大鼠Rat血管内皮生长因子VEGF-NEWA.doc
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大鼠Rat血管内皮生长因子VEGF-NEWA.doc
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本试剂盒只能用于科学研究,不得用于医学诊断
大鼠(Rat)血管内皮生长因子(VEGF)
ELISA检测试剂盒
使用说明书
检测原理
试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)。
往预先包被血管内皮生长因子(VEGF)抗体的包被微孔中,依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体,经过温育并彻底洗涤。
用底物TMB显色,TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的血管内皮生长因子(VEGF)呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值),计算样品浓度。
样品收集、处理及保存方法
1.血清:
使用不含热原和内毒素的试管,操作过程中避免任何细胞刺激,收集血液后,3000转离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。
2.血浆:
EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。
3000转离心30分钟取上清。
3.细胞上清液:
3000转离心10分钟去除颗粒和聚合物。
4.组织匀浆:
将组织加入适量生理盐水捣碎。
3000转离心10分钟取上清。
5.保存:
如果样本收集后不及时检测,请按一次用量分装,冻存于-20℃,避免反复冻融,在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。
自备物品
1.酶标仪(450nm)
2.高精度加样器及枪头:
0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL
3.37℃恒温箱
操作注意事项
1.试剂盒保存在2-8℃,使用前室温平衡20分钟。
从冰箱取出的浓缩洗涤液会有结晶,这属于正常现象,水浴加热使结晶完全溶解后再使用。
2.实验中不用的板条应立即放回自封袋中,密封(低温干燥)保存。
3.浓度为0的S0号标准品即可视为阴性对照或者空白;按照说明书操作时样本已经稀释5倍,最终结果乘以5才是样本实际浓度。
4.严格按照说明书中标明的时间、加液量及顺序进行温育操作。
5.所有液体组分使用前充分摇匀。
试剂盒组成
名称
96孔配置
48孔配置
备注
微孔酶标板
12孔×8条
12孔×4条
无
标准品
0.3mL*6管
0.3mL*6管
无
样本稀释液
6mL
3mL
无
检测抗体-HRP
10mL
5mL
无
20×洗涤缓冲液
25mL
15mL
按说明书进行稀释
底物A
6mL
3mL
无
底物B
6mL
3mL
无
终止液
6mL
3mL
无
封板膜
2张
2张
无
说明书
1份
1份
无
自封袋
1个
1个
无
注:
标准品(S0-S5)浓度依次为:
0、20、40、80、160、320pg/mL
试剂的准备
20×洗涤缓冲液的稀释:
蒸馏水按1:
20稀释,即1份的20×洗涤缓冲液加19份的蒸馏水。
洗板方法
1.手工洗板:
甩尽孔内液体,每孔加满洗涤液,静置1min后甩尽孔内液体,在吸水纸上拍干,如此洗板5次。
2.自动洗板机:
每孔注入洗液350μL,浸泡1min,洗板5次。
操作步骤
1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条,剩余板条用自封袋密封放回4℃。
2.设置标准品孔和样本孔,标准品孔各加不同浓度的标准品50μL;
3.样本孔先加待测样本10μL,再加样本稀释液40μL;空白孔不加。
4.除空白孔外,标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100μL,用封板膜封住反应孔,37℃水浴锅或恒温箱温育60min。
5.弃去液体,吸水纸上拍干,每孔加满洗涤液,静置1min,甩去洗涤液,吸水纸上拍干,如此重复洗板5次(也可用洗板机洗板)。
6.每孔加入底物A、B各50μL,37℃避光孵育15min。
7.每孔加入终止液50μL,15min内,在450nm波长处测定各孔的OD值。
结果判断
绘制标准曲线:
在Excel工作表中,以标准品浓度作横坐标,对应OD值作纵坐标,绘制出标准品线性回归曲线,按曲线方程计算各样本浓度值。
试剂盒性能
1.准确性:
标准品线性回归与预期浓度相关系数R值,大于等于0.9900。
2.灵敏度:
最低检测浓度小于1.0pg/mL。
3.特异性:
不与其它可溶性结构类似物交叉反应。
4.重复性:
板内、板间变异系数均小于15%。
5.贮藏:
2-8℃,避光防潮保存。
6.有效期:
6个月
免责声明
1.试剂盒仅供研究使用,不得用于临床实验或人体实验,否则所产生的一切后果,由实验者承担,本公司概不负责。
2.严格按照说明书操作,实验者违反说明书操作,后果由实验者承担。
FORRESEARCHUSEONLY.
NOTFORUSEINDIAGNOSTICPROCEDURES.
RatVascularEndothelialcellGrowthFactor(VEGF)ELISAKitinstruction
Intendeduse
ThisVEGFELISAkitisintendedLaboratoryforResearchuseonlyandisnotforuseindiagnosticortherapeuticprocedures.TheStopSolutionchangesthecolorfrombluetoyellowandtheintensityofthecolorismeasuredat450nmusingaspectrophotometer.InordertomeasuretheconcentrationofVEGFinthesample,thisVEGFELISAKitincludesasetofcalibrationstandards.ThecalibrationstandardsareassayedatthesametimeasthesamplesandallowtheoperatortoproduceastandardcurveofOpticalDensityversusVEGFconcentration.TheconcentrationofVEGFinthesamplesisthendeterminedbycomparingtheO.D.ofthesamplestothestandardcurve.
