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无臭,味酸;
久置色渐变微黄。
在水中易溶,水溶液呈酸性,在乙醇中略溶,在三氯甲烷或乙醚中部溶。
分子中有两个手性碳原子,因而具有旋光性。
与糖的结构相似,具有糖类性质的反应结构中的烯二醇具有极强的还原性,易被氧化为去氢维生素,氢化又可还原为维生素C。
维生素C分子中具有烯二醇结构,故维生素C显酸性,能与碳酸氢钠作用生成钠盐
维生素C分子结构具有共轭双键,在稀盐酸溶液中,243nm波长处有最大吸收;
若在中性或碱性条件下,则波长红移至265nm
3实验方法
根据它具有的还原性质可以测定维生素C的含量。
常用的测定方法有:
3.1碘量法
3.1.1试验目的
(1)掌握碘标准溶液的配制与标定
(2)熟悉直接碘量法的原理
(3)学习维生素C的含量测定方法
3.1.2试验原理
Gr2O72-+6I-+14H+——→2Gr3++3I2+7H2O
I2+2S2O32-——→2I-+S4O62-
C(K2Gr2O7)V(K2Gr2O7)
C(Na2S2O3)=-------------------×
6
V(Na2S2O3)
C6H8O6+I2→C6H6O6+2HI
C(I2)V(I2)M(C6H8O)
W(C6H8O6)=--------------------×
100%
M(试样)
3.1.3仪器和试剂
仪器:
棕色试剂瓶(500ml)分析天平、吸滤瓶、量筒(50ml.100ml)、碘量瓶(250ml)、试剂瓶(500ml)、锥形瓶(250ml)、烧杯(500ml)、砂芯漏斗、酸式滴定管(50ml)、移液管(25.00ml)台秤及研钵、棕色容量瓶(1000ml)等
试剂:
碘(A.R.)、维生素C片剂、0.5%淀粉指示剂、Na2S2O35H2O、Na2CO3、K2Gr2O7(120℃烘干)、HCl(mol)、KI(20%)溶液、碘化钾(A.R.)、HAC(2mol/l)、硫代硫酸钠(0.1mol/l)、HAC(2mol/l)等
3.1.4实验步骤
(1)0.05MOL/L碘标准溶液的配制
称取6.6g和10gKI置于玻璃研钵中,加少量水研磨,待碘全部溶解后,将溶液转入棕色试剂瓶中,加两滴浓盐酸,用蒸馏水稀释至500ml,摇匀,用砂芯漏斗过滤后,置于阴暗处保存
(2)碘溶液的标定
准确称取25.00ml碘溶于250ml锥形瓶中加入50ml蒸馏水,用前一试验已标定过的0.1mol/LNa2S2O4标准溶液滴定至浅黄色,加入2ml淀粉指示剂继续滴定至溶液的蓝色恰好消失,即为终点,平行标定3次,记录消耗的Na2S2O4标准溶液的体积,计算I2标准溶液的浓度。
表3-1Na2S2O4标准溶液的配制与标定
试样/数据处理
(1)
(2)
(3)
称样前m(K2Gr2O7)g
22.1840
称样后m(K2Gr2O7)g
20.1901
22.1901
m(K2Gr2O7)g
1.9939
V(Na2S2O4)/(mL)
38.01
37.98
C(Na2S2O4/
(mol/L)
0.1070
0.1071
平均浓度
Rd
0.0312
表3-20.1mol/LI2标准溶液的配制与标定
称m(I2+KI)g
12.8000
平均C(Na2S2O4)/(mol/L)
25.00
V(I2)/(mL)
13.06
13.02
13.05
C(I2)/mol
0.1024
0.1027
0.1025
0.0976
(3)维生素C含量的测定
准确称取0.2g研碎的维生素C于250ml锥形瓶中,加入100ml新煮沸过的冷蒸馏水,
2MOL/LHAC溶液10ml使之溶解,加入2ml淀粉指示剂,立即用I2标准溶液地至溶液呈蓝色并保持0.5min不退色,即为终点。
平行滴定3次,记录I2标准溶液的用量,计算维生素C的含量。
表3-3VC药中VC含量的测定
称m(VC药片)
0.0750
平均C(I2)/mol
W(C6H8O6)
平均W(C6H8O6)
3.2维生素C的高效液相色谱法定量测定
3.2.1所用仪器和试剂:
(1)仪 器:
Agilent1100安捷伦高效液相色谱仪,二极管阵列检测器;
高压输液泵均为(美国惠普公司);
色谱柱HYPERSIL-C18(5μm,150mm*4.6mm)(中国科学院兰州化学物理研究所);
KQ5200B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);
平头微量进样器(25uL);
AE系列电子天平(精确度为0.00001)(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司);
SQ2119N多功能食品榨汁机(上海帅佳电子科技有限公司)。
