免疫组化真题Word文档下载推荐.docx
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2.试述石蜡切片和HE染色的大体制备进程,并指出制备免疫组化的石蜡切片和用于HE染色的石蜡切片有何不同。
P11;
P207;
P208
4.何谓免疫荧光染色,用何种方式排除非特异荧光?
P44;
P74
VASSAY检测细胞凋亡的原理、实验流程和结果分析。
答:
原理:
主若是依照细胞凋亡进程中的形态特点改变,细胞膜的改变是这些特点中较早显现的一种。
在凋亡细胞中,细胞膜磷脂酰丝氨酸(PS)从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的外侧。
Annexin-V是一种35-36KD的钙离子依托的磷脂结合蛋白,它对PS具有较高的亲和力。
细胞凋亡时,能够和外翻的PS结合,从而能够检测凋亡的细胞。
发生死亡的细胞其细胞膜上的PS也外翻,因此也会阳性。
因此,还会加一种DNA染料,经常使用的有P1。
由于死亡的细胞膜通透性增高,染料能够进入细胞内和DNA结合,从而能够发荧光,区分出死细胞。
实验流程:
1)细胞搜集:
悬浮细胞直接搜集10ml的离心管中,而贴壁细胞先用滴管轻轻吹打。
凋亡细胞一经吹打可能脱壁,搜集到10ml的离心管中,没脱壁的细胞用%的EDTA消化使之脱壁,每样本细胞数为(1-5)×
106,500~1000r/min离心5min弃去培育液。
2)用孵育缓冲液洗1次,500~1000r/min离心5min。
3)用100μl的标记溶液重悬细胞,室温下避光孵育10~15min。
4)500~1000r/min离心5min沉淀细胞,孵育缓冲液洗1次。
5)加入荧光溶液4℃下孵育20min,避光并非时振动,上机检测。
6)流式细胞仪分析:
流式细胞仪激发光波长用488nm,用一波长为515nm透带滤器检测FTTC荧光,另一波长大于560nm的滤器检测P1。
结果分析:
凋亡细胞对所有效于细胞活性鉴定的染料如P1有抗染性,坏死细胞那么不能。
细胞膜有损伤的细胞的DNA可被P1着染产生红色荧光,而细胞膜维持完好的细胞那么可不能有红色荧光产生。
因此,在细胞凋亡的初期P1可不能着染而没有红色荧光信号,正常活细胞与此相似。
6.何谓像素?
简述数码相机摄影的大体原理。
7.阻碍曝光的因素有哪些?
什么情形下利用光圈优先?
什么情形下利用快门优先?
什么情形下考虑胶片的感光度或相当感光度?
P180
8.谈谈你学习这门课的感想和体会?
并提出对这门课的建议。
作业:
设计一个自己研究领域的小实验(方式要有免疫组化技术)
1.简述广义的组织化学均包括那些要紧采纳技术?
这些技术能解决科研中的哪些问题?
广义的组织化学包括传统的组织化学,免疫组织化学、电镜组织化学、免疫电镜组织化学和原位杂交组织化学。
组织化学用于检测细胞内核酸脂类糖类和酶类等应用很广。
免疫组织化学由于特异性强灵敏度高因此应用普遍,凡是组织或细胞中能作为抗原或半抗原的物质,如蛋白质,多肽氨基酸多糖磷脂受体酶急速核酸记病原体都课用相应的特异性抗体进行检测,因此成为生物医学各学科领域的重要研究手腕。
电镜组织化学要紧用于检测一些酶的活性及其在超微结构的定位尽管目前已知酶的种类超过2200余种蛋电镜只能观看100种,其原理是酶组织化学反映进程,酶底物反映的特异性,捕捉反映(金属盐城点发嗜锇性物质生成法。
免疫电镜是依照抗原与抗体特异性结合的原理,利用电子密度标记抗体或经免疫化学反映能产生高电子产物的标记抗体在超微结构水平对抗体进行定性定位。
原位杂交是将分子杂交技术与组织化学相结合而在核酸原有的位置上进行细胞内核酸定性定位的一种技术。
更多用于定位细胞内mrna它可为研究单一细胞中编码各类蛋白质和多肽(前体)的相应MRNA定位和研究细胞内基因表达有关因素的调控提供有效地手腕另外像遗传学病毒学神经内分泌学病理学免疫学及发育生物学等个领域
2.试述石蜡切片和HE染色大体制备进程?
并指出制备免疫组织石蜡切片和HE染色的石蜡切片有何不同?
