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14湖北农业科学HuBEIAGRICu删RALSCIENCESNo3,2004文章编号:
04398114(2004)03一001405纤维素酶研究综述王巧兰,郭刚3,林范学4(1。
军事经济学院军需系,湖北武汉430035;2华中农业大学资源与环境学院,湖北武汉430070;3华中农业大学生命科学技术学院,湖北武汉430070;4济宁师范专科学校生物系,山东济宁272125)摘要:
综述了分解纤维的重要意义、纤维素酶底物及其复杂结构、纤维素酶作用机理、酶的分类、产酶生物种属的多样性。
并对纤维素酶研究进行了展望。
关键词:
纤维素;纤维素酶;纤维素分解茵;作用机理中图分类号:
Q5393文献标识码:
A自从1906年在蜗牛消化道发现纤维素酶以来【l】,纤维素的微生物降解问题就得到了足够的关注。
1954年开始,美军Natick实验室就已研究了军用纤维素材料微生物降解的防护问题,后来发现纤维素经微生物降解后,可产生经济、丰富的生产原料,且有望解决自然界不断产生的固体废物问题,于是纤维素酶得到了广泛的关注。
纤维索占植物干重的35一50【2l,它是地球上分布最广、含量最丰富的碳水化合物。
对人类而言,它同时又是自然界中数量最大的可再生性物质3】,它的降解是自然界碳素循环的中心环节。
纤维素的利用与转化对于解决目前世界能源危机、粮食短缺、环境污染等问题具有十分重要的意义4】。
纤维紊酶的作用机制至今尚不完全清楚,纤维素酶产生菌的产酶能力低下且所产生的酶的组分不全或不平衡,是这一领域的研究与实际应用还有一定距离的主要原因。
收稿日期:
2004一02_20作者简介:
王巧兰(1965一),女,湖北仙桃人,副教授,在读博士生纤维素酶在食品、酿造行业、农副产品深加工、饲料、医药、环境保护和化工等领域有着非常广阔的应用前景和应用潜力。
1纤维素酶底物及其复杂结构11纤维素的分子结构及大小纤维素分子是D一葡萄糖以p一1,4一糖苷键相联结而构成的具有复杂结构的结晶分子。
纤维素分子的聚合度变化很大,一般为8000一10Ooo个葡萄糖残基5】。
这种结晶分子先由基本单元构成直链状的分子,大分子经折叠形成具有高结晶度的纤维素基本单位,再由这种基本单位集中构成微小的结构单位,最后由很多微小的结构单位构成自然界千差万别、不同类型、不同长度、不同大小的纤维素。
这种纤维素巨分子的聚集态结构存在很多种结晶变体,迄今为止,已发现固态纤维存在着五种结晶变体,即天然纤维素(纤维素I)、人造纤维素II、III、+一+-+*+-+-+-+-卜-+-+-+*+-+-+-+一-+-十-+一+-+”+-+-+-卜-卜-。
-+-1卜-+-+-+一。
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+-卜-卜-+34充分发挥自然村、乡镇等基层组织的地缘优势关章程进行企业化管理,重新组建新型的合作经我国现有2862个县级行政区,乡镇44741个;平均每个乡镇有165个村,5322户家庭,20611人。
自然村、乡镇本来就是一个很好的“合作组织”,每个乡镇都拥有农资供销社、信用合作社等具有合作性质的组织,但大多名存实亡,失去了合作的意义,当前要在现有的基础上进行大力改造,加强供销社、信吊合作社的合作功能。
或者按照现代管理制度,参照现代企业制度的有济组织。
在合作经济组织的发展过程中要注意质的提高,不必追求量的多少,事实上国外的合作社都是超大型公司。
因此我国在发展农业合作经济组织时要从提高农民的组织化着手,以提高我国农业的竞争力为出发点,合作组织之间也要注意纵向和横向的联合,跨地区、在全国范围内建立合作组织也是十分必要的。
万方数据湖北农业科学HUBElAGRICULlURALSCIENCESNo3,200415和纤维素V,这五种结晶变体各有不同的晶胞结构田。
