原核表达实验流程.docx
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原核表达实验流程.docx
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原核表达实验流程
原核表达实验流程
原核表达流程:
第一步
目的基因获取DH5a感受态制备
PCR扩增
pGEM-T载体
重组载体1DH5a感受态细胞
转化
转化细胞1
抽取质粒进行电泳
酶切验证检验阳性
(阳性)转化细胞1
酶切,获取目的基因
Pet28a/DH5a载体
重组
重组载体2
第二步
重组载体2DH5a感受态细胞
转化
转化细胞2
抽取质粒进行电泳
酶切验证检验阳性
(阳性)转化重组载体3
BL21感受态细胞
转化细胞3
诱导表达
蛋白质提取
SDS-PAGE电泳检测呈阳性
目的蛋白
一.感受细胞的制备
体外连接的DNA重组分子导入合适的受体细胞才能大量增殖。
为了提高受体菌摄取外源DNA的能力,提高转化效率以获得更多的转化子,人们摸索出了不同的方法处理细菌,使其处于感受态。
目前主要采用电转化法和CaCl2法将外源DNA导入受体细胞中,并需要相应地制备电转化感受态细胞和CaCl2感受态细胞。
本实验制备的是电转化感受态细胞。
实验原理:
对于电转化法,因利用瞬间高压在细胞上打孔,因而需用冰冷的超纯水多次洗涤处于对数生长前期的细胞,以使细胞悬浮液中应含有尽量少的导电离子。
(109~1010转化子/μgDNA)
实验材料:
LB培养基(根据需要确定配制的量):
10g/l胰蛋白胨,5g/l酵母提取物,10g/lNaCl,加水至1000ml,高压灭菌,保存在室温。
无抗生素LB琼脂糖平板培养基(根据需要确定配制的量):
10g/l胰蛋白胨,5g/l酵母提取物,10g/lNaCl,15g/l琼脂粉,加水至1000ml,高压灭菌;铺平板,冷却后在37℃培养24小时,保存在室温。
10%甘油:
10ml甘油加入90mlddH2O水,混匀,高压灭菌。
其他:
DH5α大肠杆菌,灭菌玻璃平皿若干,接菌环,加100mlLB液体培养基的500ml灭菌锥形瓶一个,灭菌50ml离心管若干,冰盒,移液器,灭菌移液器吸头,灭菌Eppendorf管等。
实验仪器
酒精灯,超净工作台,温控摇床,4℃离心机等。
实验方法
(1)将大肠杆菌DH5a贮存菌液在无抗的LB平板划线,37℃培养箱过夜培养(培养好的平皿放入4℃冰箱贮存备用)。
(2)从平板上挑取单菌落接种于5mL无抗生素LB培养基中,37℃振荡培养过夜;。
(3)按照1:
50比例接种过夜菌液至50mLLB培养基中,37℃剧烈振荡培养3小时左右,至OD600达0.3-0.6,最好是0.4;
(4)当OD600值达到0.4左右时,迅速将菌液冰浴15~30分钟,不时缓慢摇匀以保证内容物充分冷却。
将离心管置于冰上预冷,为下一步做准备。
(为获得最大效率的转化,在整个操作过程中菌液的温度不超过4℃是关键,以下步骤务必在超净工作台和冰上操作)
(5)将细菌培养物转移至冰冷的50mL离心管中,4℃用JA转头(或与之相当的转头)以2500rpm/min离心15min,以回收细胞。
倒去培养液,用40mL冰冷的纯水重悬沉淀。
(6)4℃用JA转头(或与之相当的转头)以2500rpm/min离心20min,以回收细胞。
倒去培养液,用25mL冰冷的10%甘油重悬沉淀。
(甘油有保存细胞的作用)
(7)4℃用JA转头(或与之相当的转头)以2500rpm/min离心20min,以回收细胞。
