蔗糖酶的提取及活力.docx
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蔗糖酶的提取及活力
蔗糖酶的提取及活力、含量和相对分子质量测定
摘要:
本学期共做了六次生化实验。
.第一次是提取及纯化蔗糖酶,以为后续实验提供样品。
实验主要目的是要求学生掌握高速离心机的使用。
实验共得到不同纯化度的三种提取液,标记为A、B、C。
将三种提取液分别放入冰箱保存,做为后续实验样品。
也因此做此实验时必须保证各个操作无误,及准确,以免影响后续实验的结果。
第二次是有关蔗糖酶的柱层析法,主要目的是要求同学掌握离子交换层析的原理及柱层析的操作技术及紫外吸收的分析方法。
此次实验通过柱层析及紫外吸收法得到2~3管的活力最大的分离液合并为分离液D,放入冰箱作为后续实验样品。
第三次实验为蔗糖酶的活力测定,目的为掌握酶的活力测定方法,了解各个酶的纯化情况。
利用分光度计测出各个样品的OD值,再对照葡萄糖的标准曲线来得出剩余葡萄糖的含量,从而获得各个酶的活力大小,了解各个酶的纯化情况。
并得出结论酶的纯化度越高,活力越小。
第四次实验为蔗糖酶蛋白质的含量测定,目的为掌握学习Folin-酚测定蛋白质含量的原理及方法,制备标准曲线测定未知样品中蛋白质含量。
同样利用与标准曲线对照来得到试样的蛋白质含量,并测出酶的比活力。
测量蛋白质的方法有多种,我们必须根据所做实验的具体选择合适的方法来测定蛋白质。
第五次的实验是微量凯氏定氮测总蛋白。
目的是要求同学掌握凯氏定氮法测定蛋白质含量的原理及方法。
本实验除利用了凯氏定氮法外还加上了酸式滴定法最后得出了毫克级别的总蛋白含量。
其结果与上一实验所测得的总蛋白质含量有所不同,正证明了不同的方法测量蛋白质造成的误差不同,致所得结果不同。
最后一次实验为SDS-PAGE测定蛋白质分子质量,目的为掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和测定蛋白质分子量技术。
此实验操作复杂,需先制作凝胶再结果染色脱色,最后还要制作标准蛋白分子质量曲线图来进行试样对照。
最后得到蔗糖酶的分子量在5万左右及9万左右。
关键字:
实验;提取液;比活;蛋白质;SDS-PAGE;OD
正文:
1,蔗糖酶的提取及提纯
1.1,文献综述:
蔗糖酶的分离利用的是细胞破壁法。
细胞破壁:
就酶在生物体内的分布,可分为胞内酶和胞外酶,蔗糖酶系胞内酶。
提取胞内酶时,要破碎组织和细胞,然后用一定的溶液提取,得到的材料称为无细胞抽提液。
材料不同,破壁也方法不同。
我们用的菌体(微生物)细胞破壁方法是:
自溶法,即将菌体放在适当的pH值和温度下,利用组织细胞自身的酶系将细胞破坏,是细胞内物质释放出来。
自溶时需加少量防腐剂,以防外界细菌污染。
自溶法的缺点是时间较长。
本实验的自溶条件是:
加乙酸钠保持弱碱性条件、35℃、加入乙酸乙脂代替防腐剂,0.5-1h。
自溶法的操作较简单方便,适合学生操作。
(参考文献;蔗糖酶的分离提纯及酶促)
1.2,材料与方法
1.2.1,材料:
啤酒酵母;醋酸钠;甲苯;4mol/L醋酸;95%乙醇;0.5mol/Lris-HClPH7.3缓冲液;锥形瓶;量筒;烧杯;具塞试管;吸球;培养箱;恒温水浴锅;磁力搅拌器;搅拌子;高速冷冻离心机;
1.2.2,方法:
1.2.2.1,酵母自溶:
⏹250毫升锥形瓶,加入20克鲜酵母
⏹加入醋酸钠1.6克,搅拌使团块的酵母液化
⏹加1.5毫升甲苯,包扎好瓶口,摇动10分钟,使充分混匀
⏹放入37℃培养箱,保温48-60小时,使酵母自溶
1.2.2.2,初提液A制备.