石蜡切片大体制备:
取材,固定,脱水,透明,透蜡,包埋,切片,贴片,染色,透明,封藏。
取材:
材料的好坏直接阻碍到切片的质量,取材时给定位麻醉药量适中,去组织是尽可能不损伤所需部位
取材必需新鲜,这一点关于从事细胞生物学研究尤其重要,应该尽可能割取生活着的组织块,并随即投入固定液。
切取材料时刀要锐利,幸免因挤压细胞使其受到损伤。
切取的材料应该小而薄,便于固定剂迅速渗入内部。
一样厚度不超过2mm,大小不超过5×
5mm2。
固定:
经常使用的有乙醇、甲醛、冰醋酸、升汞、苦味酸、铬酸、重铬酸钾和锇酸。
其中,苦味酸、升汞、铬酸既能凝固细胞清蛋白,又能凝固核蛋白;
乙醇只能凝固清蛋白,而醋酸只能凝固核蛋白;
甲醛、饿酸和重铬酸钾对这两种蛋白质都不凝固。
简单固定剂的局限性较大,如将其适当混合,制成复合固定剂能够取得更好的成效。
经常使用的混合固定剂有:
Bouin液(70份苦味酸饱和水溶液+25份4%甲醛+5份冰醋酸)、Zenker液(升汞5g+重铬酸钾+硫酸钠+5ml冰醋酸+100ml蒸镏水)、Carnoy改良液(3份无水乙醇+1份冰醋酸)等。
固定剂的种类甚多,咱们必需依据各类固定剂的性能及制片的不同要求来加以选择。
固按时,须注意以下几点:
(1)固定剂应有足够的量,一样为组织块体积的10~15倍。
(2)如所固定的材料外表有不易穿透的物质,可将材料先在含乙醇的溶液中固定几分钟,再移入水溶性的固定液。
(3)材料固定后如不当即下沉,可将其中气泡抽出。
(4)固按时刻依材料大小、固定剂种类而异,可从1小时到几十小时,有时中间需要更新固定剂。
某些固定剂对组织的硬化作用较强,作历时刻应严加操纵,不能太长。
(5)一样固定剂都以新配制的为宜,用过的不能再用。
有些混合固定剂由甲、乙两液归并者,必然要在利用前才混合。
(6)固定完毕,依照所用固定剂的不同,用水或乙醇冲掉残留的固定剂,以避免固定剂形成沉淀,阻碍以后组织块的染色。
3.脱水
生物组织中含有大量的水分,它和石蜡是不能相溶的,致使在包埋时石蜡无法渗入组织内部,因此须利用脱水剂将水分除尽,这确实是脱水的作用。
脱水剂必需能与水以任何比例相混合。
脱水剂有两类:
一类是非石蜡溶剂,如乙醇、丙酮等,脱水后必需再通过透明,才能透蜡包埋;
另一类是兼石蜡溶剂,如正丁醇,脱水后即可直接透蜡。
经常使用的脱水剂是乙醇,因为它价钱廉价,易于取得。
为了幸免猛烈的扩散引发的组织的强烈收缩,脱水步骤应从低到高以必然的浓度梯度来进行,一样组织从30%乙醇开始,通过50%、70%、80%、95%、100%至完全脱水;
关于一些柔软的组织应从15%开始。
脱水时刻依据组织的类型和大小而定,一样各级乙醇中放置45min到1h,若是中间须停顿,应使材料停留在70%乙醇中,因为低浓度乙醇易使组织变软、解体,高浓度乙醇有脆化组织作用,放置时刻不能太长,另外,脱水必需在有盖瓶中进行,以避免高浓度乙醇吸收空气中水分致使浓度降低而使脱水不完全。
需要保留的材料可脱水至70%乙醇时停留其中,如需长期保留,可加入等量的甘油。
丙酮也是专门好的脱水剂,其作用和用法与乙醇相同,只是其脱水力和收缩力都比乙醇强。
甘油经常使用于藻类、菌类及柔弱材料的脱水。
二氧六环为无色的石蜡溶剂,对组织没有收缩及硬化等不良后果,但其蒸气有毒,利历时须警惕。
正丁醇可与水及乙醇混合,亦为石蜡溶剂,其优势是很少引发组织块的收缩与变脆。
叔丁醇的性质、作用和用法同于正丁醇,但因其价钱昂贵而很少利用。
4.透明
组织块用非石蜡溶剂脱水后必需通过透明。
透明剂能同时与脱水剂和石蜡混合,它取代了脱水剂后,石蜡便能顺利地渗入组织。
透明剂的种类很多,较经常使用的是二甲苯、甲苯、苯、氯仿、香柏油和苯胺油等。
二甲苯作用较快,透明力强,但组织块在其中停留太久,容易收缩变脆变硬,同时假设脱水不净,就会引发不良后果,在应历时必需专门警惕。
