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分解这个方程式可以得到容积与折射率的计算方式:
容积=f1(,SL,SH,L,H,)
折射率=f2(,SL,SH,L,H,)
应用MIE光散射理论,将可测定出血球的体积(容积)与血球的内容物浓度(折射率)。
3.ClusterAnalysis群组分析
当血球细胞经过Flowcell测定后,可得到血球细胞分布图(如下),如何通过统计学与电脑运算方式来界定各种类细胞,是血球分析仪是否准确的重要因素,其中:
ClusterAnalysis(群组分析)普遍应用在血球分析,此技术能精确的计算出如下数个群组的分界,不但定义出正常的细胞族群,对于异常细胞的出现也能提供敏感的讯息。
4.UFC(Uni-FluidicsCircuit)集成流路系统
集成流路系统就是将传统血球记数仪中所应用的管路,反应池,控制阀,试剂运送,管路清洗等功能加以整合,利用UFC特殊材质的去极性及无变形的特性,增加仪器的稳定度与降低定期保养工作频率。
5.光源
应用最新科技的二极管激光发生器,具有光源稳定,体积小,寿命长的特性。
LASERSCATTER激光散射测定
测定项目:
RBC/PLT,BASO,RETIC
DARKFIELDOPTIC卤素灯测定
白血球分类
6.Flowcell结构
1.Flowcell2.shuttleNipple3.SampleNipple4.SheathNipple
5.OpticsLens6.Mirror7.Lowangledetector8.Hiangledetector
9.lightsource
Flowcell运作原理:
鞘液经由SheathNipple进入Flowcell形成一稳定介质,再将处理过的细胞(稀释,染色或球形化)经由SampleNipple以稳定的流速注入Flowcell,当细胞通过光源时会因不同的细胞特征(体积,染色程度,血红素浓度或核密度)产生不同程度的散射,再由Flowcell后方两个探测器(高角/低角)测定光线变化,两个探测器所收集到的信号加以分析计算,就可以得到所需要的细胞特征。
7.RBC/PLT反应测定原理
红细胞计数与形态分析
反应:
稀释,球形化,固定
全血样本2ul与RBC/PLT稀释液1250ul混合,形成625倍稀释,此步反应主要是将红细胞形态改变,由原来的“双凹圆盘型”改变为‘球形’即球形化,试剂中含有固定剂可以使改变形态的红细胞保持稳定,以利于光学法测定细胞体积与血红素浓度。
MIE光散射理论的应用
血液经前处理后,样本中所含的红细胞,血小板等均呈圆球状,经由流体力学的控制,血球可以依序进入Flowcell,并通过激光照射后出现不同的光散射,利用高/低角度探测器分别测量在此两角度的吸光度变化,就可以测定出细胞的物理特性:
如细胞体积,内容物浓度,血红素浓度等参数。
MIEMAP
MAP直交展开
红细胞分布图(九分图)
1.60fl2.120fl3.28g/dl4.41g/dl
红细胞分布图相对位置
红细胞碎片2.高色素红细胞3.红细胞4.血小板
1.小红血球阈值2.大红血球阈值3.低血色素阈值4.高血色素阈值
血小板分布图相对位置
1.血小板2.大血小板3.红细胞
4.红细胞碎片5.噪音6.红细胞阴影
8.BASO通道测量原理
主要反应:
破坏红血球,血小板,白细胞裸核化
全血样本12ul与BASO稀释液500ul混合,形成41.6倍稀释,BASO稀释液为强酸性溶液可将样本中红细胞,血小板,以及嗜碱细胞(保持原态)以外的所有白细胞(裸核化)加以破坏,在经由流体控制将嗜碱细胞及裸核化的白细胞送入Flowcell,当血球经过激光照射后,应用MIE理论,测定高/低角度信号变化,就可以得出细胞体积与核密度。
MIE光散射理论之应用
如上图,为BASO通道细胞处理后示意图,低角度散射光变化可以测出细胞体积,高角度光为核密度,形成右下角的细胞分布图,其中,嗜碱细胞因为保留完整的细胞膜。
体积相较之下比其他白细胞的裸核大,因此分布在细胞分布图的上方,其余的裸核则聚集在细胞分布图的下半部分,且依照其细胞核的核密度分布,越靠近X轴左边表示核密度低或者单核,越靠近X轴右边表示核密度高或者多核。
单个核白细胞分布在左半区,包含:
Monocyte,Lymphocyte,
多个核白细胞分布在右半区,包含:
Eosinophil,Neutrophil,NRBC
利用单核细胞与多核细胞的分布就可以算出LobularityIndex,如图所示,此Index为以前判断是否左移的主要依据
BASO通道细胞分布图(正常状态)
1.噪音2.原始细胞3.MN(单核)4.Basophile嗜碱5.Baso-Suspect可疑嗜碱6.饱和区7.PMN(多核)8.NRBC(有核红细胞)
BASO(PMN/MN)不能清楚分辨时,将出现以下分布图
1.噪音2.原始细胞3.MN(单核)4.Basophile嗜碱5.Baso-Suspect可疑嗜碱6.饱和区7.PMN(多核)A.Noise/Baso阈值B.原始细胞阈值C.MN/PMN阈值D.BASO/裸核阈值E.BASO/饱和阈值
9.Retic