⏹在培养箱中取出装有已自溶酵母的三角瓶,加10毫升蒸馏水,摇匀,倒入离心管1中,平衡(互加平衡)。
⏹用高速冷冻离心机4℃,15000r/min离心10min。
⏹离心管中的悬浮液分三层,上层为浆状物(甲苯及其抽提物),下层为固体(细胞碎片沉淀),中间一层为液体(含酶)。
⏹小心仔细地取出中间层的液体,重新倒入离心管2中,4℃,15000r/min离心10min(互加平衡)。
⏹取上清液倒入
⏹25毫升量筒
⏹量体积记录VA
⏹取出3ml保存
⏹得初提液A
1.2.2.3,热提取液B制备:
⏹将初提液A(VA-3ml)倒入50毫升的三角瓶中,加4mol/L的醋酸3.2ml左右,使溶液的pH值约为4.5左右,摇匀
⏹50℃恒温水浴中保温25min(注意温度绝对不能超过50℃),在保温过程中不断的摇动三角瓶
⏹离心:
4℃,15000rpm,10min
⏹(H2O平衡)
⏹仔细地倒出上层清液入10ml量筒测量体积,记为VB,此提取液为热提取液B。
⏹取出3ml于具塞试管保存,用于后续实验。
1.2.2.4,乙醇沉淀提取液C制备
⏹将热提取液B(VB-3ml)倒入100ml的烧杯中,放入加有碎冰的大烧杯冰浴,置于磁力搅拌器上,缓慢加入体积(VB-3ml)-20℃95%乙醇。
整个过程不少于25min,结束后再继续搅拌5min
⏹将烧杯内的液体全部移入离心管中,杯底白色固体保留待用,4℃,15000rpm,离心10min加(95%÷2)乙醇平衡。
离心后弃去上清液
⏹用5毫升trisHCL溶解烧杯中的白色固体,再倒入离心管中搅拌使管内的固体溶解,再次离心,4℃,15000rpm,10min,平衡用trisHCL溶液平衡
⏹离心后取上层清液入10ml量筒
⏹测量体积,记为VC
⏹此提取液为乙醇沉淀提取液C
⏹测量其体积为VC。
全部保存于具塞试管,用于后续实验。
1.3,结果与讨论
实验得到ABC各三种不同程度纯化的蔗糖酶提取液,颜色各从深及浅,说明蔗糖酶本身的颜色较浅。
初提液A
热提取液B
乙醇沉淀提取液C
溶液体系
水溶液
醋酸
trisHCl
特点
pH值4.5左右
pH值7.3左右
体积/ml
18.5
17.5
5.6
颜色状态
黄色溶液
黄色溶液
淡黄色溶液
影响因素
温度、酸碱度控制不准会影响蔗糖酶产量
1.4,结论
实验中在将提取液A水浴时必须不断摇动锥形瓶,温度不能超过50℃,取出后迅速在水浴中冷却,之后所有的操作都必须在冰浴上。
而在提取液B放入乙醇时,必须要保证乙醇的速度缓慢,是乙醇混合均匀,析出最大量的沉淀使所需酶充分变性沉淀。
整个操作必须严谨细心,保证蔗糖酶得到了最优纯化。
提纯酶时可以充分利用蛋白质的变性、复兴的性质来得到纯化的酶液。
2,蔗糖酶的纯化QSepharose-柱层析法
