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这对新近提出的丝虫病作为一种可被消灭的疾病和把消灭疾病作一个全球性的公共卫生问题的世界大会决议的实施起着重要的作用。
主 要 参 考 文 献
1 AlexanderNDetal.AmJTropMedHyg,1999;
61(2:
319-324
2 AmaralFetal.AmJTropMedHyg,1994;
50
(6:
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3 ChanteauSetal.IntParasitol,1995;
25(1:
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178(4:
1133-1138
(收稿日期:
2002年3月26日
人类蠕虫线粒体基因组及其在种群遗传学
和种系发生学中作为标记的应用
第一军医大学热带医学研究所 骆利敏编译 李 明 吴英松审校
摘 要 目前己报道了100多种寄生虫的全长线粒体基因组。
本文主要总结了后生动物门的线粒体基因结构,并且回顾了人类线虫和扁虫线粒体基因组的研究状况。
一些蠕虫的全长或近于全长的线粒体基因组的发现,为蠕虫的种系发生分析和遗传变异性研究提供了极为丰富的遗传标记。
本文举例说明了线粒体基因组在蛔虫、盘尾丝虫、血吸虫、片形属吸虫、并殖吸虫、棘口吸虫、棘球绦虫和绦虫属的研究中的应用。
关键词 蠕虫 线粒体 基因组 种群遗传学、种系发生学
1 线粒体基因组简介
细胞核携带着细胞的遗传信息,指导着细胞内大部分生命活动。
但是,几乎所有的真核细胞还包含可以和细胞核基因组协同作用
的线粒体基因组。
在脊椎动物门,线粒体DNA(mtDNA是以多拷贝形式存在的,通常一个细胞中包含了100-1000拷贝的线粒体DNA。
这些线粒体DNA决定着合成ATP的呼吸酶链复合体中12-13种蛋白的表达,而线粒体的其它成份则由细胞核基因组编码并通过特殊的转运系统转运入线粒体。
线粒体基因组被认为是纯系的,很少或从不重组。
父系线粒体基因很少进入合子,即使进入也不能持久,因此,线粒体DNA是母系遗传的。
除了某些刺胞动物(比如说水螅属动物,所有动物都包含了小的环形的线粒体分子,大小约在14-40kb之间,其中大部分在16-20kb之间。
目前为止,已报道了100多种不同种类寄生虫的全长线粒体基因组,其中约有70种来自脊索动物门。
除了少数例外,不同种属的线粒体基因组的组成和核苷酸序列是高度保守的,大部分线粒体基因组包含了37个遗传因子:
2个核糖体RNA,22个转运RNA,13个蛋白编码基因。
基因组结构是致密的,部分基因重叠,但大部分基因是彼此毗连的,或者被短的基因间隔区隔开。
在后生动物门,线粒体包含了至少一个相对大的非编码区基因,后者阻碍了启动子的启动转录作用。
在脊椎动物中,该非编码区被称为D-环结构,在其它分类群中,它指的是富含A和T的区域或指控制区域。
线粒体基因组的通用密码子和其它特征是不同于细胞核基因组成的,这反应了线粒体的真菌性起源。
和核基因组相同,线粒体基因组蛋白编码区的转录起始密码子是蛋氨酸密码子ATG。
但在其它无脊椎动物种群,转录起始密码子可以是ATT,ATA,或GTG。
2 寄生性蠕虫的线粒体基因组
第一个被报道的寄生性蠕虫全长线粒体基因组是猪蛔虫(Ascarissuum的线粒体基因组,而且还获得了非植物寄生性线虫(Meloidogynejavanica和寄生性蚊(Ro-manomermisculicivorax的全长线粒体DNA序列。
之后被进行全长测序的寄生性线虫线粒体基因组是盘尾丝虫(Onchocercavolvulus的mtDNA,基因组大小为13747kb,比猪蛔虫略小一些。
与线虫形成鲜明对比的是,我们对于扁形动物的了解,到目前为止,仍是非常局限的。
