分子生物学实验技术方法.docx

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分子生物学实验技术方法

【实验技术方法】分子生物学技术（zt）

分子生物学技术真核细胞DNA的制备与定量|质粒DNA的碱裂解法提取与纯化|λ噬菌体DNA提取|DNA分子的限制性内切酶消化|DNA片段回收与纯化|目的基因的亚克隆|PCR|引物参数计算|PCR产物的克隆|DNA序列测定|Southern杂交|PCR-SSCP|细胞凋亡|RNA操作中的一般要求|RNA的制备|mRNA的分离与纯化|RT-PCR|NorthernBlot|RPA|ddPCR|原位杂交|原核表达|蛋白SDS电泳|Western|表达蛋白的分离与纯化|表达蛋白的生物学活性的检测|真核转染

真核细胞DNA的制备与定量

制备基因组DNA是进行基因结构和功能研究的重要步骤，通常要求得到的片段的长度不小于100-200kb。

在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素，以保证DNA的完整性，为后续的实验打下基础。

一般真核细胞基因组DNA有107-9bp，可以从新鲜组织、培养细胞或低温保存的组织细胞中提取，常是采用在EDTA以及SDS等试剂存在下用蛋白酶K消化细胞，随后用酚抽提而实现的。

这一方法获得的DNA不仅经酶切后可用于Southern分析，还可用于PCR的模板、文库构建等实验。

根据材料来源不同，采取不同的材料处理方法，而后的DNA提取方法大体类似，但都应考虑以下两个原则：

（1）防止和抑制DNase对DNA的降解；

（2）尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏。

一、试剂准备

1．TE:

10mMTris-HCl;1mMEDTA。

2．TBS:

25mMTris-HCl;200mMNaCl;5mMKCl。

3．裂解缓冲液：

250mMSDS;使用前加入蛋白酶K至100mg/ml。

4．20%SDS

5．2mg/ml蛋白酶K

6．Tris饱和酚（）、酚/氯仿（酚∶氯仿=1∶1）、氯仿

7．无水乙醇、75%乙醇

二、操作步骤

（一）材料处理

1．新鲜或冰冻组织处理：

⑴取组织块剪碎，加，转移到匀浆器中匀浆。

⑵将匀浆液转移到离心管中。

⑶加20%SDS25ml，蛋白酶K（2mg/ml）25ml，混匀。

⑷60°C水浴1-3hr。

2．培养细胞处理：

⑴将培养细胞悬浮后，用TBS洗涤一次。

⑵离心4000g×5min，去除上清液。

⑶加10倍体积的裂解缓冲液。

⑷50-55°C水浴1-2hr。

（二）DNA提取

1.加等体积饱和酚至上述样品处理液中，温和、充分混匀3min。

2.离心5000g×10min，取上层水相到另一离心管中。

3.加等体积饱和酚，混匀，离心5000g×10min，取上层水相到另一管中。

4.加等体积酚/氯仿，轻轻混匀，离心5000g×10min，取上层水相到另一管中。

如水相仍不澄清，可重复此步骤数次。

5.加等体积氯仿，轻轻混匀，离心5000g×10min，取上层水相到另一管中。

6.加1/10体积的3M醋酸钠（）和倍体积的无水乙醇，轻轻倒置混匀。

7.待絮状物出现后，离心5000g×5min，弃上清液。

8.沉淀用75%乙醇洗涤，离心5000g×3min，弃上清液。

9.室温下挥发乙醇，待沉淀将近透明后加50-100mlTE溶解过夜。

（三）DNA定量和电泳检测

定量：

DNA在260nm处有最大的吸收峰，蛋白质在280nm处有最大的吸收峰，盐和小分子则集中在230nm处。

因此，可以用260nm波长进行分光测定DNA浓度，OD值为1相当于大约50μg/ml双链DNA。

如用1cm光径，用H2O稀释DNA样品n倍并以H2O为空白对照，根据此时读出的OD260值即可计算出样品稀释前的浓度：

DNA（mg/ml）=50×OD260读数×稀释倍数/1000。

DNA纯品的OD260/OD280为，故根据OD260/OD280的值可以估计DNA的纯度。

若比值较高说明含有RNA，比值较低说明有残余蛋白质存在。

OD230/OD260的比值应在之间，若比值较高说明有残余的盐存在。

2.电泳检测：

取1μg基因组DNA用行%琼脂糖凝胶上电泳，检测DNA的完整性，或多个样品的浓度是否相同。

电泳结束后在点样孔附近应有单一的高分子量条带。

三、注意事项

1.所有用品均需要高温高压，以灭活残余的DNA酶。

2.所有试剂均用高压灭菌双蒸水配制。

3.用大口滴管或吸头操作，以尽量减少打断DNA的可能性。

4.用上述方法提取的DNA纯度可以满足一般实验（如Southern杂交、PCR等）目的。

如要求更高，可参考有关资料进行DNA纯化。

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质粒DNA的碱裂解法提取与纯化

细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。

各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。

质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。

目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。

碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：

当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。

纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。

例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。

对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。

一、试剂准备

1.溶液Ⅰ:

50mM葡萄糖，25mMTris-HCl，10mMEDTA）。

1MTris-HCl），（）10ml，葡萄糖，加ddH2O至500ml。

在10lbf/in2高压灭菌15min，贮存于4℃。

2.溶液Ⅱ：

，1%SDS。

2NNaOH1ml，10%SDS1ml，加ddH2O至10ml。

使用前临时配置。

3.溶液Ⅲ：

醋酸钾（KAc）缓冲液，。

5MKAc300ml，冰醋酸，加ddH2O至500ml。

4℃保存备用。

：

10mMTris-HCl，1mMEDTA。

1MTris-HCl（）1ml，（），加ddH2O至100ml。

15lbf/in2高压湿热灭菌20min，4℃保存备用。

5.苯酚/氯仿/异戊醇（25：

24：

1）

6.乙醇（无水乙醇、70%乙醇）

×TBE：

Tris碱54g，硼酸，EDTA-Na2，加ddH2O至1000ml。

15lbf/in2高压湿热灭菌20min，4℃保存备用。

8．溴化乙锭（EB）：

10mg/ml

（RNA酶A）：

不含DNA酶（DNase-free）RNaseA的10mg/ml，TE配制，沸水加热15min，分装后贮存于-20℃。

×loadingbuffer（上样缓冲液）：

%溴酚蓝，%二甲苯青FF，40%（W/V）蔗糖水溶液。

%琼脂糖凝胶：

称取1g琼脂糖于三角烧瓶中，加×TBE，微波炉加热至完全溶化，冷却至60℃左右，加EB母液（10mg/ml）至终浓度μg/ml（注意：

EB为强诱变剂，操作时带手套），轻轻摇匀。

缓缓倒入架有梳子的电泳胶板中，勿使有气泡，静置冷却30min以上，轻轻拔出梳子，放入电泳槽中（电泳缓冲液×TBE），即可上样。

二、操作步骤

1.挑取LB固体培养基上生长的单菌落，接种于（含相应抗生素）液体培养基中，37℃、250g振荡培养过夜（约12-14hr）。

2.取培养物入微量离心管中，室温离心8000g×1min，弃上清，将离心管倒置，使液体尽可能流尽。

3.将细菌沉淀重悬于100μl预冷的溶液Ⅰ中，剧烈振荡，使菌体分散混匀。

4.加200μl新鲜配制的溶液Ⅱ，颠倒数次混匀（不要剧烈振荡），并将离心管放置于冰上2-3min，使细胞膜裂解（溶液Ⅱ为裂解液，故离心管中菌液逐渐变清）。

5.加入150μl预冷的溶液Ⅲ，将管温和颠倒数次混匀，见白色絮状沉淀，可在冰上放置3-5min。

溶液Ⅲ为中和溶液，此时质粒DNA复性，染色体和蛋白质不可逆变性，形成不可溶复合物，同时K+使SDS-蛋白复合物沉淀。

6.加入450μl的苯酚/氯仿/异戊醇，振荡混匀，4℃离心12000g×10min。

7.小心移出上清于一新微量离心管中，加入倍体积预冷的无水乙醇，混匀，室温放置2-5min，4℃离心12000g×15min。

预冷的70%乙醇洗涤沉淀1-2次，4℃离心8000g×7min，弃上清，将沉淀在室温下晾干。

9.沉淀溶于20μlTE（含RNaseA20μg/ml），37℃水浴30min以降解RNA分子，-20℃保存备用。

三、质粒DNA的电泳检测

观察琼脂凝胶中DNA的最简单方法是利用荧光染料溴化乙锭进行染色。

该物质含有一个可以嵌入DNA的堆积碱基之间的一个平面基团，这个基团的固定位置及其与碱基的密切接近，导致染料与DNA结合并呈现荧光，其荧光产率比游离染料溶液有所增加。

DNA吸收254nm处的紫外辐射并传递给染料，而被结合的染料本身则在302nm和366nm有光吸收。

这两种情况下，被吸收的能量可在可见光谱红橙区的590nm处重新发射出来。

因此，当凝胶中含有游离溴化乙锭时即可以检测到少量的DNA。

取制备的质粒DNA1-2μl，加适当loadingbuffer混匀上样,采用1-5V/cm的电压，使DNA分子从负极向正极移动至合适位置，取出凝胶置紫外灯下检测，摄片。

四、注意事项

本裂解法小量制备质粒DNA重复性好，一般无麻烦。

若所提取质粒DNA不能被限制性内切酶切割，可通过酚/氯仿再次抽提，以清除杂质来解决问题。

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λ噬菌体DNA提取

λ噬菌体是最早使用的克隆载体，λ噬菌体的基因组是一长度约为50kb的双链DNA分子，它在宿主细胞有两种生活途径，其一是裂解生长，环状DNA分子在细胞内多次复制，合成大量噬菌体基因产物，装配成噬菌体颗粒，裂解宿主菌再进行下一次感染；其二是溶源性生长，即感染细胞内λ噬菌体DNA整合到宿主菌染色体DNA中与之一起复制，并遗传给子代细胞，宿主细胞不裂解。

平板培养时，裂解生长形成噬斑。

液体培养时，裂解生长使菌液中宿主菌最后全部被裂解而释放出大量的噬菌体颗粒。

经过改造的λ噬菌体克隆位点可插入几到几十kb的外源DNA。

许多cDNA和基因组文库是以λ噬菌体作为克隆载体构建的。

因此，在经文库筛选得到目的克隆后，我们常常需要利用λ噬菌体裂解生长的特点，培养获得大量的噬菌体颗粒，并提取λ噬菌体DNA来开展进一步的工作。

一、试剂准备

液体培养基：

胰化蛋白胨（细菌培养用）10g，酵母提取物（细菌培养用）5g，NaCl10g，加ddH2O至1000ml，完全溶解，分装小瓶，15lbf/in2高压灭菌20min。

琼脂LB固体培养基:

称取琼脂粉放入300ml锥形瓶,加100mlLB，15lbf/in2高压灭菌20min，稍冷却，制备平皿。

%麦芽糖：

麦芽糖20g，加ddH2O至100ml，μm滤膜过滤。

液：

，MgSO47H2O2g，1MTrisCL（）50ml，2%明胶5ml，加ddH2O至1000ml。

15lbf/in2高压灭菌20min。

ml，TE配制，沸水浴15min，分装后贮存于-20℃。

6．DNaseI10mg/ml，TE配制，分装后贮存于-20℃。

%SDS

9．EDTA:

3.苯酚/氯仿/异戊醇（25：

24：

1）

4.异丙醇

5.无水乙醇、70%乙醇

二、操作步骤

1.λ噬菌体平板培养

⑴用SM液10倍梯度稀释λ噬菌体原种。

⑵取各梯度稀释离心到一消毒微量离心管中，加新鲜培养的宿主菌，加麦芽糖（%），MgSO4（10mm），37℃温育20min，使噬菌体颗粒吸附于细菌。

⑶取熔化（47℃）%琼脂LB固体培养基3ml与上述管混匀，立即倒入预备（2-4天）的含凝固%琼脂LB固体培养基的平板内，轻轻晃动平板使均匀分布。

⑷37℃培养6-8hr后，观察噬斑形成。

⑸用剪去部分头部的吸头挖取单个噬斑到的SM液中，加氯仿，震荡。

37℃温育10min。

⑹重复⑴-⑷，获得单个噬斑滴度。

2.λ噬菌体液体培养

⑴取2ml新鲜培养的宿主菌，离心，培养基重悬，加λ噬菌体（新鲜获得的单个噬斑，依滴度使之与宿主菌比约1/500-1000）。

⑵加麦芽糖（%），MgSO4（10mM），37℃温育20min，使噬菌体颗粒吸附于细菌。

⑶加到100mlLB液体培养基中，加麦芽糖（%），MgSO4（10mM），37℃摇震培养9-12hr后可见裂解发生。

⑷加氯仿，37℃继续摇震培养10-20min。

（二）λ噬菌体DNA提取

1.将上述裂解液转移至离心管，离心8000g×10min，去细菌碎片，取上清液。

2.加RNaseA、DNaseI至1μg/ml，37℃温育30min。

3.加，，摇匀至溶解，冰浴1hr或4℃过夜。

℃离心10000g×20min，去上清液。

5.加2mlSM液，充分洗溶管壁及沉淀，移到新微量离心管，加20μl10%SDS，20μ，68℃15min。

6.加等体积苯酚/氯仿/异戊醇（25：

24：

1），混匀，离心12000g×5min，取上层液到一新微量离心管，加等体积氯仿/异戊醇（24：

1），混匀，离心12000g×5min。

7.取上层液到一新微量离心管，加等体积异丙醇，混匀，-20℃1hr，4℃离心12000g×10min，去上清液。

预冷的70%乙醇洗涤沉淀1-2次，4℃离心8000g×7min，弃上清，将沉淀室温下晾干。

9.沉淀溶于20μlTE，-20℃保存备用。

三、注意事项

1.用于裂解的噬菌体、宿主菌为新鲜培养获得时，裂解好、裂解噬菌体收获量大。

2.液体培养裂解时，如到培养时间时裂解尚未发生，可适当提高培养温度或加大摇震速度。

、DnaseI消化不全，DNA、RNA可粘走部分噬菌体。

4.苯酚/氯仿抽提时，注意PEG、蛋白质等杂质污染，它们会影响限制性内切酶切割。

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DNA分子的限制性内切酶消化

限制性内切酶可特异地结合于一段被称为限制酶识别序列的DNA序列位点上并在此切割双链DNA。

绝大多数限制性内切酶识别长度为4、5或6个核苷酸且呈二重对称的特异序列，切割位点相对于二重对称轴的位置因酶而异。

一些酶恰在对称轴处同时切割DNA双链而产生带平端的DNA片段，另一些酶则在对称轴两侧相对的位置上分别切断两条链，产生带有单链突出端（即粘端）的DNA片段。

1个单位限制性内切酶是指在最适条件下，在50μl体积1小时内完全切开1μgλ噬菌体DNA所需的酶量。

不同的限制性内切酶生产厂家往往推荐使用截然不同的反应条件，甚至对同一种酶也如此。

但是，几乎所有的生产厂家都对其生产的酶制剂优化过反应条件，因此购买的内切酶说明书上均有其识别序列和切割位点，同时提供有酶切缓冲液（buffer，10×、5×）和最适条件，使得酶切反应变得日益简单。