2.1文献综述:
通过对不同离子交换层析方法的比较,进行酵母蔗糖酶纯化实验改进,采用QSepharose离子交换介质;流动相经50min由0.05MTris-HCLpH7.3缓冲液到1MNaCL的0.05MTris-HCLpH7.3缓冲液,进行梯度洗脱分离,分离效果最好,蔗糖酶与杂蛋白得到了有效的分离,回收率为93.2%,是现有实验的3.17倍,浓缩倍数为2.91,是现有实验的1.43倍,提高了实验效果。
(参考文献;离子交换层析纯化蔗糖酶实验方法改进研究)
2.2,材料与方法
2.2.1,材料
⏹试剂:
0.05mol/LTris-HClPH7.3缓冲液;1mol/LNaCl和0.05mol/LTris-HClPH7.3缓冲液;0.5mol/LnaOH;QSepharose
⏹器具:
层析柱、梯度发生器及搅拌子、紫外分光光度计、点滴板等
2.2,.2,方法
2.2.2.1,离子交换柱的填充
⏹固定和清洗:
层析冲洗。
下面留一点水。
柱子垂直固定,下端的橡皮管夹子夹紧、取下上部盖子,加水5毫升
⏹凝胶装柱:
高约5公分,上面填平,注意上部水面高于交换剂平面,放松夹子,使水流下,直到与表面相切,夹紧夹子。
2.2.2.2,缓冲液盐度梯度发生器的安装
⏹连通:
先加入水,两个旋钮朝一个方向可以连通,使液体进入,连接桥不可以有气泡。
然后使旋钮回到正中,加入相应的溶液。
⏹装入溶液:
第一个杯子加入20毫升0.05摩尔/升TrisHClpH7.3,并加入磁力棒,第二个加入20毫升1摩尔/升NaCl
2.2.2.3,柱的平衡
⏹在小烧杯中加入15毫升TrisHCl
⏹恒流泵进口插入烧杯液面下
⏹恒流泵出水管一端连接柱子
⏹放松夹子
⏹打开恒流泵
⏹用TrisHCl冲洗
⏹直到缓冲液面与交换剂相切
2.2.2.4,加样及洗穿透峰:
⏹夹紧下端夹子,在烧杯加入15毫升TrisHCl
⏹从上部缓慢加入0.5ml提取液C,放松夹子
⏹样品全部刚好进入交换剂内,相切,夹紧夹子
⏹先打开恒流泵,再放开夹子
⏹用量筒收集全部流出液体,每管收集3ml
⏹直到液面相切
2.2.2.5,氯离子梯度洗脱
⏹将梯度发生器出口与恒流泵相连
⏹恒流泵与柱相连
⏹③打开搅拌器,打开连通器旋钮,打开恒流泵
⏹④用20毫升TrisHCl缓冲液配制的
⏹1摩尔/升NaCl20毫升溶液
⏹开始梯度洗脱
⏹打开夹子
⏹⑤用量筒收集3毫升/管,
⏹直到全部缓冲液流出
2.2.2.6,离子交换剂的再生
⏹烧杯加入15毫升NaCl洗脱→不用收集→凝胶冲到小烧杯→全部凝胶回收
⏹最后一个班用0.5摩尔/升NaOH洗3CV,除去氯离子,不用回收洗脱液→最后凝胶回收,冲到烧杯里面
2.2.2.7,用紫外分光光度计测每管的紫外吸光度OD值,并记录。
测定后样品回收!
!
