效成分,含量约占3-6%[1],主要包括姜黄素(curcumin)、去甲氧基姜黄素(demethoxycurcumin)和去二甲氧基姜黄素(bisdemethoxy-
.0curcumin)三种。
这三种酚类色素相近的结构(苯环间二酮结构与烯酮的互变异构、苯环上的酚羟基)使它们具有多方面相似的药理作用,如抗炎、抗氧化和清除自由基、降血脂,特别是它的抗诱变和抗癌作用,正日益引起人们的重视,成为研究的热点。
但是结构上的微小差异(主要是苯环上的烷氧基,见图1)又使三种姜黄素在抗癌、抗氧化作用等方面的能力有较大差异。
例如抑制TPA引起的癌细胞增生去甲氧基姜黄素最佳,其次是姜黄素[2];防止细胞脂类过氧化物的形成则是去二甲氧基姜黄素最佳,其次是去甲氧基姜黄素。
因此从姜黄中提取出较为纯净的三种姜黄素混合物,再进一步将它们分离,对于实际药品生产将会具有良好的指导作用和应用价值。
用有机溶剂从姜黄中提取姜黄素是目前国内外普遍采用的工艺。
但是使用的提取剂和提取条件并不一致。
对于三种姜黄素的分离,通常采用的薄层色谱(TLC)[3]和高效液相色谱(HPLC)[4]分离的方法。
它们的分离效率较高,但是分离量太小,而且成本较高,无法满足工业上大规模生产的要求。
我们工作的目的就是用简单可行的方法,得到较纯且较大量的三种姜黄素产品。
本文在张超工作的基础上[5],对姜黄中姜黄素类化合物的提取与分离进行了进一步的研究。
实验中采用快速吸附柱层析[6]的分离方法,以CHCl3、CH3OH和HCOOH的混合溶液(比例为96:
4:
0.1)[5]为淋洗剂,分离得到了姜黄中姜黄素类化合物的三种主要成分。
其中姜黄素与去甲氧基姜黄素的分离度和去甲氧基姜黄素与去二甲氧基姜黄素的分离度分别为1.1和3.2。
1.curcumin:
R1=R2=OMe
2.demethoxycurcumin:
R1=H,R2=OMe
3.bisdemethyoxycurcumin:
R1=R2=H
图1姜黄素类化合物的结构式
二、实验仪器与药品
1.实验仪器
日本岛津UV-240紫外-可见分光光度计,YamatoRE-51旋转蒸发仪,液体快速混合器(北京长安仪器厂),SHZ-3型循环水真空泵,KQ3200超声波清洗器,台式干燥箱(中国重庆),氮气钢瓶,玻璃层析柱(Φ=20mm,L=400mm)。
2.实验药品
无水乙醇,无水甲醇,丙酮,三氯甲烷,甲酸,磷酸二氢钠(以上均为分析纯,北京化工厂),姜黄粉末(姜黄药材经研磨、过80目筛),硅胶G(薄层层析用,颗粒度10~40μm,青岛海洋化工厂),活性炭(粉末状,使用前150oC活化4.5小时),硅藻土(化学纯,北京房山陶瓷绘料厂),羧甲基纤维素钠(上海化学试剂厂)。
三、实验方法
1.提取方法的选择
分别称取3份姜黄粉末各1.0g(a,b,c),加入10mL75%乙醇。
将a静置浸泡12小时,b于液体快速混合器上振荡12小时,c用超声波提取2小时。
分别取a,b,c提取液10μL,用75%乙醇稀释至4.0mL,测定425nm处的紫外吸收。
为了确定超声波提取的合适时间,将1.0g姜黄粉末加入25mL的锥形瓶中,再加入10mL75%乙醇,将锥形瓶置于超声波清洗器中。
每隔15分钟,取10μL提取液,用75%乙醇稀释至4.0mL后测定其425nm处的紫外吸收。
1.淋洗剂的选择
(1)TLC板的制备
将硅胶G的TLC薄板浸于5%NaH2PO4溶液中,10分钟后取出,晾干,再于台式干燥箱中110oC活化30分钟备用。
(2)薄层色谱的比较
将三-1中所得提取液进行TLC分离,分别用不同比例的CHCl3、CH3OH和HCOOH的混合溶液作为展开剂展开。
3.快速吸附柱层析分离
(1)硅胶的处理
将100g硅胶G加入100mL5%NaH2PO4溶液中,再加入200mL丙酮,搅匀后将硅胶G用水泵抽干,然后置于台式干燥箱中,110oC干燥、活化40min。
将所得硅胶过200目筛后备用。
(2)姜黄素类化合物的提取与提取液的浓缩
称取28.0g姜黄素粉末,加入280mL75%乙醇提取,抽滤后所得提取液用旋转蒸发仪减压浓缩至8.0mL备用。
(3)快速吸附柱层析分离
于Φ=20mm,L=400mm的玻璃层析柱中,以CHCl3、CH3OH和HCOOH(96:
4:
0.1)的混合溶液为淋洗剂,湿法装填处理过的硅胶G,柱床高H=270mm,用氮气钢瓶加压,调整压力使流速V=2.5mLmin-1。
待淋洗剂液面与硅胶柱顶端即将齐平时,加入浓缩的姜黄素提取液样品1.2mL,立即将样品压入硅胶柱,待液面即将与硅胶柱顶端齐平时,加入淋洗剂开始淋洗,加压使流速保持V=2.5mLmin-1,从有亮黄色溶液流出时,即流出第45mL溶液时开始用带刻度的离心管接取流出的溶液。