通常将组织块先经纯乙醇与二甲苯的等体积混合液,再进入纯二甲苯,如此可减少上述的缺点。
透明时刻应由组织大小而定,—般各级停留时刻在30min至2h,在纯二甲苯中应改换2次,总时刻那么以不超过3h为宜。
材料通过透明,会显示出前一步脱水的成效如何,假设脱水完全,组织那么显现透明状态,如组织中有白色云雾状,说明脱水不净,须返工处置,但返工的成效往往不行。
利用二甲苯透明时,应幸免其挥发和吸收空气中的水分,并维持其无水状态。
20
甲苯的一样性质与二甲苯相似。
用法亦同,唯沸点较低,透明较慢,但可不能使组织变脆。
苯的用法同于二甲苯,对组织的收缩作用小,但须警戒其爆炸和吸入而引发中毒。
氯仿适于大块组织的透明。
5.透蜡和包埋
包埋用的石蜡,熔点在50~60℃之间,应依照材料本身的硬度、切片的厚薄和那时的气温条件来选用。
一样动物材料最经常使用的石蜡熔点为52~56℃,植物材料的用54~58℃的;
切片薄的用58~60℃的,切片厚的那么用52~54℃的;
室温10~19℃时选用52~54℃的石蜡可顺利切片,冬季可用熔点46~48℃的石蜡,夏日可选56~58℃的。
石蜡的好坏与切片的成败紧密相关。
辨别石蜡质量的方式是:
将石蜡熔化后倒入纸盒使其凝结且无气泡和裂痕,30~35℃放置24h且无气泡和不透明的晶状小点显现,蜡块裂面不呈颗粒状,切成薄片不碎成细粒。
这种石蜡即为品质优良。
含有杂质的新蜡或用过的废蜡可清洁后再用,方式是将石蜡放入锅内,加热到开始冒白烟,然后用小火继续加热30min(注意别超过起火点),使其去除水分和挥发性杂质,并在温箱中过滤以去除尘埃等颗粒。
透蜡须在恒温箱中进行,恒温箱的温度调剂至高于石蜡熔点3度,使通过透明的组织块依次用石蜡与二甲苯的等量混合液、纯石蜡处置。
纯石蜡应处置2~3次,透蜡的时刻依材料性质而定,一样每次需15~30min。
透明的关键是操纵温度的恒定,切忌忽高忽低,温度太低石蜡凝固无法渗透,温度太高使组织收缩发脆。
包埋是使渗透蜡的组织块包裹在石蜡中。
具体做法是;
先预备好纸盒(具体折法见图1-3及说明),将熔蜡倒入盒内,迅速用预温的镊子夹取组织块平放在纸盒底部,切面朝下,再轻轻提起纸盒,平放在冷水中,待表面石蜡凝固后当即将纸盒按入水中,使其迅速冷却凝固,30min后掏出。
包埋用蜡的温度应略高于透蜡温度,保证组织块与周围石蜡完全融为一体。
石蜡的迅速冷却也很重要,不然包埋块中将会产生结晶。
以后切片时引发碎裂。
6.切片
(1)石蜡块的固着与整修
在包埋以后,就可进行切片。
包埋好的石蜡块装上切片机进行切片前还须进行固着和整修。
固着:
一样旋转式切片机上都附有可固着石蜡块的金属小盘,这也可用一样大小的台木替代。
用加热的蜡铲将包埋块粘贴于固着物上,并使组织块朝外,便于以后迅速切出所需的片子。
整修:
用加热的蜡铲或刀片将固着的包埋块周围修平,使上下两面修成平行面,常保留组织周围附着宽2~3mm的石蜡,而修好的蜡块呈长方形。
还可削去一角以便于在蜡带上识别切片。
(2)切片机和切片刀
切片机是用来作各类组织切片的一种专门设计的周密机械,经常使用的是旋转式切片机,它的夹物部份是上下移动前后推动的,而夹刀部份那么固定不动。
要紧部件是安装切片刀的刀台、安装包埋块的标本台和操纵切片厚度的微动装置。
切片时切片刀固定不动,转动转轮,标本台上下运动并按调好的切片厚度向前推动必然的距离,组织块上下运动一次,便在刀片上取得一张合乎厚度要求的切片。
切片刀与切片的质量直接相关。
切片前必需磨刀,方式是:
将切片刀装上刀柄、刀背夹、滴少量石蜡油在滑腻的磨刀石上,将刀贴着磨刀石以背向刀口方向磨,利用完毕后应及时用二甲苯将石蜡油擦净。
(3)切片方式
切片前,将刀口置放大镜下观看,选择刀口平整无缺刻的部份来进行切削。
将所要切的包埋块固定在标本台上,使包埋块外切面与标本夹截面平行,并让包埋块稍露出一截。