2.2.2.8,酶活力测试
⏹样品选取(老师指导下)
⏹从洗穿透峰样品中选择1-2个蛋白质浓度较高的样品测定酶活力
⏹从梯度洗脱样品中选取峰值附近的几个样品进行酶活力测定。
⏹酶活力测定:
点滴板中滴2滴5%蔗糖→加2滴待测洗脱液→玻璃棒搅匀→放置5min→浸入葡萄糖试纸→1s(延长时间)取出→过60s比较颜色深浅→用“+”表示酶活力的大小
⏹体积测定
⏹将酶活力较高的2-3个样品合并测量体积(洗穿透峰样品不用合并),记为VD,用具塞试管保留,其他样品可以洗掉。
2.3,结果与讨论
取酶活力最高的9、10、14合并为一管,记为提取液D。
与实验一中获得的ABC一起放入冰箱中保存。
初提液A
热提取液B
乙醇沉淀提取液C
提取液D
溶液体系
水溶液
醋酸
trisHCl
trisHCl
特点
pH值4.5左右
pH值7.3左右
pH值7.3左右
体积/ml
18.5
17.5
5.6
5.4
颜色状态
黄色溶液
黄色溶液
淡黄色溶液
无色溶液
影响因素
温度、酸碱度控制不准会影响蔗糖酶产量
2.4,结论
提取液C中除了高活性酶外,还有各种不同的杂蛋白质。
实验中应注意各种实验操作,在填充柱时要注意不要干柱,全部凝胶要回收归还。
整个实验过程都要保证不要干柱。
在安装缓冲液梯度发生器时,要注意打开后观察两个杯子中液体是否均有减少,连接桥不能有气泡。
确保梯度浓度制成。
3,蔗糖酶活力的测定
a)3.1,文献综述:
在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度成一定比例关系,可用于比色测定,可用DNS比色法测定还原糖的含量,可用DNS比色定糖法测定蔗糖酶的活力.。
(参考文献;蔗糖酶的分离提纯及酶促)
3.2,材料与方法
3.2.1,材料
⏹试剂3、5-二硝基水杨酸;葡萄糖标准溶液0.2mg/ml;0.2mol/L醋酸钠缓冲液,pH4.6;5%蔗糖用0.2mol/L醋酸钠缓冲液,pH4.6配置;2mol/LNaOH
⏹器材:
电炉;恒温水浴锅;分光光度计;试管、移液管
3.2.2,方法
3.2.2.1,葡萄糖标准曲线制作
⏹烧水,不要太多
⏹DNS反应:
注意振荡混匀,移液管对应,要及时清洗
试管号
0
1
2
3
4
5
葡萄糖/ml
0
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
蒸馏水/ml
3.0
2.2
2.0
1.8
1.6
1.4
DNS/ml
1.5
1.5
1.5
1.5
1.5
1.5
总体积/ml
4.5
4.5
4.5
4.5
4.5
4.5
⏹测吸光值
⏹于540波长处测OD值。
用0号做对照。
⏹测定要求:
测定数据在(0.1-0.7A),波动可以到0.2-0.8,最小不能小于0.1,最大不能超过1.0。
⏹绘制葡萄糖标准曲线:
以葡萄糖的毫克数为横坐标,OD值为纵坐标,画出葡萄糖标准曲线。
数据结果回去处理。
⏹要求R2值接近1,至少0.999。
3.2.2.2,酶活力测定
⏹稀释样品:
⏹稀释方法:
提取液
A
B
C
D
比例
1:
200
1:
200
1:
200
1:
20
移液管原液
0.25ml
0.25ml
0.25ml
0.5ml
定容
50ml容量瓶
50ml容量瓶
50ml容量瓶
10ml移液管
⏹稀释顺序:
浓度从低到高,即C→B→A,防止污染。
⏹水解反应
试管
项目
A0
A1
B0
B1
C0
C1
D0
D1
酶液A稀释液
各取4种稀释液2.00ml,加入8支试管,按项目名称编号
NaOHml变性
0.5
---
0.5
---
0.5
---
0.5
---
预热
5%蔗糖试剂瓶,8支试管(放在试管架上),于35℃预热10min
蔗糖ml
各试管加入5%蔗糖2ml加入后立即摇匀开始计时,
35℃准确反应3min
NaOH终止反应
---
0.5
---
0.5
---
0.5
---
0.5
总体积/ml
4.50
4.50
4.50
4.50
4.50
4.50
4.50
4.50
3.2.2.3,进行DNS反应,测吸光值
试管号/ml
A0
A1
B0
B1
C0
C1
D0
D1
反应液V测
0.1
0.1
0.1
0.1
0.15
0.15
0.3
0.3