(2)试 剂:
维生素C标准对照品(维生素C含量99.7%,中国医药集团化学试剂公司制);
草酸(分析纯,中国医药集团化学试剂有限公司);
福建蜜柚(市售);
三次蒸馏水;
甲醇(色谱纯,上海化学试剂研究所);
无水磷酸二氢钾(分析纯,上海实意化学试剂有限公司);
磷酸氢二钠(分析纯,中国医药集团化学试剂有限公司)。
3.2.2样品处理及实验条件
取本品研磨均匀的细粉适量(约相当于维生素C22.5mg),置50ml量瓶中,加流动相适量,振摇使溶解,加流动相稀释至刻度,摇匀,滤过,精密量取续滤液20μl注入液相色谱仪,记录色谱图;
另取维生素C对照品同法测定,用峰面积以外标法计算,即得。
维生素C标准溶液的制备:
准确称取维生素C标准品50mg于小烧杯中,用0.1%草酸溶液溶解,转移至50mL棕色容量瓶中,稀释至刻度,得到维生素C含量为1000μg/mL的标准溶液。
HPLC检测条件:
A:
pH6.0,0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲液,B:
甲醇;
(A:
B=80:
20V/V)为流动相溶液[11-12],流速1.0mL/min;
检测波长254nm,进样量10μL,柱箱温度25℃。
3.2.3结果与讨论
(1)维生素C检测波长的选择
维生素C溶液在254nm有最大吸收,故本实验以254nm作为检测波长。
(2)样品溶剂的选择
液体维生素C具有较强的还原性,易受空气、热、光等因素影响,但在酸性溶液中却很稳定.为防止样品及标样中维生素C被氧化分解[8],用0.1%草酸溶液作溶剂来溶解样品及标样。
(3)流动相的选择
流动相pH值的选择:
考虑到维生素C在酸性环境中比较稳定,所以选择调整流动相PH值为酸性。
经过采用不同值的实验证明,pH值在5.0-6.5之间,维生素C的吸收比较大,灵敏度比较高,最终选择pH为6.0[11-12]。
流动相的配比选择:
经实验:
pH6.0,0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲液与甲醇配比从85:
15;
80:
20;
75:
25;
70:
30;
但80:
20峰形较好,考虑到了出峰快了杂质干扰较大,出峰慢了,实验时间变长,最后确定了80:
20的配比[9]。
(4)标准工作曲线绘制
用0.1%草酸溶液分别配制浓度20mg.L-1,40mg.L-1,60mg.L-1,80mg.L-1,100mg.L-1维生素C标准溶液,定容至50mL,溶液用0.45μm虑膜(水型)过滤后用微量进样器(25μL)进样10uL.测定出维生素C标准溶液浓度对应的峰面积;
然后以VC标准溶液浓度(mg/L)作自变量,相对应的峰面积作因变量;
绘制标准工作曲线见图3-1
图3-1维生素C的标准工作曲线
(5)回收率实验
在测定完蜜柚样品溶液中的维生素C含量后,分别取样品5mL,再在样品中加入浓度为100μg/mL的维生素标准溶液,定容至25mL,进行峰面积的测定,然后将得到的峰面积代入线性回就可以得到一个相应的Vc测量值,经计算即可得到VC的回收率。
具体加收率试验结果见表3-4
表3-4 回收率实验结果
编号
样品中维
生素C量/μg
加入维生素C标准样品量/μg
测得的维生素C量/μg
回收率/%
1
194.25
100
271.86
92.39
2
200
378.24
95.94
3
300
531.32
107.50
4
400
630.38
106.08
5
500
664.19
95.67
(6)精密度实验
同一蜜柚样品在同一实验条件下测定8次,实验结果见表3-5.标准样品色谱图见图3-2,蜜柚色谱图见图3-3,其1.580min峰为标准样品维生素C色谱峰,1.589min峰为蜜柚样品维生素C色谱峰。
表3-5精密度实验结果(n=8)
维生素C测定结果mg/100mL
平均值mg/100mL
标准偏差
相对标准偏差/%
38.97,38.95
38.42,38.44
38.88,39.77
39.07,38.33
38.85
0.4696
1.21
图3-2标准样品色谱图
图3-3蜜柚样品色谱图
3.2.4结论
由于维生素C对光不稳定,遇氧易分解,故本实验应避光操作,整个实验均用棕色容量瓶定容[13];
流动相均需色谱纯度,水用高纯度水,脱气后的流动相要小心尽量不引起气泡;
所有过柱子的液体均需严格的过滤;
压力不能太大,最好不要超过150Bar。
由图3-1可知,其标准工作曲线的相关系数R2为0.9994,说明曲线的线性关系较好,分析中受样品中其他杂质的影响较小。
从表3-4中可以看到,本文采用A:
pH6.0,0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲液;