将刀台推至外缘后松开刀片夹的螺旋,上好刀片,使切片刀平面与组织切面间呈15°
左右的夹角,包埋块上下边与刀口平行。
在微动装置上调剂切片要求的厚度,调剂时应注意指针不可在两个刻度之间,不然容易损伤切片机,将刀台移至近标本台处,让刀口与组织切面稍稍接触,这时就能够够开始切片了。
方式是:
右手转动转轮,左手持毛笔在刀口稍下端接隹切好的片子,并托住切下的蜡带,待蜡带形成必然长度后,右手停止转动,持另一枝毛笔轻轻将蜡带挑起,平放于衬有黑纸的纸盒内,注意切片速度不宜太快,摇动转轮使劲应均匀,避免切片机震动厉害引发切片厚薄不均匀,还应注意转动的方向,以防标本台后移而切不到片子。
切片完毕,应及时用氯仿将切片机的有关部份擦净。
7.贴片
切好的切片必需贴附于载玻片上才能作进一步处置,可是切片常有细小的横纹,必需经展平后才能贴附,不然阻碍染色和观看。
贴片一样有捞片法和烫板法。
捞片法比较简单,第一将切片分割开,投入到48℃的温水浴中,这时切片都浮在水面上,由于表面张力的作用使切片自然展平,然后用涂有甘油蛋白溶液(将鸡蛋一个打破入杯中,去除蛋黄留下蛋白,用筷子充分调打成雪花状泡沫,然后用双层纱布过滤至容器中,加入等量的甘油,混合,最后加入百分之一体积的麝香草酚(thymol)作防腐用,可保留几个月到一年。
)或5%明胶水溶液的载玻片倾斜着插入水面去捞取切片,使切片贴附在载玻片的适合位置,于室温下放置一日夜后使其完全干燥。
烫板法,是将涂有粘片剂的载玻片上涂上水,把已分割好的切片贴上去,再置载玻片于35℃恒定的烫板上让切片摊干,并倾斜或用吸水纸吸去水分,最后将载玻片再度放烫板上晾干。
要注意,不管是利用捞片法仍是烫板法,所用的载玻片必需干净,不能有油污(查验法:
已涂有粘片剂的载玻片上滴加数滴蒸馏水,假设发觉水不均匀分散而聚成滴状,即表示载玻片不清洁,有残留油脂等物在上面);
切片的光面应朝下,不然染色进程中切片容易脱落。
8.染色石蜡切片苏木素一伊红染色法的大体步骤:
(1)二甲苯I----15分钟,
(2)二甲苯II----10分钟,(3)无水酒精I----2分钟,
(4)无水酒精II----2分钟,(5)95%酒精----2分钟,(6)80%酒精----2分钟,(
7)自来水洗片刻,(8)蒸馏水片刻,(9)苏木素液染核----5分钟,(10)自来水洗片
刻,(11)1%盐酸酒精分化分钟,(12)流水冲洗片刻,(13)弱氨水水溶液反蓝
----1分钟,(14)流水冲洗----15分钟,(15)复染0.5%伊红水溶液(对照染色)-
---7分钟,(16)自来水洗(分化伊红)片刻,(17)95%酒精I----2分钟,(18)95%酒
精II----2分钟,(I9)无水酒精I----2分钟,(20)无水酒精II----2分钟,(21)
二甲苯I----5分钟
(22)二甲苯II----5分钟,(23)盖玻片下封固。
免疫组化的石蜡切块所需的石蜡必需是滴熔点的石蜡避免破坏组织的抗原性。
免疫组化染色是用一抗与被检测组织中目的蛋白抗原结合,然后HRP等标记的二抗与一抗进行结合,最后通过DAB显色反映,进而确认所要检测蛋白抗原的定位、半定量等目的。
二、HE染色是用苏木素和伊红别离染上胞核和胞浆,能够区分出一样细胞的形态,在实际应用中能够鉴定组织细胞坏死、水肿、变性和炎性细胞浸润等异样病理学改变,在临床上是诊断恶性肿瘤和肿瘤的专门好的方式。
3、免疫组化染色和HE染色的不同的地方可能是HE染色比较粗略地识别不同细胞形态学改变;
而后者能够针对特异性细胞标志物来检测特异性细胞的改变(数量)、也可检测细胞内细胞因子的转位(如active-caspase3和cleaved-caspase3的胞核和胞浆散布状态)、组织中一些特异性蛋白的表达的量改变(通过图像分析系统分析颜色深浅、散布的面积等综合分析)。
3.何谓免疫荧光染色经常使用的免疫荧光素有哪些?