每5~6mL接一管,共20管,约104mL。
再进一步用TLC法分离并测定每份溶液中姜黄素、去甲氧基姜黄素和去二甲氧基姜黄素的含量。
将各管溶液定量的点于TLC板上,以CHCl3、CH3OH和HCOOH(96:
4:
0.1)的混合溶液为展开剂展开,将每个黄色斑点挖下,分别溶解于5.0mL丙酮中。
测定各丙酮溶液的紫外吸收。
四、结果与讨论
1.提取姜黄素类化合物的方法
实验1的结果如表1、表2和图2所示。
表13种提取方法所的姜黄提取液的紫外吸收
提取方法
a.静置浸泡12h
b.振荡12h
c.超声波提取2h
吸光度(425nm)
0.355
0.503
0.568
λ=425nm处为姜黄素类化合物的特征峰,可用于测定姜黄素类化合物的总含量。
由表1可知,用超声波提取的效果最好,且时间最短。
表2超声波提取的吸光度-时间关系
时间(分钟)
15
30
45
60
75
90
105
吸光度(425nm)
0.355
0.372
0.508
0.563
0.535
0.559
0.569
从表2和图2可见,用超声波法提取液在1小时后基本达到饱和。
为防止超声波时间过长而破坏有效成分,确定用超声波提取1小时。
2.淋洗剂的选择
实验2的结果如表3所示。
由表3可见,用展开剂e,f,g展开所得三种成分Rf值差别较大,可以满意,但是用f,g展开拖尾严重,故e效果最好。
这与文献[5]报导结果一致。
由于在快速吸附柱层析实验中填料也选用硅胶G(薄层层析用),故淋洗剂选用e,即CHCl3、CH3OH和HCOOH混合溶液,比例为96:
4:
0.1。
表35种展开剂用于姜黄提取液的TLC分离所得三组分的Rf值
编号
d
e
f
g
h
展开剂组成
(CHCl3:
CH3OH:
HCOOH)
96:
4:
0.3
96:
4:
0.1
96:
4:
0.05
98:
2:
0.1
90:
10:
0.1
Rf
值
姜黄素
0.78
0.69
0.66
0.54
0.82
去甲氧基姜黄素
0.60
0.46
0.49
0.29
0.74
去二甲氧基姜黄素
0.48
0.31
0.34
0.14
0.66
拖尾情况
不严重
不严重
严重
严重
不严重
3.快速吸附柱层析法分离
实验3的TLC定性实验结果为:
第2~4管为姜黄素,第10~12管为去甲氧基姜黄素,第14~19管为去二甲氧基姜黄素。
定量分析结果如表4和图3所示。
表4快速吸附柱层析分离所得流出溶液中3个组分的紫外吸收
试管号
淋洗体积
(mL)
吸光度
试管号
淋洗体积
(mL)
吸光度
A1
A2
A3
A1
A2
A3
1
45
—
—
—
11
99
—
0.159
—
2
51
0.01
—
—
12
104
0
0.095
—
3
56
1.050
0.024
—
13
110
—
0.041
0.061
4
61
1.534
—
—
14
116
—
0.016
0.216
5
66
1.176
0.164
—
15
121
—
0.009
0.455
6
72
0.969
0.363
—
16
128
—
—
0.190
7
77
0.882
0.753
—
17
133
—
—
0.140
8
83
0.436
0.751
—
18
138
—
—
0.064
9
89
0.070
0.361
—
19
143
—
—
0.039
10
94
0.017
0.276
—
20
149
—
—
—
注:
A1表示姜黄素溶液的吸光度(最高吸收峰为420nm),A2表示去甲氧基姜黄素溶液的吸光度(最高吸收峰为417nm),A3表示去二甲氧基姜黄素溶液的吸光度(最高吸收峰为410nm)。
“—”表示TLC分离后无相应组分而未进行紫外测定。
计算分离度R.V、W分别表示淋洗曲线中三个峰的峰位置和半峰宽:
R12=2(V2–V1)/(W1+W2)=2(80–62)/(18+16)=1.1
R23=2(V3–V2)/(W2+W3)=2(121–80)/(16+10)=3.2
4.结论
用快速吸附柱层析的方法,采用CHCl3、CH3OH和HCOOH的混合溶液(比例为96:
4:
0.1)为淋洗剂,分离得到了姜黄中姜黄素类化合物的三种主要成分。
其中姜黄素与去甲氧基姜黄素的分离度和去甲氧基姜黄素与去二甲氧基姜黄素的分离度分别为1.1和3.2。
为满足今后工业生产的要求,还需进一步提高塔板数与柱容量,以提高姜黄素与去甲氧基姜黄素的分离度和进样量。
参考文献
1.天津轻工业学院食品工业教学研究室编.食品添加[M],北京:
轻工业出版社(第二版),1985,111.