倒去培养液,用1mL冰冷的10%甘油重悬沉淀。
(倾倒培养液时要小心,10%甘油中的细菌沉淀附着力降低。
)
(8)将细胞按40μL等份装入微量离心管,直接使用或-80℃保存
(9)感受态细胞的检测:
取感受态细胞分别涂布含有氨苄青霉素和卡那霉素抗性的LB平板,
37℃培养12-16小时,观察感受态细菌是否有污染;
(10)取1μg超螺旋质粒转化制备的感受态,检测转化效率(一般情况下,没有必要精确计算,可用根据经验估计)。
注:
以上操作全部在无菌条件4℃冰浴下进行。
技术要点
1)无菌操作;
2)原始菌种要保证质量;
3)感受态细胞分装保存时不宜体积太大;
4)细菌活化之后,生长密度最好保证OD600为0.4-0.6;
5)冰上分装感受态细胞;
6)在-80℃保存感受态细胞,至少半年仍然可有较好的转化效率,但也不宜过久;
7)防止携带某种质粒的其它细菌污染;
8)防止其它杂菌污染。
二.DNA连接和转化
基本原理
T4DNA连接酶最初分离于T4噬菌体感染的大肠杆菌,可催化DNA5’磷酸基与3’羟基之间形成磷酸二酯键。
在本试验中,将克隆载体pGEM-T与外源DNA片段用T4连接酶连接,可将外源DNA片段插入pGEM-T质粒中,构建外源DNA的克隆载体。
质粒的转化是指将质粒或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。
将连接产物转化到感受态细胞中,实现重组克隆的增殖,便于后续分子操作。
可以采用多种方法筛选和鉴定目的克隆。
电转化法:
外加于细胞膜上的电场造成细胞膜的不稳定,形成电穿孔,不仅有利于离子和水进入细菌细胞,也有利于DNA等大分子进入。
同时DNA在电场中形成的极性对于它运输进细胞也是非常重要的。
实验材料
质粒DNA,pGEM-T载体或PET表达载体,T4DNA连接酶,连接酶缓冲液10×
buffer或2×快速连接缓冲液,灭菌纯净水,感受态细菌,LB液体培养基10ml,
含有抗生素的LB琼脂平板培养基3个,低温冰盒,微量移液器,Eppendorf管,
一次性手套、涂菌棒等。
实验仪器
恒温水浴,温控摇床,台式离心机,37℃细菌培养箱等。
实验方法
建立连接反应
(1)准备经过酶切处理的外源DNA片段和质粒载体;连接前先电泳确定待连接载体与片段的浓度
(2)配制连接反应体系(10μl反应体系)
10×连接Buffer1μl(或2×快速连接Buffer5μl)
T4连接酶1μl
待连接的样品xμl(PCR产物或胶回收产物,载体与片段的mol比为1∶3-10)
载体8-xμlor4-xμl
(3)混匀样品并短暂离心使样品全部沉于管底。
(4)将离心管置于连接酶要求的温度孵育适当的时间,一般为16℃,反应12-16小时。
或4℃连接过夜16h以上(根据不同公司的酶的要求而定)。
电转化法制备大肠杆菌感受态细胞
(1)从-80℃中取40μl感受态细胞于冰浴上融化5~10min,并将电转化杯冰浴。
(2)加入0.1~1μL纯质粒或2~5μL连接产物,轻轻吹打混匀,用移液器轻轻吸打均匀,置冰上。
(3)将要转化的混合物加入预冷的1mm的电转化杯中,电转化仪选择1800V作为输出电压,立即按下按纽电击。
(4)将电击后的转化细胞加入800μLSOC培养基中,于37℃恒温摇床上200rpm×1h温育。
(5)将菌液4000rpm/min离心3min,留200μL上清将菌体打散,均匀涂布于含适当抗生素的琼脂平板表面(根据质粒所携带抗生素抗性基因而定),平板于37℃倒置培养过夜。