请列出两种能与DNA结合的荧光素?
三种与蛋白质结合的荧光素,并别离说明他们的吸收波长和发射波长和荧光颜色?
荧光是指某些物质被必然波长的光(如紫外线)照射后能发出一种比激光更长的光,荧光物质也称荧光素,荧光色素或荧光探针是指能够吸收光并能在较短时刻内发射荧光,而且能作为染料的化学物,荧光素提出都具有芳香环结构。
荧光色素的荧光光谱和量子产率受荧光素染液的PH阻碍PH在8.5-9-5是银光强度较强。
PH低于6。
4不发光。
温度,荧光素的乙醇溶液在0度以下没降低10度荧光量子产率增加3%降至-80度荧光量子率接近100%反之那么弱。
30度开始荧光强度降低,37度对异硫氰酸荧光素无阻碍。
溶剂性质对荧光也有阻碍浓度也对荧光有阻碍。
经常使用的荧光素有:
最经常使用的染料有FITC和藻红蛋白类(PE)及罗丹明等。
FITC(异硫氰酸荧光素)(fluoresceinisothiocyante):
呈黄绿色,最大激发激光长490NM最大发射光波长525nm;
与蛋白质结合
四甲基异硫氰酸罗丹明(teramethylrhodamineisothiocyanate)TRITC也是与蛋白质结合比FITC性能好生理条件下对PH不灵敏最大激发光波长550NM最大发射光波长620NM呈橙红色荧光与FITC发出的黄绿色荧光形成鲜明对照经常使用与免疫荧光组织化学双重染色。
四乙基罗丹明(RB200)能与细胞内蛋白质结合易溶于乙醇丙酮性质稳固,应用于双标记示踪染色,最大发光波570nm最大发射波长595·
600nm呈橙红色染色。
花青类染料经常使用的有CY3,CY5与蛋白质结合CY3最大激发光波长570nm最大发射光波长650nm。
CY5最大激发光波长649nm最大发射光波长680nm呈红色荧光
。
PE(藻红蛋白):
橙黄色575nm;
蛋白质结合
PerCP(多甲藻黄素叶绿素蛋白):
深红色675nm;
PI(碘化丙啶):
橙红色620nm;
488nm波长的氩离子激光激发;
APC(别藻青蛋白):
红色660nm;
630nm波长的氦氖激光或红色二极管激光激发。
吖啶橙染色(acridineorange)AOyuDNA或RNA结合最大发射光波长525nm或650nm产生绿色荧光
hoechst33258染色和hoechst33342均为非嵌入性荧光染料他们在活细胞中DNA聚AT序列富集区域的小沟处与DNA结合,活细胞或固定细胞都可从低浓度溶液中摄取该染料,使细胞核染色,故把此染料叫DNA探针hoechst33342和hoechst33258均溶于水维持稳固,hoechst-DNA的激发和发射波长别离为350nm和460nm。
DAPI染色也是与DNA结合。
溴化乙啶染色。
4.免疫荧光组织化学的大体原理方式?
免疫荧光组织技术是用免疫荧光技术检测细胞或组织内抗原或半抗原物质的方式。
依照抗原抗体反映原理,先将已知抗体或抗原标记荧光素制成标记物,再用这种荧光标记物作为分子探针与组织细胞内的相应抗原或抗体反映,在细胞或组织中形成含有荧光素的特异性抗原抗体复合物,这种复合物上的荧光素受激发光发射照射而发出各类颜色,荧光利用荧光显微镜观看,即可对组织细胞中的抗原进行定性定位乃至定量研究。
蛋白质多肽核酸酶激素磷脂多糖受体记病原体等,凡能作为抗原或半抗原的物质都可用免疫荧光技术检出。
5.滤片的种类和用途?