Samplecollectionandstorages
Serum-Useaserumseparatortubeandallowsamplestoclotfor30minutesbeforecentrifugationfor10minutesatapproximately3000×g.Removeserumandassayimmediatelyoraliquotandstoresamplesat-20℃or-80℃.Avoidrepeatedfreeze-thawcycles
Plasma-CollectplasmausingEDTAorheparinasananticoagulant.Centrifugesamplesfor30minutesat3000×gat2-8℃within30minutesofcollection.Storesamplesat-20℃or-80℃.Avoidrepeatedfreeze-thawcycles.
Cellculturesupernatesandotherbiologicalfluids-Removeparticulatesbycentrifugationandassayimmediatelyoraliquotandstoresamplesat-20℃or-80℃.Avoidrepeatedfreeze-thawcycles.
Note:
Thesamplesshoulebecentrifugateddequatelyandnohemolysisorgranulewasallowed.
Materialsrequiredbutnotsupplied
1.Standardmicroplatereader(450nm)
2.PrecisionpipettesandDisposablepipettetips.
3.37℃incubator
Precautions
1.Donotsubstitutereagentsfromonekittoanother.Standard,conjugateandmicroplatesarematchedforoptimalperformance.Useonlythereagentssuppliedbymanufacturer.
2.Donotremovemicroplatefromthestoragebaguntilneeded.Unusedstripsshouldbestoredat2-8°Cintheirpouchwiththedesiccantprovided.
3.Mixallreagentsbeforeusing.
Removeallkitreagentsfromrefrigeratorandallowthemtoreachroomtemperature(20-25°C)
Materialssupplied
Name
96determinations
48determinations
Microelisastripplate
12*8strips
12*4strips
Standard
0.3ml*6tubes
0.3ml*6tubes
SampleDiluent
6.0ml
3.0ml
HRP-Conjugatereagent
10.0ml
5.0ml
20XWashsolution
25ml
15ml
ChromogenSolutionA
6.0ml
3.0ml
ChromogenSolutionB
6.0ml
3.0ml
StopSolution
6.0ml
3.0ml
Closureplatemembrane
2
2
Usermanual
1
1
Sealedbags
1
1
Note:
Standard(S0→S5)concentrationwasfollowedby:
0,20,40,80,160,320pg/ml.
Reagentpreparation
20×washsolution:
DilutewithDistilledordeionizedwater1:
20.
Assayprocedure
1.Prepareallreagentsbeforestartingassayprocedure.ItisrecommendedthatallStandardsandSamplesbeaddedinduplicatetotheMicroelisaStripplate.
2.Addstandard:
SetStandardwells,testingsamplewells.Addstandard50μltostandardwell.
3.AddSample:
Addtestingsample10μlthenaddSampleDiluent40μltotestingsamplewell;Blankwelldoesn’taddanyting.
4.Add100μlofHRP-conjugatereagenttoeachwell,coverwithanadhesivestripandincubatefor60minutesat37°C.
5.Aspirateeachwellandwash,repeatingtheprocessfourtimesforatotaloffivewashes.WashbyfillingeachwellwithWashSolution(400μl)usingasquirtbottle,manifolddispenserorautowasher.Completeremovalofliquidateachstepisessentialtogoodperformance.Afterthelastwash,removeanyremainingWashSolutionbyaspiratingordecanting.Inverttheplateandblotitagainstcleanpapertowels.
6.AddchromogensolutionA50μlandchromogensolutionB50μltoeachwell.Gentlymixandincubatefor15minutesat37°C.Protectfromlight.
7.Add50μlStopSolutiontoeachwell.Thecolorinthewellsshouldchangefrombluetoyellow.Ifthecolorinthewellsisgreenorthecolorchangedoesnot
appearuniform,gentlytaptheplatetoensurethoroughmixing.
8.ReadtheOpticalDensity(O.D.)at450nmusingamicrotiterplatereaderwithin15minutes.
Calculationofresults
1.Thisstandardcurveisusedtodeterminetheamountinanunknownsample.ThestandardcurveisgeneratedbyplottingtheaverageO.D.(450nm)obtainedforeachofthesixstandardconcentrationsonthevertical(Y)axisversusthecorrespondingconcentrationonthehorizontal(X)axis.
2.First,calculatethemeanO.D.valueforeachstandardandsample.AllO.D.values,aresubtractedbythemeanvalueofthezerostandardbeforeresultinterpretation.Constructthestandardcurveusinggraphpaperorstatisticalsoftware.
3.Todeterminetheamountineachsample,firstlocatetheO.D.valueontheY-axisandextendahorizontallinetothestandardcurve.Atthepointofintersection,drawaverticallinetotheX-axisandreadthecorrespondingconcentration.
4.Anyvariationinoperator,pipettingandwashingtechnique,incubationtimeortemperature,andkitagecancausevariationinresult.Eachusershouldobtaintheirownstandardcurve.
5.Thesensitivitybythisassayis1.0pg/ml
6.Standardcurve
Storage:
2-8℃.
validity:
sixmonths.
FORRESEARCHUSEONLY;NOTFORTHERAPEUTICORDIAGNOSTICAPPLICATIONS!
PLEASEREADTHROUGHENTIREPROCEDUREBEFOREBEGINNING!
- 配套讲稿:
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