红细胞球形化及RNA染色
全血样本2ul加入autoretic试剂1250ul混合
试剂中含有RNA染剂Oxazine750,可渗透至网织红细胞细胞膜内,将细胞质内的RNA加以染色,细胞质内含有RNA的网织红细胞将被染成蓝色,且依照RNA含量的多少反应染色的程度,细胞膜内不含RNA的红细胞与血小板则不被染色。
网织红细胞的成熟过程:
Heilmeyer成熟度分期
网织红细胞成熟过程的分期主要以活体染色后,RNA染色的形态及RNA含量作为分类依据,以下为网织红细胞的分期与存在位置。
OType:
具有染色颗粒与细胞核的有核红细胞
-
Type:
具有RNA染色颗粒的无核红细胞。
MIE光散色理论应用:
计算细胞数量及特性分析
利用RBC/PLTChannel的光学系统,当细胞通过激光产生散射,再利用信号探测器测量各角度散射光强度,应用MIE原理计算:
低角度散射光可测定出细胞体积,高角度散射光可测定细胞血红素浓度,吸光度变化的测量可以计算出RNA染色浓度,利用以上三个测定植就可以得到完整的网织红细胞分析。
网织红细胞分布图
Retic/PLT阈值2.同时通过细胞阈值3.Retic/MatureRBC阈值4.Low/Med阈值5.Med/High阈值A.成熟红细胞B.低吸光ReticC.中吸光ReticD.高吸光ReticE.PLT/Retic阈值F.同时通过细胞
每颗网织红细胞所含的Hgb含量计算公式:
MCH(pg)=MCV(fl)*MCHC(g/dl)/100
10.PEROX白细胞分类(过氧化酶染色)
破坏红细胞,加热固定白细胞,过氧化酶染色
第一步骤:
全血样本12ul加入250ulPerox1,反应池加热到70度进行红细胞破坏之反应及
第二步骤用Perox1中甲醛固化WBC及包膜皱缩。
(17秒)
第三步骤:
同时加入125ulPerox2,主要成分为4Chrolo-1Naphol之呈色剂,及250ulPerox3,主要成分为H2O2,为过氧化酶反应中的底物,释放出O与呈色剂反应,在胞浆中产生黑色沉淀.
(13秒)
H2O+4Chrolo-1Naphol---过氧化酶细胞--------细胞内黑色沉淀
测定:
染色后的白细胞利用光学法测定染色程度,细胞体积,细胞数量
白细胞过氧化酶活性:
Eosinophil:
4+,Neutrophil:
2+to3+,Monocyte:
weak+
Lymphocyte:
negativeBasophil:
negative
染色后的白细胞通过Flowcell时,透过卤素灯为光源的白色光照射将造成不同程度的光线散射,利用Flowcell后方的两个探测器探测散射光的强弱,即可测定出白细胞的体积。
染色程度,组成过氧化酶染色的细胞分布图
PeroxidaseCytograme细胞分布图
1噪音(红细胞,血小板碎片)2.有核红细胞3.血小板凝集4.淋巴+嗜碱5.LUC6.单核7.中性8.嗜酸
11.Hgb血红素
氰化血红素比色法
全血样本2ul加入500ulHgb稀释液,主要成分为KCN及表面活性剂,可以将样本中的红细胞破坏,红细胞中的血红素与KCN反映呈色后,测定透光度的变化,再以鞘液的透光度作为背景值,利用透光度和背景值的差值就可以计算出样本中血红素的浓度。
测定光源波长:
546nm
前一样本2.样本与试剂打入反应池3.血红素透光度测定
4.反应池清洗5.鞘液透光度测定
12,MophologyFlag判定标准
1.ANISOCYTOSIS(ANISO)
+RDW=16.0%to17.9%
++RDW=18.0%to22.0%
+++RDW>
22.0%
2.MICROCYTOSIS(MICRO)
+%MICRO=2.5%to6.4%
++%MICRO=6.5%to10.5%
+++%MICRO>
10.5%
3.MACROCYTOSIS(MACRO)
+%MACRO=2.5%to6.4%
++%MACRO=6.5%to10.5%
+++%MACRO>
HGBCONCENTRATIONVARIANCE(HCVAR)
+HDW=3.4g/dLto3.9g/dL
++HDW=4.0g/dLto4.5g/dL
+++HDW>
4.5g/dL
HYPOCHROMIA(HYPO)
+%HYPO=4.0%to7.9%
++%HYPO=8.0%to12.0%
+++%HYPO>
12.0%
HYPERCHROMIA(HYPER)
+%HYPER=4.0%to7.9%
++%HYPER=8.0%to12.0%
+++%HYPER>
ATYPICALLYMPHOCYTES(ATYP)
+%LUC=4.7%to7.4%
++%LUC=7.5%to10.0%
+++%LUC>
10.0%
LEFTSHIFT(LS)
ThisflagistriggeredifBASOd/Dislessthan0.15.
Thisflagisnottriggeredif%NEUTislessthan30%.
+LI>
1.9
++LI=1.7to1.9
+++LI<
1.7
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