直到1999年,第一个全长线粒体基因组序列,多房棘球绦虫(Echinococcusmultilocu-laris的线粒体基因组,才被存放入Gen-Bank数据库(GenBank登录号AB018440。
虽然,肝片形吸虫(Fasciolahepatica的部分线粒体DNA序列早就被获得。
Zurita等(1998建立了cDNA文库并发现了一个包含rrnL基因的长约710个碱基的部分转录子的克隆。
Gary和Wolstenholme(1998合成了可以产生约3466个碱基长的线粒体序列的重叠基因组克隆,其中有nad1,nad3和cox1基因以及某些tRNAs。
Chapman等(1995克隆牛带绦虫的cox1基因的部分片段并进行测序。
更多的推断的线粒体DNA序列在曼氏血吸虫(Schistosomamansoni的cDNA文库被发现,而且,利用cDNA文库筛选的方法,曼氏血吸虫的nad5(1.6kb(GenBank登录号:
AF085145和cox1(1.8kb(GenBank登录号:
AF101196的全长或近于全长基因序列被存放入GenBank/EM-BL数据库。
通过获取许多扁虫(包括一些血吸虫种属的线粒体DNA序列和基因次序可以发现更多的线粒体DNA标记。
我们获得了跨越曼氏血吸虫线粒体基因组过半编码区的全长约8068bp的序列,其中包括了rrnL,rrnS,cox3,nad3,nad4,nad6,apt6和预期的22种tRNA中的10种tRNA的全长序列以及cox1,nad2和cob基因的非全长序列。
所获得的曼氏血吸虫巴西株(ms-BRE-1的部分线粒体DNA序列(总长约8kb被
用于设计低聚寡核苷酸,而后者则被用于扩增波多黎各株线粒体基因组的长PCR技术中。
长约8.8bp的重叠片段被产生,克隆和用引物walking法测序,巴西株和波多黎各株的基因序列几乎是相同的。
曼氏血吸虫中存在非编码可变区VNR(variablenon-codingregion。
Despres等在以往的工作基础上,用不同的限制性内切酶消化不同株的曼氏血吸虫的线粒体DNA,发现在8株非洲和拉丁美洲曼氏血吸虫中,基因组的长度从16.6kb变化到24.9bp。
其中ms-BRE-2株和ms-VEN-1株的长度异质性表明,在血吸虫种群中发生了组织变形(两个线粒体分子组织在同一个体中。
株间的长度区别是因为该分子的部分片段内部无限制性酶切位点(在剩余的15kb片段中,发现了多个限制性酶切位点,这证明了可变区域包含了相对短的重复序列或简单序列片段,这也是其它种属动物非编码区的典型特征。
与此相似的是,当Pena等在1995年消化曼氏血吸虫巴西株的线粒体DNA(基因组长度约为23kb时,观察到一个长约9.4kb的片段(与Despres等在1991和1993年的研究中发现的可变区域相对应,在其中没有所应用的9种限制性内切酶中任何一种酶的识别位点。
当用DdeI酶切时,该片段消失,琼脂糖凝胶电泳分析出现了约620bp的主要条带和一些比较小的条带。
进一步的实验和测序表明,可变区域包含了由558bp和62bp两种重复基序组成的一个大的多态小卫星DNA。
该小卫星区域的PCR扩增被用于光滑双脐螺(B.glabrat中曼氏血吸虫感染的检测。
有趣的是,不管是大片段重复基序,还是小片段重复基序,都和SM750分子克隆有显著的相似性。
较小的片段和该分子的多态性重复基序相同,而后者在SM750中除了以串联的5个拷贝形式表达外,还贯穿了整个基因组,尤其在转录子中,含量更为丰富。
3 线粒体DNA序列变异用作种群遗传学和种系发生研究的标记
动物线粒体DNA序列的进化要快于细胞核基因,适合于区别亲缘关系较近的生物有机体。
事实上,我们关于许多真核生物种群进化和种群遗传学的了解在很大程度上要归功于线粒体DNA的研究。
而且,线粒体基因组中的突变和基因重组通常并不复杂且具有种属特异性,因此对于种间和种内变异的研究具有巨大价值。
从线粒体基因组获得的序列提供了优良的分子标记,该标记可用于种群分类,跟踪某一个体或与该个体相关的特殊种群的遗传史,可用于构建系统发生的分类学分支。
