基于同源基因功能分化的药用植物活性成分变异机制研究.docx
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基于同源基因功能分化的药用植物活性成分变异机制研究
基于同源基因功能分化的药用植物活性成分变异机制研究
[摘要]在中药材质量控制研究领域,药用植物活性成分变异机制研究始终是重点和热点问题。
随着高通量测序技术的发展和成本的降低,大量药用植物基因序列克隆为进一步研究基因序列的遗传信息与其所执行的生物学功能奠定了基础,也为从分子生药学角度探索药材活性成分变异及其质量控制提供了有力条件。
该文详细介绍了同源基因、基因重复的概念和分类,并重点展望了重复基因功能分化在药用植物活性成分变异分子机制研究中的作用,旨在为药材质量控制基础研究提供新的思路。
[关键词]基因复制;功能分化;活性成分;变异
Differentactiveingredientsofmedicinalplantbasedonfunction
differentiationofhomologousgene
YUANYuan<sup>/1</sup>,YUJun<sup>/1</sup>,HUANGLu-qi1*,WANGXu-min<sup>/1</sup>
(1.StateKeyLaboratoryofDao-diHerbs,NationalResourceCenterforChineseMateriaMedica,
ChinaAcademyofChineseMedicalSciences,Beijing100700,China;
2.KeyLaboratoryofGenomeScienceandInformation,ChinaAcademyofScience,Beijing100029,China)
[Abstract]IntheresearchfieldofqualitycontrolinChinesemedicinalmaterials,variationinactiveingredientsofmedicinalplantisalwaysthekeyandhotissues.Withthedevelopmentofhigh-throughputsequencingtechnologiesandreducingcost,alargenumbersofgenesfrommedicinalplantwerecloningandprovideasolidfoundationforfurtherresearchofgenestructureanditsbiologicalfunction,andalsoprovidesconditionsforexploreactiveingredientvariationanditsqualitycontrolfromtheperspectiveofmolecularpharmacognosy.Thispaperintroducestheconceptofhomologousgene,geneduplicationandclassification.Weprospectthefunctionofduplicatedgenesintheroleofmolecularmechanismresearchaboutvariationinactiveingredients,aimingatprovidinganewwayformedicinalmaterialsqualitycontrol.
[Keywords]genereplication;functionaldifferentiation;activeingredients;variation
doi:
10.4268/cjcmm20150607
搞清药用植物活性成分变异的机制一直是中药资源和中药鉴定研究领域的热点问题,其对于药材质量控制具有重要的意义。
中药材来源复杂,表现为同属多来源药材均可作为一种药材入药,如膜荚黄芪和蒙古黄芪均为药材黄芪的基原植物;同一药材不同部位也可作为不同药材使用,如葫芦科植物栝楼或双边栝楼的干燥成熟果皮可作为瓜蒌皮使用,干燥成熟种子可作为瓜蒌子使用,干燥根可作为天花粉使用;不同产地的药材,其化学成分也因所生长环境的不同而不同。
尽管入药物种或部位具有相似性,但在药效上仍然存在一定的差异。
药效上的相似与差异主要由活性成分的异同来决定,而目前中药活性成分评价主要集中在化学和药理学领域,但由于植物中存在数以万记的化合物,利用化学分析手段始终不能满足对中药材所有成分进行分析,因此存在着一定的缺陷。
利用药理学手段进行评价则需要选择合适、可靠的药理研究模型,工作量较大。
从植物本身来看,活性成分的形成和积累与其体内基因及基因调控网络密切相关,即活性成分的异同是由基因的变异决定的。
随着高通量测序技术的发展和成本的降低,已经有大量的药用植物通过RNA-seq进行了转录组研究,获得了基因序列。
然而,完成转录组测序仅是功能基因组研究的第一步,更大的挑战在于搞清基因序列的遗传信息与其所执行的生物学功能。