从上次水解反应液中分别取出V测,用ABCD移液管,先取对照
蒸馏水
2.9
2.9
2.9
2.9
2.85
2.85
2.7
2.7
DNS
1.50
1.50
1.50
1.50
1.50
1.50
1.50
1.50
总体积
4.5
4.5
4.5
4.5
4.5
4.5
4.5
4.5
⏹测吸光值
⏹调零:
以A0、BO、C0、D0分别作对照调平。
每组需重新调平。
⏹测过的样品不要倒掉。
⏹如果测得的OD值结果不在标准曲线还原糖范围内,则可增加或减少取样量,加倍或减半,重新做DNS反应,直到OD值在标准曲线范围内为止(0.1-1.0之间)。
⏹吸光值结果分别代入葡萄糖曲线公式,计算4.5ml溶液中所含还原糖的量(以葡萄糖计),用表格记下。
3.2.2.4,计算出酶活力单位
3.3,结果与讨论
此曲线的线性程度只有0.9943,线性程度不是很高,可能在试剂量取时存在着一些人为视读误差。
样品
A
B
C
D
V测/ml
0.1
0.1
0.15
0.3
OD540/A
0.812
0.594
0.578
0.825
葡萄糖/mg
0.390
0.308
0.301
0.394
总体积/mg
4.5
4.5
4.5
4.5
稀释倍数
200
200
200
20
酶活力单位/U
5265.0
2494.8
2031.8
265.9
酶的回收率=(各提取液的总酶活/初提液A的总酶活)*100
表蔗糖酶活力测定结果
项目
初提液A
热提取液B
乙醇提取液
柱分离液D
总活力单位/U
5265.0
2494.8
2031.8
265.9
回收率/%
100
47.4
38.6
5.1
3.4,结论
A的酶活力最高,B的酶活力较高,回收率也较高,C、D依次降低,D的酶活力和回收率都较低,实验时,温度、PH等条件的控制不当都会给结果带来误差。
A的酶活力及回收率都较高,BCD依次降低,说明随着纯化的越来越高,酶活力变低。
4,蔗糖酶蛋白质含量测定
a)4.1,文献综述:
凡含有两个及两个以上肽键(—CO—NH—)的化合物(如双缩脲:
H2N—CO—NH—CO—NH2),在碱性溶液中(如Folin-甲试剂)都能与Cu2+作用,形成紫色的复合物;蛋白质是由多个氨基酸通过肽键连接起来的,故所有的蛋白质均可与Folin-甲试剂反应,形成紫色的铜-蛋白质复合物;铜-蛋白质复合物在pH=10的碱性溶液中可将磷钼酸-磷钨酸(Folin-乙试剂)还原成兰色的钼蓝和钨蓝混合物,其颜色的深浅(在一定范围内)与蛋白质的含量成正比;在测定液体蛋白质样品含量的常用方法中(双缩脲法、Folin-酚法和紫外吸收法),Folin-酚法的灵敏度最高(比紫外吸收法高10-20倍,比双缩脲法高100倍),所以我们选用本方法。
(参考文献;蔗糖酶的分离提纯及酶促)
4.2,材料与方法
4.2.1材料
⏹试剂:
试剂A:
碱性铜试剂(碱性);试剂B:
酚试剂,黄色试剂,保存在棕色瓶中;标准浓度牛血清白蛋白溶液(200ug/ml);Na2WO4·2H2O;Na2MoO4·2H2O;85%H3PO4;浓HCl;Li2SO4·H2O;溴水;酚酞指示剂;Na2CO3;NaOH;CuSO4·5H2O;酒石酸钾钠;牛血清白蛋白。
所用试剂均为化学纯或分析纯。
⏹器具:
①721分光光度计②刻度吸管0.5ml(*1),2ml*2,5ml*1③试管1.5cm*15cm(*8)④恒温水浴槽
4.2.2,方法
4.2.2.1蛋白质含量标准曲线绘制
⏹Folin-酚反应
所加试剂/ml
管号
0
1
2
3
4
5
标准牛血清蛋白液/ml
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
水/ml
4.5
4.3
4.1
3.9
3.7
3.5
试剂A/ml
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
摇匀,静置10min
试剂B/ml
第一次
0.3
0.3
0.3
0.3
0.3
0.3
立即迅速充分混合,加一管摇一管,静置10分钟
第二次
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
立即迅速充分混合,加一管摇一管,55℃5min,注意水浴锅水位足够,取出试管置于冷水冷却1Min