不同编码区的突变发生率差异很大,因此,在回答关于生物学关联性的特殊问题时,它们作用也是不同的。
rRNA和tRNA的基因序列最保守,而非编码调控区,无论是基因长度还是核苷酸序列,在基因组中都是变异最大的,该区被用于脊椎动物许多种内特异性研究,但是关于它们的结构和在无脊椎动物中的应用,人们知之甚少。
众所周知,营自由生活的生物体在许多重要的生物学特征上有变异,对于寄生虫来说,情况是一样的。
因为这些变异与流行病学的关联性,对它们进行研究就变得极为重要。
变异性是种群分子发展进化的结果,对实验数据的解释也必须考虑到这一点。
某些蠕虫种群的全长或近于全长线粒体DNA序列的获得,为蠕虫种群种系发生分析和遗传变异研究提供了极为丰富的遗传标记。
下面将简述线粒体DNA在蛔虫、盘尾丝虫、血吸虫、片形属吸虫、并殖吸虫、棘口吸虫、棘球绦虫和绦虫属的研究中的应用。
3.1 蛔 虫
关于人蛔虫和猪蛔虫的分类学状况,存在许多争议。
事实上,关于人源性蛔虫是否与猪源性蛔虫有显著不同,也引起了很多争论。
虽然进行了关于该主题的研究,实验性交叉宿主传播也已证明人类蛔虫可以感染猪,反
之亦然,这种争议仍在继续。
以线粒体DNA和细胞核rRNA为标靶的DNA方法也未能解决这个问题。
在世界上很多区域都发现,蛔虫亚种在人类和猪类中同域分布,事实上,从两种宿主获得的寄生虫在形态学和生物化学标准上是无法区分的,这说明这两种寄生虫应被看作同胞株。
该问题的最后解决需要这两种寄生虫的相互交配试验,并对子代进行分子水平上的分析,以决定是否成功地获得了杂交子代。
3.2 盘尾丝虫
在热带和亚热带非洲、亚洲、南太平洋地区、中美洲和南美洲的隔离区,盘尾丝虫属感染仍是威胁人类健康的一大问题。
一系列研究提供的间接证据表明,病原性寄生虫旋盘尾丝虫是一个突出的遗传变种。
除了0-150序列,盘尾丝虫属的DNA变异水平比较局限。
对盘尾丝虫属的高变AT区,用PCR-RFLP组合方法和直接测序法进行研究,来自非洲东部和西部的6个不同的地理区域的11个被检查个体中,仅发现了非常有限的变异,美洲的情况也一样。
3.3 血吸虫
在寄生于人类的血吸虫中,感染性、致病性及免疫原性是遗传变种的生物学特征。
为了研究血吸虫线粒体DNA的相对进化频率,Despres等在1991-1993年用RFLP法绘制线粒体基因组图谱,用测序分析法比较许多非洲和拉丁美洲起源的曼氏血吸虫rrnL基因。
不同类型间的核苷酸差异在0.35%-1.42%之间。
用PCR扩增和直接测序法获得了曼氏血吸虫和日本血吸虫的cox1基因的372bp片段,日本血吸虫的nad1基因474bp片段,同时还获得了湄公血吸虫和日本血吸虫中国大陆、中国台湾、印尼、日本和费城不同地理分离株的cox1基因序列。
Bowles等在1995年还获得了埃及血吸虫和间插血吸虫的cox1基因序列。
用相同的方法,对日本血吸虫的浙江、安徽、江西、湖南、湖北和四川等地理分离株的nad1基因的474bp序列进行了测定。
总体看来,日本血吸虫各地理分离株的cox1基因和nad1基因的序列分析结果表明株间的变异水平非常低。
Bogh利用SSCP法可以真实地显示cox1和nad1基因片段的低水平变异,从而为日本血吸虫种群遗传结构和生物学的研究,为线粒体DNA的遗传分析提供了重要线索。
而且,Sorensen和他的工作组能够用nad1基因作为遗传标记检出日本血吸虫在终宿主内的持续性感染,或将该标记用于猪和鼠体内血吸虫感染的种群动力学研究。
对从中国获得的不同地理分离株的日本血吸虫的nad1基因的474bp片段,用PCR扩增和直接测序法进行分析,结果提示了非常有限的序列变异(0-0.6%。
然而,nad1序列以PCR为基础的RFLP分析显示,在四川省的一个分离株中,有个核苷酸的差异是性特异性的,表明日本血吸虫的线粒体DNA并非总是母系遗传的。
进一步研究发现,从安徽省收集的地理分离株中,nad1序列的某种程度的分离株间变异是明显的。