⑴激发光滤光片位于光源和显微镜之间的光路内其作用是吸收可见光,许诺必然波长的紫外光和蓝紫光通过。
依照观看需要,可将抹一些激发滤片至于光路使必然的光通过,作为荧光激发样品中的荧光物质。
⑵阻断滤片又称吸收滤片在目镜和武警之间的光路中吸收视野内未被标本内荧光物质吸收的激发光,已取得清楚地荧光影像和爱惜观看者的眼睛
⑶反光镜上有一层铝铝对紫外线和可见光的蓝紫光吸收少反射率大90%以上,课折射激发光改变光路是激发光赵汝样品中。
⑷隔热滤片吸收热量爱惜其他光学元件。
⑸中性滤片课不同程度的吸收可见光,减弱光强度。
.6.激光共聚焦显微镜的原理?
激光扫描共聚焦显微镜的原理:
传统的光学显微镜利用的是场光源,标本上每一点的图像都会受到临近点的衍射或散射光的干扰;
激光扫描共焦显微镜(LaserScanningConfocalMicroscope,LSCM)采纳点光源照射样本,在焦平面上形成一个轮廓分明的小的光点,该点被照射后发出的荧光被物镜搜集,并沿原照射光路回送到由双色镜组成的分光器。
分光器将荧光直接送到探测器。
光源和探测器前方都各有一个针孔,别离称为照明针孔和探测针孔。
照明针孔与探测针孔相关于物镜焦平面是共轭的,焦平面上的点同时聚焦于照明针孔和发射针孔,焦平面之外的点被挡在探测针孔之外不能成像,如此取得的共聚焦图像是标本的光学切面,幸免了非焦平面上杂散光线的干扰,克服了一般显微镜图像模糊的缺点,因此能取得整个焦平面上清楚的共聚焦图像。
原理图
7.免疫组织化学染色常见的脱片缘故?
及防脱片的处置步骤?
脱片缘故组织固定脱水透明不充分,组织切片过厚,组织切片有折叠,过度的热抗原修复(高压微波水煮)处置或抗原修复液的PH偏离炒作观看中冲洗方式不正确。
防脱片用重鉻酸浓硫酸清洁液浸泡载玻片或那么培育用的小盖片,然后用清水充分再用蒸馏水冲洗3遍以上后置95%乙醇12小时去除擦干或烤干清洁液浸泡只需2小时。
检查玻片是不是上胶。
把玻片放入用配好的多聚左旋赖氨酸%溶液中数十秒沥干于室温下12-24小不时候后的多聚L-懒氨酸放在4度的冰箱保留反复利用一个月。
8.sp法(链霉素抗生素蛋白-过氧化物酶)与直接免疫荧光法的区别?
链霉亲和素替代ABC法中的亲和素-生物素复合物,形成链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶法,SP法
①链霉亲和素是从链霉菌中分离出的一种蛋白,含有四个亚基,链霉亲和素的四个亚基能够全数和二抗上的生物素结合,故又称链霉菌抗生物素蛋白;
由于该放大系统不含生物素,能够免去由内源性生物素所造成的背景染色;
②等电点为~,接近中性,所带的负电荷少,不容易与组织中的正电荷发生彼此吸引,因此降低背景着色。
③链霉亲和素不含糖基,不存在与组织中含糖基类物质其反映的现象。
9.免疫组织化学染色样品制备特点
⑴取材:
组织标本取材:
大体原那么:
取材速度要快,尽可能维持组织新鲜,以充分保留组织的抗原性。
细胞标本取材
贴壁生长细胞:
取材时,用预热的PBS轻轻冲洗小盖片,而后,即可加入固定液。
悬浮生长细胞:
制备2×
105-6细胞/ml悬液,取50-100μl,加入涂片机内,1000r/min.2min.细胞即可均匀散布在载玻片上
3)涂片法:
临床穿刺获取含有细胞的液体(腹水,胸水和心包液)或气管、宫颈等分泌物可直接涂片。
固定:
组织经常使用固定剂:
①10%中性缓冲福尔马林(浓甲醛10ml,
pH,PBS90ml)
②4%多聚甲醛磷酸缓冲液
sp法注意事项:
①甲醛固定可引发组织抗原决定簇交联和封锁(能够通过抗原修复方式来修正
②组织大小应该小于2cm×
l.5cm×
,尤其厚度必需小于;
③固定液的量,体积一样大于组织20倍以上;
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