一、限制性内切酶对DNA消化的一般方案

1.限制性内切酶反应一般在灭菌的离心管中进行。

μl体积反应体系如下：

DNAμg

10×酶切bufferμl

限制性内切酶1-2u（单位）

加ddH2O至20μl

限制性内切酶最后加入，轻轻混匀，稍加离心，放置于最适温度水浴并按所需的时间温育，一般为37℃水浴消化1hr。

3.用于回收酶切片段时，反应总体积可达50-200μl，各反应组分需相应增加。

4.多种酶消化时若缓冲液条件相同，可同时加入；否则，先做低温或低盐的酶消化，再做高温或高盐的酶消化。

5.酶切结束时，加入（）使终浓度达10mM，以终止反应。

或将反应管在65℃水浴放置10min以灭活限制性内切酶活性。

6.如消化反应体积过大，电泳时加样孔盛不下，可加以浓缩：

终止反应后，加入体积的5M乙酸铵（或1/10体积3MNaAc）和2倍体积无水乙醇，在冰上放置5min，然后于4℃离心12000g×5min。

倾去含大部分蛋白质的上清液。

于室温晾干DNA沉淀后溶于适量TE中（）。

7.如要纯化消化后的DNA，可用等体积酚/氯仿（1∶1）和氯仿各抽提一次，再用乙醇沉淀。

二、电泳检测

取质粒酶切产物适量，加适当loadingbuffer混匀上样，以未经酶切的质粒或/和酶切的空载体（如有）作对照，采用1-5V/cm的电压，使DNA分子从负极向正极移动，至合适位置取出置紫外灯下检测，摄片。