i.注:
新倒的平板可于37℃培养箱中预先放置数小时至过夜干燥,放在4℃冰箱中的培养基可以先拿出来放置,让其温度升到室温。
ii.当转化的是TA克隆连接产物时可在固体培养基上加入4μL1MIPTG和40μLl20mg/mlX-gal以进行蓝白斑筛选。
三、重组基因的检测
基本原理
质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的主要载体,它在基因操作中具有重要作用。
质粒的分离与提取是最常用、最基本的实验技术。
质粒的提取方法很多,大多包括3个主要步骤:
细菌的培养、细菌的收集和裂解、质粒DNA的分离和纯化。
本实验以碱裂解法为例,介绍质粒的抽提过程,检测重组基因是否转化成功。
在含质粒的大肠杆菌混悬液中加入SDS和NaOH使菌体充分裂解,并使蛋白质和染色体DNA变性,加醋酸钠中和变性蛋白,染色体DNA及SDS沉淀,质粒DNA存于上清中,然后用乙醇进一步纯化质粒。
实验材料
1)大肠杆菌DH-5α或BL21
2)溶液I:
50mM葡萄糖;10mMEDTA;25mMTris-HCl,pH8.0。
(Tris:
三羟甲基氨基甲烷)。
3)溶液II:
0.2MNaOH;1%SDS,PH12.5。
4)溶液III:
3MNaAC;2M乙酸,pH4.8(盐酸调pH)。
5)TE缓冲液:
10mMTris-HCl,pH8.0;1mMEDTA.。
6)RNA酶A溶液:
10mg/mlRNA酶A,用TE配制,100°C煮10分钟,灭活DNA酶。
7)LB培养基:
10g胰蛋白胨,5g酵母粉,5gNaCl加水至1000ml,用1MNaOH调pH至7.5,高压灭菌。
8)氨苄青霉素:
用去离子水配成100mg/ml的储存液,过滤除菌,-20℃分装保存。
9)LA培养基:
在LB培养基中加入终浓度100μg/ml的氨苄青霉素。
10)70%乙醇
实验仪器
超净工作台,台式离心机,电泳仪
实验方法
1.取1.5ml细菌培养物于已灭菌的EP管中,12000rpm离心1分钟,弃上清液,使细菌沉淀尽量干燥;
2.将细菌沉淀重悬于用冰预冷的100µl溶液I(50mmol/L葡萄糖,10mmol/LEDTApH8.0,25mmol/LTris-HClpH8.0)中,剧烈振荡;
3.加入200µl新配制的溶液II(0.2mol/LNaOH,1%SDS(m/v)),盖紧EP管口,快速颠倒离心管5次,以混合混合物,确保离心管的整个内表面与溶液II接触,不要涡旋,置于冰浴中;
4.加入150µl预冷溶液III(每100ml的溶液III中含60ml5mol/L乙酸钾,11.5ml冰乙酸,28.5mLH2O),盖紧EP管口,反复颠倒数次,使溶液III在粘稠的细菌裂解物中分散均匀,之后将管置于冰上3~5分钟;
5.在最大转速下离心5min,取上清液于另一新EP管;
6.用两倍体积的乙醇室温沉淀双链DNA,振荡混合于室温放置2分钟,最大转速离心5分钟;
7.小心吸去上清液,将离心管倒置于滤纸上,以使所有液体都流出,在将附于管壁的液滴除尽;
8.加1ml70%乙醇洗涤沉淀,振荡混合,用12,000g离心2分钟,弃上清,将开口的EP管置于室温使乙醇挥发,直至EP管中内没有可见的液体存在(5~10分钟),用适量的TE或ddH2O溶解;
9.用0.5µl的RNase37℃温育5~10分钟;
10.电泳鉴定。
技术要点
1)每一步都要充分混匀,为获得高产量DNA,第一步需使菌体完全重悬。