但在从某些省收集来的分离株库中,该现象并不明显。
从安徽省直接收集来的少数变种的nad1序列中含有RsaI限制性酶切位点(在第195位核苷酸位点这个限制性位点在浙江分离株的所有个体中得到验证。
当用PCR-RFLP法区别日本血吸虫的安徽分离株和浙江分离株时,人们利用了它们之间的这种差异。
在用不同的寄生虫株进行持续性诱发感染试验以描述日本血吸虫的群组分类轮廊图时,nad1序列中的RsaI位点的存在或缺失提供了极为有用的标记。
3.4 片形属吸虫
在片形属吸虫中最常见的种类是形态上较为特别的巨片形吸虫(F.gigantica和肝片形吸虫(Fasciolahepatica。
前者在较温暖的地方较易发现,而后者喜较冷的地区。
它们的地域分布有交叉。
在日本,发生了较为少见
的现象,即所有的肝吸虫标本均为单性生殖的,其中有许多是三倍体(虽然也发现了单倍体和多倍体。
而且它们在形态上发生了很大变异,从而为分类学带来了很大混乱。
其中一些标本与肝片形吸虫类似,一些和巨片形吸虫类似,而其余的则是介于两者之间的中间形态。
应用分歧酶进行的研究发现,在日本单性生殖三倍体中有3种不同的基因型,这说明三倍体的出现已不止一次了。
该谱系中的某一种的某些等位基因的表达,与美国和澳大利亚的肝片形吸虫相类似,虽然有人认为日本血吸虫是肝片形吸虫和巨片形吸虫的杂交产物,但该研究并没有包括巨片形吸虫的标本。
Southern杂交试验、rDNA基因测序和线粒体cox1基因测序的结果表明,日本血吸虫在遗传学上非常接近于巨片形吸虫。
用RFLP方法比较从日本、马来西亚的肝片形吸虫和澳大利亚的肝片形吸虫获得的部分纯化线粒体DNA,观察到的系谱有明显的地理差异,但更多的区带表现为介于日本血吸虫和巨片形吸虫标本之间,而不是它们中的某一种或澳大利亚肝片形吸虫。
3.5 并殖吸虫
已经报道的并殖吸虫大约有50种,在种群水平上,线粒体序列(与细胞核基因ITS2序列连接通常被用于检查种中间某两组是否具有同一性。
根据线粒体cox1基因构建的种系发生树表明,中国、日本、朝鲜和中国台湾的并殖吸虫在亲缘关系上很接近。
在上述区域内,并殖吸虫的单倍体,单性生殖三倍体均可被发现。
这些并殖吸虫通常是同域分布的,在中国的东北部还发现了并殖吸虫的四倍体。
三倍体形态较大,可以产生较多的卵细胞,而且在人体内具有比单倍体更强的致病性。
在并殖吸虫的其它分布区域内,仅有单倍体存在。
三倍体不能凭借它们的线粒体cox1基因和单倍体相区别。
也有学者认为,三倍体是一个独立的种属,但是该假说到目前为止无任何数据上的支持。
从线粒体和细胞核基因组得到的证据表明,三倍体谱系可能出现了不止一次。
南亚的卫氏并殖吸虫在线粒体cox1基因序列上彼此有很大不同,和东亚种群的线粒体cox1基因序列尤为不同。
南亚种群和东亚种群有显著不同,因此它们寄生在不同的螺宿主中。
存在于日本的并殖吸虫有大平并殖吸虫(P.ohirai和佐渡并殖吸虫(P.sadoensis,它们的成虫无显著区别,但它们的囊蚴包囊形态和中间宿主特异性有显著差别。
大平并殖吸虫和怡乐村并殖吸虫(P.iloktseunensis包囊间的不同可能归因于一个简单的遗传多态性。
分歧酶研究和实验性交叉感染表明,所有存在于日本的并殖吸虫都可以互换基因,有人认为,所有的3种并殖吸虫都是同种的,线粒体cox1基因序列分析支持这一观点。
使用线粒体基因序列研究并殖吸虫种属在分子水平上的种系发生,使对一些不同种属的并殖吸虫的认识成为可能,其中有一些种属以往尚未被发现。
如卫氏并殖吸虫和暹罗并殖吸虫(P.siamensis组成了一个新的种群,该种群内含有正并殖吸虫属(Eu-paragonimus的共同基础,因此正并殖吸虫属种群可能被归入并殖吸虫一类。
而且发现,来自日本的宫崎并殖吸虫(P.miyazakii和来自中国的斯氏狸殖吸虫(Pg.skrjabini有密切关系,这两个种属的并殖吸虫在人体内引起的疾病具有类似症状。
但是,在形态学上,有些研究者把斯氏狸殖吸虫归入一个独立的狸殖(吸虫属(Pagumogonimus。