经研究,天然的纤维素由排列整齐而规则的结晶区和相对不规则、松散的无定形区组成。
纤维素链之间存在着氢键,通过氢键的缔合作用,形成纤维束,分子密度大的区域,成平行排列,形成结晶区;分子密度小的区域,分子间隙小,定向差,形成无定形区7】。
在自然界,纤维素分子一般均包埋或嵌合在半纤维素、木质素里,三者以复合体形式存在,并且木质素包围着纤维素且和半纤维素有着共价关系,共同形成较复杂的网状结构引。
12自然界一些天然底物或纤维素资源一般研究中常用的纤维素酶底物有:
纤维素粉CFll、水杨苷、结晶纤维素或微晶纤维素(Avicel)、羧甲基纤维素(CM一纤维素)及其钠盐(CMCNa)、羟乙基纤维素、对一硝基酚一B一葡萄糖苷、无定型纤维素、纤维四糖、硫酸纤维素、磷酸膨润纤维素、纤维糊精和脱脂棉等。
自然界一些天然底物或纤维素资源:
木浆(纤维素938)、糠醛渣、木屑、青干草粉、稻草(蔗渣、麦秆、稻壳、玉米穗轴、花生壳粉等)等农副产品、滤纸(其他纸)、木纸浆、洋麻、啤酒滤饼、制糖工业甜菜废丝等。
其中,棉纤维的结晶度为80一90,聚合度为3500一10000,比木质纤维素高9|,是纤维素的最完善结晶和抗性最强的形式,只有完全的纤维素酶系才能水解它。
EGI和CBHII协同对天然棉花纤维素可以进行完全降解(10】。
滤纸是一种多重底物,既有自由末端和无定形区域,也有结晶纤维。
一般而言,对天然底物进行化学或物理的预处理可提高底物对酶的敏感性,例如,经酸中和脱碱处理稻壳的酶解转化率比未处理提高约34倍1。
2纤维素酶作用机理21纤维素酶分子大小及其结构的复杂性不同来源、不同组分的纤维素酶分子量差别较大,如GeDfr如lumcn蒯汜um产生的一种内切葡聚糖酶,其分子量为130000D,而斜卧青霉的EG的一个组分,分子量仅24000D12】。
纤维素酶分子的一级结构都具有类似的结构,即由球状的催化结构域、链结区和纤维素结合结构域(CelIuIoseBindingDom8ins,CBD)三部分组成。
从酶分子的高级结构来讲,不同来源的酶分子又具有不同的高级结构。
如Ctrf击umceZZ“伽or删包括两个多纤维素酶体,每个小体又都包含9个相同组分的亚单位,而其中一个小体的酶活性是另一小体活性的4倍13】,足以说明纤维素酶组成的复杂性。
经研究,纤维素酶分子的CBD通过其基团堆积力吸附到纤维素分子上,再由CBD上其余的氢键形成残基与相邻葡萄糖链形成氢键将单个葡萄糖链从纤维素表面疏解下来,以利于催化区的水解作用。
虽然大多数纤维素酶中都包含cBD区】,但Ct,lerr加ceZZum的几个纤维素酶组分都缺少CBD区,它们是依靠其纤维小体吸附于纤维底物上的15】。
阎伯旭等采用化学修饰的方法,得出内切葡聚糖酶的底物结合位点含有色氨酸16l。
B一葡萄糖苷酶是由两个分子量相同的亚基组成的二聚体,该酶分子中存在着与溶菌酶相似的羧基,它位于酶分子的非极性区域,通过双转换反应完成对底物的降解】7。
纤维素酶各组分大多为糖蛋白,在发酵过程中加入糖基化抑制剂如脱氧己糖、衣霉素等,以得到不同糖基化的酶,从而研究糖基化对酶的功能影响等15】。
22纤维素酶分子对底物分子的吸附纤维素酶对底物分子的降解,必需先发生吸附作用。
纤维素酶的吸附不仅与自身陛质有关,也与底物密切相关。
Nidotsky等发现,里氏木霉的CBH和EGII对纤维素的吸附是个可逆过程,而CBHI是个不可逆过程。
但纤维素酶的吸附机制总体并未弄清,仍需进一步研究【l8J。
23天然纤维素的微生物降解理论天然纤维素的微生物降解机理被普遍接受的理论主要有三种:
协同理论(Syne唱ism),原初反应假说(Initialdegrading)和碎片理论(Fmgmentation),其中以协同理论最为广泛接受。
内切酶首先切割纤维素链使暴露出末端,然后外切酶连续切割下纤维二糖单位,而B一葡萄糖苷酶通过水解纤维二糖或纤维糊精,完成协同反应全过程191。