2)加入碱溶液后,反复混匀使细菌充分裂解,但需要轻柔,一旦裂解(液体变清亮)必须马上加乙酸缓冲液中和。
3)70%乙醇洗涤时,离心后应小心地将上清倒掉,注意这时DNA沉淀较疏松,易从管壁上脱落。
四、质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳
基本原理
DNA在琼脂糖凝胶介质中,在电场作用下,从负极向正极移动,泳动速度取决于DNA的大小和构型,电泳后经Gel-red染色,DNA可与其结合,在紫外光下发出荧光,DNA的琼脂糖凝胶电泳可用于DNA的鉴定,定量及纯化。
2.材料、仪器
1)TAE电泳缓冲液
浓储存液50×:
242gTris碱;57.1ml冰乙酸,100ml0.5mol/LEDTA(PH8.0)
使用液1×:
0.04mol/LTris--乙酸;0.001mol/LEDTA
2)GEBS样本液
6×缓冲液:
15%聚蔗糖(Ficoll)(400型,Pharmacia)0.25%溴酚蓝
3)溴化乙锭
配成10mg/ml溶液,双蒸水配制,避光保存,用时1:
20000稀释。
溴化乙锭为致癌剂,配
制时防止皮肤接触。
4)仪器
DYY-III型稳压稳流电泳仪、水平电泳槽、微波炉、离心机,北京六一厂生产。
凝胶成像系统,上海Tanon生物技术公司。
3.方法
1)0.8%琼脂凝胶板的配制:
取0.6g琼脂糖加80mlTAE(1×),20ml水,微波炉加热融化3分
钟,将其冷却至55°C-65°C,倒入制胶槽中。
2)充分凝固后从制胶槽中卸下凝胶板,放入电泳槽,加入TAE(1×),使其液面略高于琼脂糖板,拨出样品梳。
3)DNA样品10μl加5μlGEBS样本液,在腊面纸上混匀,全部加样于琼脂糖板的样品孔中。
4)稳压电泳80V约2小时,使溴酚蓝指示剂泳动至适当位置,1-5V/cm。
5)取出凝胶板置溴化乙锭溶液中染色20分钟。
6)在凝胶成像仪观察结果。
7)琼脂糖凝胶与聚丙烯酰胺凝胶的比较:
不同浓度的琼脂糖凝胶可以分离长度为200bp-50kb的DNA。
聚丙烯酰胺凝胶分离小片段DNA(5-500bp)效果最好。
聚丙烯酰胺凝胶与琼脂糖凝胶相比有三个主要优点:
基因分子生物学实验指导
(1)分辨力强,长度仅相差0.2%(即500bp中的1bp)的DNA分子即可分开;
(2)装载DNA量大,一个样品槽可装载10ug的DNA;
(3)从聚丙烯酰胺凝胶中回收的DNA纯度很高。
4.技术要点
1)选择琼脂糖凝胶浓度取决于所鉴定DNA的大小,小片段DNA应用高浓度凝胶,大片段则用低
浓度凝胶,在1%的琼脂糖凝胶中溴酚蓝的泳动速度与500bp的双链线状DNA一致。
不同浓度琼脂糖凝胶及其可分离的线性DNA大小范围见下表1。
表1不同浓度琼脂糖凝胶及其分离线性
无抗生素LB琼脂糖平板培养基(根据需要确定配制的量):
10g/l胰蛋白胨,5g/l酵母提取物,10g/lNaCl,15g/l琼脂粉,加水至1000ml,高压灭菌;铺平板,冷却后在37℃培养24小时,保存在室温。
含有抗生素LB琼脂糖平板培养基(根据需要确定配制的量):
10g/l胰蛋白胨,5g/l酵母提取物,10g/lNaCl,15g/l琼脂粉,加水至1000ml,高压灭菌;当培养基降温至50℃左右,加入终浓度为100μg/ml的氨苄青霉素或50μg/ml卡那霉素,并铺平板,冷却后在37℃培养24小时,保存在室温。
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