总体积/ml
6.0
6.0
6.0
6.0
6.0
6.0
OD660
⏹测吸光值:
OD660nm;0号试管作对照
⏹绘制标准曲线:
横坐标为标准蛋白质微克数,纵坐标为吸光值。
⏹未知蛋白质浓度测定
样品稀释
A
B
C
D
稀释比例
1:
100
1:
100
1:
20
1:
1
稀释方法
0.5ml原液:
50ml容量瓶
0.5ml原液:
50ml容量瓶
0.5ml原液+
9.5ml移液管量取
不稀释
测样品蛋白含量
试剂量/ml
所加试剂
管号
A0
A1
B1
C0
C1
D0
D1
样品稀释液/ml
移液管:
酶液
0
0.5
0.5
1/20Tris
0.5ml
0.5
Tris3ml
3
水/ml
4.5
4.0
4.0
4.0
4.0
1.5
1.5
试剂A
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
试剂B
第一次
0.3
0.3
0.3
0.3
0.3
0.3
0.3
第二次
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
总体积/ml
6.0
6.0
6.0
6.0
6.0
6.0
6.0
OD660nm/A
4.3,结果与讨论
各样品测定结果表
管号
项目
A1
B1
C1
D1
OD660nm/A
0.414
0.224
0.406
0.155
蛋白含量/mg
0.116
0.058
0.106
0.038
总蛋白/mg
139.2
96.00
30.24
0.0760
比活力(U/mg)
37.8
26.0
67.2
3498.7
各提取液酶活力等比较
总体积/ml
总酶活/U
总蛋白/mg
比活力/U/mg
蛋白回收率%
酶活回收率%
纯化倍数/倍
初提液A
6.0
5265
139.2
37.8
100
100
1
热提取液B
6.0
2494.8
96.0
26.0
69.0
47.4
0.69
乙醇提取液C
6.0
2031.8
30.23
67.2
21.7
38.6
1.78
柱分离液D
6.0
265.9
0.456
3498.7
0.33
5.1
92.56
标准曲线线性程度不是很高,可能由于移液时产生误差或放试剂B时没有严格控制时间,混合不够充分。
纯化倍数逐渐提升,但第二组比较低,可能由于第二组的纯化时,操作产生了误差。
4.4结论
本次实验利用了Folin-酚原理,该实验方法灵敏度高,但蛋白质浓度和光密度的线性关系不够严格,而且不同的蛋白质的Tyr和Typ含量不同,显色程度也会有差异,所以造成了实验的一些误差,使制作的曲线线性程度不够,且B的纯化倍数<1.另实验中的一些操作不规范,也可能导致实验结果产生误差,故在实验中必须规范实验操做,仔细滴加试剂,减小实验误差。
5,微量凯氏定氮法测总蛋白氮
5.1,文献综述:
凯氏定氮法是测定化合物或混合物中总氮量的一种方法。
即在有催化剂的条件下,用浓硫酸消化样品将有机氮都转变成无机铵盐,然后在碱性条件下将铵盐转化为氨,随水蒸气馏出并为过量的酸液吸收,再以标准碱滴定,就可计算出样品中的氮量。
由于蛋白质含氮量比较恒定,可由其氮量计算蛋白质含量,故此法是经典的蛋白质定量方法。
蛋白质是含氮的有机化合物。
食品与硫酸和催化剂一同加热消化,使蛋白质分解,分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。
然后碱化蒸馏使氨游离,用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定,根据酸的消耗量乘以换算系数,即为蛋白质含量。
(参考文献:
微量凯氏定氮法测定食品中粗蛋白的含量)
5.2,材料与方法
5.2.1,材料
⏹试剂:
(1)蛋白样品:
2g牛血清蛋白溶于0.9%NaCl溶液并稀释至100
(2)98%浓硫酸。
(3)硫酸钾3份与硫酸铜1份(w/w)混合研磨成粉末。
(4)30%NaOH溶液:
30g氢氧化钠溶于蒸馏水,稀释至100ml。
(5)2%硼酸溶液:
2g溶于蒸馏水,稀释至100ml。
(6)混合指示剂:
0.1%甲基红乙醇溶液与0.1%
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