24纤维素酶单个组分和多组分的作用机制纤维素酶的断键机制与溶菌酶一样,遵循双置换机制,即作用部分的两个色氨酸参与基质结合。
科学家用定点突变技术和酶专一性抑制剂证明了谷氨酸位于细菌和真菌的CBH、EG和葡萄糖苷酶的催化位点。
纤维素与酶的相互作用中,是酶被底物分子所吸附,然后进行酶解催化,所以,在酶工程技术中,将纤维素酶制成固定化酶应用到纤维素水解工业中去几乎行不通。
且纤维素酶的活性较低,仅为淀粉酶的1100汹】。
不同功能的纤维素酶各组分在纤维素分解过程中普遍存在协同作用。
一般地,外切酶作用于不溶性纤维表面,使形成结晶结构的纤维素长分子链开裂,长链分子末端部分发生游离,从而使纤维素万方数据16湖北农业科学HUBEIAGRICu删RALSCIENCESNo3,2004易于水化;内切酶则作用于经外切酶活化的纤维素,分解其B一1,4键,产生纤维二糖、三糖等短链低聚糖,B一葡萄糖苷酶再将纤维二糖、三糖等分解成葡萄糖。
但值得一提的是,该协同作用不但其作用顺序不是绝对的,就是各酶的功能也不是这样简单、固定的。
研究表明,EG和CBH都能引起纤维素的分散和脱纤化(沿着纤维素的经度轴方向分层,形成更薄更细的亚纤维)。
这样纤维素的结晶结构被打乱,导致变形,使纤维素酶能深入纤维素分子界面之间,从而使纤维素孔壁、腔壁和微裂隙壁的压力增大,水分子的介入又使纤维素分子之间的氢键被破坏,产生部分可溶性的微结晶,利于进一步被降解【l8。
在厌氧环境里的Cktr诚“m砘r,nocefZMm的多纤维素酶体里的多个亚蛋白基因已被成功克隆,其中最大的一个CipA蛋白,分子量约为210一250kd,主要负责多个其他酶亚单元的协同降解作用,并将各亚单元进行装配2l】。
研究表明,不仅酶系中各组分存在协同作用,酶与其他物质或微生物间亦存在较强烈的协同作用圳。
25纤维素结构对酶解影响纤维素底物对酶解的敏感度受其结构的影响很大,包括纤维中木质素的含量、比表面积、结晶度及聚合度】,这说明纤维素来源及结构复杂程度,都将影响酶解效率7|。
对纤维素底物即使进行了有效的前处理后,要想得到与水解淀粉一样的速度。
必须将酶活性提高100l000倍,这实际上非常困难。
需要在纤维素酶的作用机理方面有理论性的突破。
目前尚未提出酶分子与底物发生作用的具体过程,这也阻碍了纤维素降解机制的理解和酶作用机制研究的深入15。
3纤维素酶的分类纤维素酶是指能水解纤维紊Bl,4葡萄糖苷键,使纤维素变成纤维二糖和葡萄糖的一组酶的总称,它不是单一酶,而是起协同作用的多组分酶系。
Ogawa等人认为酶系中的组分可分为两类:
I类水解可溶性纤维素较水解不溶性纤维素更为容易,类型II则相反川。
wood等认为,纤维素酶由葡聚糖内切酶(也称Cx酶)、葡聚糖外切酶(也称Cl酶)、B一葡萄糖苷酶(也称CB酶或纤维二糖酶)三个主要成分组成的诱导型复合酶系。
他的一些观点后来也被修正,原先Cx酶不只是从非还原性末端对纤维分子进行切割。
也从还原性末端以纤维二糖为单位进行分解。
纤维素酶属于糖基水解酶,根据氨基酸序列的相似性可将糖基水解酶分为82个族,纤维素酶占其中的13个族。
而HenrissatB等人篇矧又在纤维素内部将三种酶细分,其中,内切葡聚糖酶可分为13个族,外切葡聚糖酶分为5个族,B一葡萄糖苷酶分为2个族。
自1982年珊砌e等人首次报道抛如删螂声删的纤维素酶基因被克隆以来,已分离发现的纤维素酶系,至1994年,已克隆并研究的纤维素酶基因约一百多个汹】,至目前为止,约450个单个组分的基因被克隆【4|。
从基因水平上这些组分相对比较复杂,先是有人将其分成七个大类,后又有人分成九个大类咖】。
现在仍不断有新的纤维素酶的蛋白质或基因被发现或进一步阐明【31】。
4产纤维素酶生物的种属多样性不同微生物合成的纤维素酶在组成上有显著的差异,对纤维素的酶解能力也不大相同。