3.6 棘口吸虫
虽然棘口吸虫属的大部分成员是从其它哺乳动物和鸟类研究中发现,但有一些棘口吸虫属成员还是可以感染人类的。
该种群内的分类主要依赖形态学上的差别以及很难获得的生活周期的细节。
因此,分子遗传学工具被用来承担这项任务,就丝毫不令人吃惊了。
线粒体序列(cox1和nad1被用来鉴定每个种属以及它们相互间的关系。
・26・2003年1月 第30卷 第1期3.7 棘球属绦虫细粒棘球绦虫幼虫是胆囊棘球蚴病(CHD的病原体。
在直接对比试验中,棘球蚴的变异是非常局限的。
在早期研究中,研究虫株特性通常使用病理学和生物化学方法,如同工酶标记。
但后来,更灵敏的分子技术被用于区分不同的种属和虫株。
cox1和nad1基因的序列比较,包括使用SSCP方法进行的序列比较,使目前已知的4种棘球属绦虫和棘球绦虫的遗传变异株的区别鉴定成为可能。
目前已发现9种基因型(G1-G9。
虽然通常是普通绵羊株基因型(G1与人类感染有关,但并不总是只有G1型与人类感染有关,其它基因型也可感染人类,只是感染力强弱不同。
以从不同国家收集的棘球绦虫为原材料,利用基因型和相关的DNA技术进行虫株调查,以描绘目前已知基因型的宿主及地理分布范围。
线粒体DNA数据已和细胞核DNA序列(核糖体ITS1结合起来,用以协助解决棘球属绦虫不同种和虫株间的种系发生问题。
3.8 绦 虫人类了解较深入的牛带绦虫(Taeniasaginata和猪带绦虫(T.solium是重要的人类寄生虫。
另外一种人类绦虫,亚洲带绦虫(Taeniaasiatica也在东亚发现。
因为它最早在中国台湾被发现,因此也被称为台湾绦虫。
现在有证据表明,这种寄生虫还存在于其他地区,包括朝鲜、印尼和泰国。
形态学证据表明,台湾绦虫病的病原体是牛带绦虫。
但常在不吃牛肉的山区居民中发生绦虫感染,而且在台湾不发生牛囊尾蚴病,这就促使人们重新检验对台湾带绦虫感染病原体的认识。
研究发现,台湾带绦虫感染不通过牛宿主,但要以一种野生的食草动物作为中间宿主。
现在,人们相信台湾带绦虫的中间宿主是猪,虽然在猪体内,绦虫的囊尾蚴阶段发生在肝脏内。
而牛带绦虫和猪带绦虫的囊蚴多位于肌肉内。
在这基础上,联系到在台湾带绦虫和牛带绦虫的幼虫阶段所观察到的形态学上的不同,尽管这两种绦虫的成虫形态是一样的,人们已接受这两种绦虫不属于同一分类群的说法。
从cox1基因和rDNA以及后来的nad1基因获得的序列数据表明,亚洲带绦虫是一个不同的群体。
但是,以cox1基因为基础的绦虫属绦虫的种系发生分析又证实了亚洲带绦虫和牛带绦虫有密切关系的观点。
猪带绦虫囊尾蚴病是严重的慢性感染性疾病。
但是牛带绦虫囊尾蚴病,在人类很罕见。
亚洲带绦虫和牛带绦虫关系更为密切,而不是和猪带绦虫,它和人类健康的关联就是,亚洲带绦虫不可能成为人类囊尾蚴病的重要病原体,现在的研究已积累了很多支持上述观点的证据。
4 展 望本文所报道的研究重在阐述通过研究人类蠕虫线粒体基因组,可以为种间和种内差异性研究,为解决种群遗传和进化中的问题以及为分子水平种系发生图的构建提供有用的标记。
希望在未来几年内,人类蠕虫线粒体基因组的全长或近于全长序列报道会更多。
这将使许多种属内用于线粒体基因扩增的通用引物的设计更为容易,从而为解决本文中提到的那些尚未解决的问题提供更多的有用的标记。
这也将使线粒体基因组和基因自身的进化进程的研究成为可能。
主要参考文献1 AndersonTJCetal.Parasitology,1997;
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115(3:
2592634 BlairDetal.Parasitology,1999;
119(3:
303313(收稿日期:
2002年3月21日
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- 人类 蠕虫 线粒体 基因组 及其 种群 遗传学 种系 发生 作为 标记