三、注意事项

1.浓缩的限制性内切酶可在使用前以1×限制酶缓冲液稀释，切勿用水稀释以免酶变性。

2.购买的限制性内切酶多保存于50%甘油中，于-20℃是稳定的。

进行酶切消化时，将除酶以外的所有反应成分加入后即混匀，再从-20℃冰箱中取出酶，立即放置于冰上。

每次取酶时都应更换一个无菌吸头，以免酶被污染。

加酶的操作尽可能快，用完后立即将酶放回-20℃冰箱。

3.尽量减少反应体积，但要确保酶体积不超过反应总体积的10%，否则酶活性将受到甘油的抑制。

4.通常延长时间可使所需的酶量减少，在切割大量DNA时可用。

在消化过程中可取少量反应液进行微量凝胶电泳以检测消化进程。

5.注意星号酶切活力。

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DNA片段回收与纯化

质粒、噬菌体等经酶切，电泳；PCR产物经电泳后，常常需要对一些DNA电泳片段进行回收和纯化，用于亚克隆、探针标记等。

DNA回收和纯化常用方法有压碎法、低融点琼脂糖法、冻融法等，也有现成的试剂盒供应。

一、冻融法

1.紫外灯下仔细切下含待回收DNA的胶条，将切下的胶条（小于）捣碎，置于离心管中；

2.加入等体积的Tris-HCl饱和酚（），振荡混匀；

℃放置5-10min；

℃离心10000g×5min，上层液转移置另一离心管中；

5.加入1/4体积H2O于含胶的离心管中，振荡混匀；

℃，放置5-10min；

℃离心10000g×5min，合并上清液；

8.用等体积酚/氯仿、氯仿分别抽提一次，取上清；

9.加入1/10体积3MNaAc（）、倍体积预冷的无水乙醇，混匀；

℃，静置30min；

℃离心13000g×10min，弃上清，75%乙醇洗沉淀1-2次，晾干；

12.加适量H2O或TE溶解沉淀。

二、DNA回收试剂盒（QIAquickGelExtractionKitProtocol）

1.紫外灯下仔细切下含待回收DNA的凝胶，置离心管中，称重。

2.加入BufferQG（每100mg凝胶加BufferQG300μl），置50℃水浴10min。

3.若回收片段小于500bp或大于4kb，则需加入异丙醇（每100mg凝胶加异丙醇100μl），混匀。

4.将小柱放在2ml收集管上，将上述溶液加于柱上。

5.4℃离心13000g×1min，弃去收集管中液体。

6.加入500μlBufferQG于柱上，4℃离心13000g×1min，弃去收集管中液体。

7.加入750μlBufferPE于柱上，4℃离心13000g×1min，弃去收集管中液体。

8.4℃离心13000g×1min。

弃去收集管。

9.将柱放于一新离心管上，加50μlEB于柱上。

放置1min，4℃离心13000g×1min。

10.取5μl回收DNA电泳检测。

三、注意事项

紫外灯下切下含待回收DNA的凝胶时，要衬以干净的塑料薄膜，使用无DNA污染的新刀片，其目的在于防止外源DNA的污染。

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目的基因的亚克隆

所谓亚克隆就是对已经获得的目的DNA片段进行重新克隆，其目的在于对目的DNA进行进一步分析，或者进行重组改造等。

亚克隆的基本过程包括：

（1）目的DNA片段和载体的制备；

（2）目的DNA片段和载体的连接；（3）连接产物的转化；（4）重组子筛选。

一、试剂准备

1．LB液体培养基：

胰化蛋白胨（细菌培养用）10g，酵母提取物（细菌培养用）5g，NaCl10g，加ddH2O至1000ml，完全溶解，分装小瓶，15lbf/in2高压灭菌20min。

2．%琼脂LB固体培养基:

称取琼脂粉放入300ml锥形瓶,加100mlLB，15lbf/in2高压灭菌20min，稍冷却，制备平皿。

3．IPTG、X-Gal

4．：

15lbf/in2高压灭菌20min，0℃冰浴备用。

5．（以20%甘油水溶液配制）：

15lbf/in2高压灭菌20min，0℃冰浴备用。

6．限制性核酸内切酶、T4DNA连接酶。

二、目的DNA片段和载体的制备

选择适宜的限制性核酸内切酶，消化已知目的DNA和载体，获得线性DNA，用于重组。

根据目的DNA和载体的具体情况，选择一种或者两种适当的限制酶切割，分别产生对称性粘性末端（用一种限制性内切酶进行消化而产生带有互补突出端）、不对称粘性末端（用两种不同的限制性内切酶进行消化而产生带有非互补突出端）、平端。

在亚克隆时，首选不对称相容末端连接，次选对称性粘性相容性末端连接，由于平末端连接效率较低，通常很少采用。

但有时目的片段的末端与载体不匹配，一般先将不匹配末端补平，然后再以平末端连接。

（实验操作同前述）

三、利用T4DNA连接酶进行目的DNA片段和载体的体外连接

（一）连接要求和结果

外源DNA片段末端性质连接要求连接结果

不对称粘性末端两种限制酶消化后，需纯化载体以提高连接效率载体与外源DNA连接处的限制酶切位点常可保留；非重组克隆的背景较低；外源DNA可以定向插入到载体中。

对称性粘性末端线形载体DNA常需磷酸酶脱磷处理载体与外源DNA连接处的限制酶切位点常可保留；重组质粒会带有外源DNA的串联拷贝；外源DNA会以两个方向插入到载体中。

平端要求高浓度的DNA和连接酶载体与外源DNA连接处的限制酶切位点消失；重组质粒会带有外源DNA的串联拷贝；非重组克隆的背景较高。

带有相同末端（平端或粘端）的外源DNA片段必须克隆到具有匹配末端的线性质粒载体中,但是在连接反应时,外源DNA和质粒都可能发生环化,也有可能形成串联寡聚物。

因此，必须仔细调整连接反应中两个DNA的浓度，以便使“正确”连接产物的数量达到最佳水平，此外还常常使用碱性磷酸酶去除5’磷酸基团以抑制载体DNA的自身环化。

利用T4DNA连接酶进行目的DNA片段和载体的体外连接反应，也就是在双链DNA5’磷酸和相邻的3’羟基之间形成新的共价键。

如载体的两条链都带有5’磷酸（未脱磷），可形成4个新的磷酸二酯键；如载体DNA已脱磷，则只能形成2个新的磷酸二酯键，此时产生的