对纤维素能进行有效降解的生物包括细菌、丝状真菌、放线菌、软体动物、原生动物和昆虫在内的各种生物。
虽然报道昆虫中能降解纤维素的一般是肠道微生物牌】,但迄今没有有力的证据表明昆虫本身不分泌产生纤维素酶。
从微生物分解菌来讲,20世纪60年代以来,据不完全统计,国内外共记录了产纤维素酶的菌株大约已有53个属的几千个菌株。
其中,丝状真菌是研究最多的纤维素降解类群。
其在降解纤维素底物时,菌丝穿过次生壁进入胞腔,由内向外降解纤维素,使纤维逐步被破坏。
而细菌则是粘附在纤维上,从纤维的表面向内生长,在接触点处纤维素被降解,使纤维表面呈锯齿蚀痕【5】。
真菌中黑曲霉是公认的安全微生物,不产生毒素,纤维素酶应用在食品生产中该类菌首当其冲,引。
瑞氏木霉具有降解纤维素与半纤维素的完全酶系而倍受关注,发现它共产生八种不同的纤维素酶,分别属于七种不同的族群(CBHI第7族,cBHII第6族,EGI第7族,EGII第5族,EGIII第12族,EGV第45族,BGu第3族和BGuI第l族)川。
此外,其他产纤维素酶活性较高的真菌有青霉、根霉、枝顶孢霉属和漆斑霉,特别是绿色木霉(71r记b如丌,l口uf九如)及其近缘菌株;细菌有纤维杆菌、球形杆菌、球形生孢纤维粘菌、白色瘤胃小球菌等。
一些致病真菌同样产生活性较强的纤维素酶,如茄病镰刀霉(,k硎lmso肠“)、只泐觎缸“m、万方数据湖北农业科学HuBEIAGRICuLTuRALScIENcEsNo3,200417,:
c嗣penocezn、f:
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九盯n和Fsem如ct啪。
一般而言,厌氧菌所产酶系较有氧菌丰富,厌氧菌产多酶体系,而有氧菌多产单一酶系瞵】。
C如t蒯imlle丌加ceffum是最值得一提的厌氧嗜热的纤维分解菌【361。
国内外的研究报道,一般对细菌和真菌所产纤维素酶关注较多,而对放线菌纤维素酶的研究较少,另外,酵母也产生纤维素酶。
实际上,自然界产生纤维素酶的菌株远不限于文献已报道的已知种属,这与自然界存在丰富的纤维素资源是相适应的。
例如,中国于1968年组织了纤维素酶协作攻关组,共获得37个属10780株菌,从中筛选得到纤维素酶产生菌34个属2907株、半纤维素酶产生菌32属2650株。
近年报道的产纤维素酶的新菌株有野油菜黄单胞菌S152强】、地衣芽孢杆菌剪】等。
因为细菌所产纤维素酶一般都存在于胞内或吸附在细胞壁上,不分泌到培养液中,所以工业上很少采用细菌作生产菌种;另外,从各国研究者的报道,分离筛选到的真菌的cMC酶活或FP酶活普遍比细菌要高,故科学家一般采用的工业发酵菌种为真菌,多是木霉、曲霉、青霉、根霉舯】,特别以木霉属(舭7lD出舢印)菌种居多,一些菌种的选育工作也是以此菌展开。
目前研究最清楚的是里氏木霉n幻砌如丌嬲reese(忉oc旭口歹ecoM)【41】o国内一般利用里氏木霉QM9414(美国陆军Natick实验室菌株)作为酶活力的比较菌株。
5纤维素酶研究展望1)目前来看,尽管国内外已经出现纤维素酶的成品,但其生产效价较其他诸如淀粉酶、脂肪酶而言,离大规模地对纤维素进行利用还相差甚远,故仍然需要寻找新的产纤维素酶菌株或进一步选育高产菌株。
一些纤维素降解菌株均为普通培养基获得,一些厌氧、极端环境微生物的报道未引起足够重视,它们所具有的一些降解基因也许是非常特别的圳。
2)环境扫描电镜(ESEM)是一种新型的扫描电镜,可以使非导体及含水样品不经表面处理直接观察,可拍摄生物样品的自然状态,可以跟踪不同降解环境下的多种纤维素及微生物的微观结构,有利于探讨微生物产酶机制m】。
3)通过酶分子的结构化学研究,有可能阐明酶分子的作用机理。
如对CBHII作用于纤维素之后形成产物的降解机理,从cBHII的分子结构上就找到了答案】。
4)纤维素酶活力都是在底物不饱和的情况下测定的,这样势必造成酶活力的不可比较性。