2.C.Rasmussen,K.Kvist.ASimpleandEfficientSeparationoftheCurcumins,theAntiprotozoalConstituentsofCurcumalonga.PlantaMed.66(2000)396-7.
3.何顺志,丛晓东,金蓉鸾.中国姜黄属植物根茎中姜黄素类化合物含量测定.中国药科大学学报1990;21
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4.赵德永,杨模坤,姜黄及其制剂中姜黄素类化合物的高效液相色谱分离及测定.药学学报1986;2(5),382-385.
5.张超.姜黄素Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的提取与分离.北京大学本科生毕业论文.
6.(a)W.C.Still,M.Kahn,A.Mitra,J.Org.Chem.,43,2923(1978).
(b)D.F.Taber,J.Org.Chem.,47,135(1982).
(c)利群,赵晨,张滂.快速吸附柱层析.大学化学,1986,1:
41-42.
致谢
感谢李政道先生及其家人为祖国教育事业做出的努力!
感谢导师刘元方教授给我这个机会,使我在较早的时候就能够接触到前沿的科研领域。
刘教授严谨的治学态度,渊博的学识,以及巧妙的管理方法都给我留下了深刻的印象,将使我受益终身。
感谢王海芳老师对我的悉心指导。
王老师对工作的热情,谦和的为人以及惊人的毅力都令人十分钦佩。
感谢吴永慧、孙红芳、刘锋、张新祥和裴伟伟等几位老师在实验中对我的指导。
这些指导对我拓宽思路和解决难题都有极大的帮助。
感谢朱静、张超、王亚俐、姬志强、刘铭钊等几位同学对我的鼓励与帮助!
感谢父母、姐姐对我的理解与支持,他们是我工作和学习的坚强后盾。
最后再次向所有关心和支持我的人表示衷心的感谢!
作者简介
张智渊,男,祖籍河南郑州。
1979年9月生于陕西省咸阳市。
1998年9月进入北京大学技术物理系学习。
大学期间曾被评为三好学生,获得学习优秀奖、“五四”奖和“佳能优”奖学金等奖励。
曾于系中担任学生会副主席和团委副书记。
热爱体育,是围棋业余三段。
导师简介
刘元方,男,1931年2月生于浙江镇海。
1952年毕业于燕京大学化学系,此后一直在北京大学任教。
1983年任教授,1985年为博士生导师,1991年当选中国科学院院士。
曾任中国核化学与放射化学会理事长,国际化学联合会(IUPAC)放射化学和核技术委员会主席,中国核学会常务理事,现任中国科学院化学学部副主任,国际放射化学学报顾问编委。
研究方向:
核化学,放射化学,生物无机化学,放射性药物化学,生物加速器质谱学,发表研究论文130余篇。
感悟与寄语
自2000年3月至今,我有幸在刘元方教授的研究组里进行了“政基金”课题的研究工作,前后参与了两个课题的研究。
在这一年半时间里,我体验到了许多科研中的酸甜苦辣。
感受最深的一点就是:
科研工作是十分艰苦的。
为了找一个合适的分离条件,我们不得不做大量的条件实验进行比较,甚至要为此通宵工作。
这使我深刻的理解到,一个数据背后的难以为人所知的惊人的工作量。
不过,正是在这种艰苦的磨练之中,我才得以有机会领悟科研工作的真谛。
同时我也深感学术交流的重要性。
我常常就实验中的问题向许多不同的老师和同学请教,博采众长,每次都有豁然开朗之感。
最有趣的一次,是两位教授的看法竟然截然相反,结果我分别验证,找到了答案。
总之,这一年半的深刻体验将是我人生中一笔宝贵的财富,它使我更加勇敢地面对未来的各种挑战。
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