本文详细介绍了同源基因、基因重复的概念和分类,并重点展望了重复基因功能分化在药用植物活性成分变异分子机制研究中的作用,旨在为药材质量控制基础研究提供新的思路。
1同源基因的正确注释是研究药用植物活性成分变异的重要前提
研究基因序列的遗传信息与其所执行的生物学功能,首先取决于对基因序列的正确注释。
目前基因注释的方法主要依赖于生物信息学分析,同源性在基因注释中是一个极其重要的概念,同源基因一般不会有完全一致的核苷酸序列,因为同源基因在出现后会独立的发生随机突变,但它们的序列组成相似,大部分未突变的核苷酸位置相同。
因此,一个新的基因序列被确认后,根据同源性可从数据库中找到已知序列的同源基因,并依据进化的相关性可从已知同源基因推测新基因的功能。
同源基因分为直向同源基因(orthologousgene)和共生同源基因(paralogousgene)两类。
1.1直向同源基因与种间变异直向同源基因指2种或2种以上不同物种之间的同源基因,它们来自物种分隔之前同一祖先的同源序列。
直系同源的序列通常具有相似的结构和生物学功能<sup>[1]</sup>,即功能高度保守甚至近乎相同,且其在近缘物种间可以相互替换,一般是编码生命活动必需的关键性调控蛋白、酶或辅酶的基因<sup>[2]</sup>。
基因组学、功能基因组学、分子系统学、进化生物学等生命科学领域多个学科的研究均依赖于直系同源基因的识别,如物种新发现基因的功能预测、系统发生关系的构建及重现基因的进化历史等。
许多直系同源基因均具有序列变化速度与进化距离相当、调控途径相似且能够重现物种进化历史等特征。
由于系统发育树的构建需要不同群体间的直系同源基因,因此完整、正确的直系同源基因识别是重现基因进化过程重要的前提<sup>[3]</sup>。
目前发现的功能千变万化的基因最初都是由少量祖先基因通过基因加倍、变异和功能域重组产生的。
因此,通过基因序列的比较,可从同一物种或不同物种中找到同源的基因成员。
随着药用植物转录组数据的增加,鉴定和区分这些具有相同或者不同功能的同源基因<sup>[4]</sup>以及对控制元件进行识别<sup>[5]</sup>,已成为药用植物功能基因组研究的重要内容之一。
同时,识别直系同源基因可以帮助重建进化历史,了解垂直遗传关系和谱系特有的基因丢失以及基因水平转移,对于解析药用植物种及品种间活性成分变异将具有重要的意义。
1.2共生同源基因与药用植物器官间活性成分变异共生同源基因(paralogousgene),指同一物种内部的同源基因,其常为多基因家族的不同成员,其共同的祖先基因可能存在于物种形成之后,也可能存在于物种形成之前。
祖先基因的复制及其突变形成了基因家族,这是增加基因组复杂性的一个重要途径。
多基因家族是真核生物基因组的共同特征,即因基因加倍和趋异产生了许多在DNA序列组成上基本一致而略有不同的成员。
同一家族的基因成员在序列组成上相似,且担负类似的生物学功能,如苯丙氨酸解旋酶(PAL)在金银花中存在3个成员,在黄芩中存在4个成员,这些基因成员具有相似的功能,但它们在个体发育的不同阶段表达。
比较基因家族中各个成员间的序列差异,可追踪基因的进化轨迹<sup>[6]</sup>,研究基因复制及功能分化对于解析药用植物器官间活性成分变异将具有重要的意义。
2重复基因的功能分化是形成药用植物活性成分变异的基础
2.1基因重复基因重复现象是生物界广泛存在的,遍布原核和真核生物,特别是高等被子植物在进化过程中由于经历了多次多倍化过程,产生了大量的重复基因。
由于重复基因的进化可以诱导基因表达模式的分化从而满足物种发育的需求,因此基因重复是推动植物进化最重要的驱动力,也是产生新功能基因的重要来源。
研究重复基因对于揭示重复基因结构变异及其功能分化具有重要意义。
根据重复区域的大小,基因重复可分为:
小规模基因重复,即单个基因重复;大规模基因重复,包括部分基因组重复以及整个基因组重复(多倍体化)<sup>[7]</sup>。
单个基因和部分基因组重复主要通过不等交换产生,而全基因组重复是由有丝分裂或减数分裂过程中的错误引发决定的<sup>[8]</sup>。
单个基因重复可以导致同一个基因组内存在2个或2个以上拷贝(copy)的同源基因序列,从而可能造成功能上的冗余(redundant)<sup>[9]</sup>,并受到剂量效应的调节<sup>[10]</sup>。
2.2重复基因的亚功能化与新功能化由于通过基因重复拷贝不同的表达分化以及选择作用可以促使植物加快应对胁迫环境生理反应机制的进化<sup>[11]</sup>,从而产生适应特殊环境条件的多样性形态特征<sup>[12]</sup>,所以基因重复在植物环境适应性及进化过程中起着重要作用。
重复基因的保留机制一直是人们关注的热点问题之一。
经过自然选择的作用,保留下来的重复基因,除了因其中1个拷贝发生突变导致非功能化(nonfunctionalization)而形成为假基因(pseudogene)外,大致面临以下2种不同的命运<sup>[13]</sup>:
新功能化(neofunctionalization),即其中1个拷贝保留了原始的功能,另1个拷贝获得了新的功能。
重复基因间的表达分化是重复基因产生新功能非常重要的一步<sup>[14]</sup>,其可以提高基因的功能和表达的复杂性,有助于促进植物形成特异性的防御机制<sup>[15]</sup>。
由于选择压力的松弛,基因重复产生的冗余基因得以在加速碱基替换速率的同时,各自积累不同的遗传变异,使基因的结构和功能发生改变,分化产生适用于新的生存环境相应的功能或表达调节机制。
所以环境胁迫相关联的重复基因,包括大量作为植保素的次生代谢产物相关重复基因,更倾向发生基因表达分化。
亚功能化(subfunctionalization),即2个拷贝发生了亚功能化,分担了原基因的功能,而它们合起来的功能则涵盖了祖先基因功能。
基因亚功能化同样也主要是由于自然选择压力松弛,导致重复基因不同拷贝的表达具有时空性,即在表达时间和组织特异性方面产生明显分化,且各自分担了祖先基因的部分功能而被选择作用所保留<sup>[16-17]</sup>,且突变积累主要发生在基因表达或转录调控区。
随着基因组研究的深入,重复基因保留进化模式也被不断的更新和完善,在一定范围内阐释重复基因不同水平的进化方式。
其中DDC(duplicationdegenerationcomplementation)模型,即重复基因亚功能化拷贝可被随机遗传漂变保留固定,拷贝间功能互补,共同完成原祖先基因的功能<sup>[18]</sup>;SNF(subneofunctionalization)模型认为,在长期进化过程中,发生亚功能化的基因可能各自形成了新的功能<sup>[19]</sup>。
3药用植物基因功能分化决定其活性成分的变异
3.1活性成分部位差异的分子机制药材赤芍和白芍均来源于植物芍药Paeonialactiflora的干燥根,长久以来关于它们的分类标准始终存在争论,如花色、产地、加工方式等<sup>[20]</sup>。
目前市场上出售的白芍一般为去皮干燥根,而赤芍为干燥根,本课题组首先利用芍药转录组数据获得芍药苷(paeoniflorin)和没食子酸(gallicacid)生物合成途径关键酶基因家族成员序列,并分别选择具有相同成分的牡丹转录组和不具有芍药苷、具有没食子酸的石榴Punicagranatum、刺果毒漆藤Rhusradicans、马桑Coriarianepalensis转录组中的直向同源基因作为对照,构建系统进化树<sup>[21]</sup>。
在此基础上,对14个活性成分相关同源基因功能多样性进行预测。
结果表明,芍药没食子酸生物合成途径中的PLaroDE共生同源基因可能具有相同的功能,而它们的直向同源基因在石榴、刺果毒漆藤、马桑中也存在。
结合基因表达分析结果,预测aroDE同源基因在芍药的不同组织中具有相似的表达谱,且与芳香族氨基酸含量有关。
芍药苷生物合成途径上的PLDXPS共生同源基因可能具有不同的功能,且在芍药不同组织中的表达谱不一致,暗示其功能分化可能影响化学成分的分化。
通过比较芍药根与根皮基因表达谱,还发现芍药苷及其芳香族氨基酸衍生物生物合成相关基因PLaroDEs,PLMVK,PLPMK,PLMVD1在根皮中的转录水平显著高于去皮根,与根皮中该类成分含量高一致,支持了依据根皮的有无作为药材白芍、赤芍分类的标准。
3.2活性成分物种差异的分子机制2010年版《中国药典》中收载的金银花类药材包括两类,即金银花(忍冬)、山银花(红腺忍冬、华南忍冬、红腺忍冬、黄褐毛忍冬)。
绿原酸和木犀草苷是金银花的主要活性成分,本课题组<sup>[22]</sup>对金银花转录组进行分析,共获得14.9GB数据,对获得的数据进行分析,共获得4万余个UniGene。
以金银花化学成分为切入点,围绕酚酸类、萜类、脂肪酸生物合成途径,初步构建了金银花活性成分基因调控网络,筛选获得用于评价金银花化学质量的关键酶<sup>[23]</sup>。
在此基础上,重点比较了忍冬与红腺忍冬、灰毡毛忍冬<sup>[24]</sup>、华南忍冬<sup>[25]</sup>中绿原酸和木犀草素生物合成途径关键酶同源基因的结构及其在花蕾和叶中表达模式的变异,其与活性成分变异具有一致性。
以上分析结果为进一步理解金银花类药材不同部位间活性成分变异以及药用物种的利用提供了依据。
3.3展望药用植物活性成分相关基因家族成员功能分化是研究基因变异决定活性成分变异机制的重要内容之一。
依赖药用植物转录组数据,克隆获得活性成分相关直向同源基因和共生同源基因,建立药用植物基因数据库。
在基因进化理论和方法的指导下,对药用植物重复基因功能分化进行分析,并与活性成分种类和数量变化相结合,从分子生药学角度揭示药用植物物种、部位、产地间活性成分差异的机制,从而为指导药材质量控制提供理论依据。
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