事实上,影响纤维素酶研究的瓶颈,是没有统一的测定纤维素酶的方法。
在酶活的定义方面,不同研究者甚至同一研究者在不同的研究中存在明显的分歧,难以进行横向比较,急需要统一规范,包括规定标准菌株、标准测活方法、标准底物47】。
5)孙英华等从“八五”期间开始,即采用两菌株交替发酵,可以大大提高纤维素酶的活力,平均提高14倍;他们认为,大型真菌的酶系较完全,并兼有活性较强的木质素酶、半纤维素酶、果胶酶,虽然其产酶时间晚,酶活较低,但其酶系的特殊性,仍然有值得借鉴之处删;木霉和曲霉混合发酵比单一发酵时酶解蔗髓得糖率要高。
说明在纤维素酶研究过程中,要重视混合发酵的效果。
如纤维分解细菌与伴生菌(产黄纤维单胞菌、腐臭假单胞杆菌)可协同作用,发酵分解纤维素。
6)鉴于各菌株酶组分、活性各异,均存在某种特定组分酶活性较低的缺陷,原生质体融合技术可打破物种间细胞不能相互融合的障碍,是获取具有全纤维素酶高产菌株的理想育种途径训。
许多学者尝试着对各不同属种间的纤维素酶系之间的亲和相容性或多态性进行研究,通过细胞融合,曾获得了既能分解纤维素,又能分解木质素的稳定的梭菌杂种菌株啪】。
7)纤维素酶基因克隆在细菌中和在真菌中的表现因为表达水平的原因,目前,大家更多地将目光投向真核表达系统41。
由于众所周知的原因,将纤维素酶基因克隆到大肠杆菌中并予以表达仅限于实验室阶段,因为Ec础不能外分泌蛋白质;鉴于木霉本身也是优良的外源基因表达系统之一,而且木霉具有十分成熟的批量发酵技术,还具有较强的蛋白质胞外分泌能力,所以将高效的纤维素酶基因克隆到木霉中将是十分具有商业诱惑力的课题之一。
另外,构建具有纤维素分解能力的酿酒酵母菌,从而高效利用自然界廉价的纤维素资源将具有十分广阔的市场前景。
8)细菌纤维素合成菌株中存在着纤维素酶给我们有益的启示:
未来通过研究纤维素合成来了解纤维素将是一种不错的途径51J。
细菌纤维素由于结构单一、纯度高,可被纤维素酶迅速降解,因此可以考虑将其作为纤维素酶活力测定的标准底物。
Ace幻6nc据r训inlm菌是纤维素合成研究的最好材料(2】o9)通过选育对降解物阻遏不敏感的突变株,克服最终产物的阻遏作用,以增加纤维素酶生成量的万方数据湖北农业科学HuBElAGRIcuLTURALSCIENCESNo3,2004研究引。
斜卧青霉(Pe,l记删“m如cm6ew)JUA一10是汪天虹等多年来选育、研究的一株纤维素酶高产菌株,该菌株纤维素酶系组分较全,并有明显的抗降解物阻遏特性,在理论与应用研究中都有一定价值。
据报道,好热细菌嗜纤维素侧孢霉(却orot成umceZMDp池m)所产p一葡萄糖苷酶不受最终产物所抑制,即使葡萄糖达到18也能发挥最大反应速度的50以上(日本味之素公司中央研究所,1986)。
另外,拟康氏木霉TH(zPse础七onini)经紫外诱变获得一抗高浓度葡萄糖阻遏突变株UVIII,纤维素酶产量显著提高。
研究表明,uVIII对诱导物的敏感性增加了100倍并且对葡萄糖的吸收能力明显下降。
川。
10)粗酶与精制酶在水解过程中所出现的不同的理化性质表明:
在影响酶的活性方面仍然有许多未知因子在起作用。
1974年,发现氧气可以提高黄孢原毛平革菌降解纤维素的速率,表明该过程有氧化酶类的参与。
后来又发现纤维二糖醌氧化还原酶(cBQ)和纤维二糖脱氢酶(cDH)这两种酶中均含有纤维素吸附位点【矧。
l1)关于酶基因内部的结构及调控以及酶的空间结构的研究逐步引起人们的兴趣,因为空间结构的阐明直接为酶机理的阐明扫清障碍。
有人通过基因失活和基因置换的方法,使编码CBHI的基因失活,结果EGI的产量提高,不再产生cBHI【561。
近年发现,菌体ATP、cAMP水平是调节真菌纤维素酶合成的重要因子驯。
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