B:
:
甲醇,(A:
B=80:
20V/V)作流动相的高效液相色谱法,测定蜜柚中维生素C的含量,回收率为92.4~107.5%,说明该方法具有所需试剂少、稳定、操作简便等特点。
从表3-5中可以得到:
精密度实验的相对标准偏差小于2%,说明该方法重复性和再现性都是比较高的。
而且从蜜柚样品色谱图中看到,该方法分析维生素C的含量大约需要2min,具有灵敏、快速的特点.由以上分析可知:
本文采用的分析方法是可靠的,它也适合于从其它蔬菜、水果中提取维生素C的测定[4][8]。
3.3荧光法
3.3.1原理
样品中还原型抗坏血酸经活性炭氧化成脱氢型抗坏血酸后,与邻苯二胺(OPDA)反应生成具有荧光的喹喔啉(quinoxaline),其荧光强度与脱氢抗坏血酸的浓度在一定条件下成正比,以此测定食物中抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的总量。
脱氢抗坏血酸与硼酸可形成复合物而不与OPDA反应,以此排除样品中荧光杂质所产生的干扰。
本方法的最小检出限为0.022
g/ml。
3.3.2适用范围
GB12392-90
本方法适用于蔬菜、水果及其制品中总抗坏血酸的测定
3.3.3仪器
(1)实验室常用设备。
(2)荧光分光光度计或具有350nm及430nm波长的荧光计。
(3)打碎机。
3.3.4试剂
本实验用水均为蒸馏水,试剂不加说明均为分析纯试剂。
(1)偏磷酸-乙酸液:
称取15g偏磷酸,加入40ml冰乙酸及250ml水,搅拌,放置过夜使之逐渐溶解,加水至500ml。
4℃冰箱可保存7~10天。
(2)0.15
mol/L硫酸:
取10ml硫酸,小心加入水中,再加水稀释至1200ml。
(3)偏磷酸-乙酸-硫酸液:
以0.15mol/L硫酸液为稀释液,其余同4.1.配制。
(4)50%
乙酸钠溶液:
称取500g乙酸钠(CH3COONa·
3H2O),加水至1000ml。
(5)硼酸-乙酸钠溶液:
称取3g硼酸,溶于100ml乙酸钠溶液(4.4)中。
临用前配制。
(6)邻苯二胺溶液:
称取20mg邻苯二胺,于临用前用水稀释至100ml。
(7)0.04%百里酚蓝指示剂溶液:
称取0.1g百里酚蓝,加0.02mol/L氢氧化钠溶液,在玻璃研钵中研磨至溶解,氢氧化钠的用量约为10.75ml,磨溶后用水稀释至250ml。
变色范围:
pH=1.2
红色
pH=2.8
黄色
pH>4.0
兰色
(8)活性炭的活化:
加200g炭粉于1L
1+9盐酸中,加热回流1~2h,过滤,用水洗至滤液中无铁离子为止,置于110~120℃烘箱中干燥,备用。
(9)标准
抗坏血酸标准溶液(1mg/ml):
准确称取50mg抗坏血酸,用溶液(4.1)溶于50ml容量瓶中,并稀释至刻度。
抗坏血酸标准使用液(100μg/ml):
取10ml抗坏血酸标准液,用偏磷酸-乙酸溶液稀释至100ml。
定容前试pH值,如其pH>2.2时,则应用溶液(4.3)稀释。
标准曲线的制备:
取下述"
标准"
溶液(抗坏血酸含量10μg/ml)0.5、1.0、1.5和2.0ml标准系列,取双份分别置于10ml带盖试管中,再用水补充至2.0ml。
3.3.5操作步骤
(1)样品制备
全部实验过程应避光。
称取100g鲜样,加100g偏磷酸-乙酸溶液,倒入打碎机内打成匀浆,用百里酚蓝指示剂调试匀浆酸碱度。
如呈红色,即可用偏磷酸-乙酸溶液稀释,若呈黄色或兰色,则用偏磷酸-乙酸-硫酸溶液稀释,使其pH为1.2。
匀浆的取量需根据样品中抗坏血酸的含量而定。
当样品液含量在40~100μg/ml之间,一般取20g匀浆,用偏磷酸-乙酸溶液稀释至100ml,过滤,滤液备用。
(2)氧化处理:
分别取样品滤液及标准使用液各100ml于带盖三角瓶中,加2g活性炭,用力振摇1min,过滤,弃去最初数毫升滤液,分别收集其余全部滤液,即样品氧化液和标准氧化液,待测定。
(3)各取5ml标准氧化液于2个50ml容量瓶中,分别标明"
及"
标准空白"
。
(4)各取5ml样品氧化液于2个50ml容量瓶中,分别标明"
样品"
样品空白"
(5)于"
溶液中各加5ml硼酸-乙酸钠溶液,混合摇动15min,用水稀释至50ml,在4℃冰箱中放置2h,取出备用。
(6)于"
溶液中各加入5ml50%乙酸钠溶液,用水稀释至50ml,备用。
(7)荧光反应
取"
溶液,"
溶液及(5.6)中"
溶液各2ml,分别置于10ml带盖试管中。
在暗室中迅速向各管中加入5ml邻苯二胺,振摇混合,在室温下反应35min,用激发光波长338nm、发射光波长420nm测定荧光强度。
标准系列荧光强度分别减去标准空白荧光强度为纵坐标,对应的抗坏血酸含量为横坐标,绘制标准曲线或进行相关计算,其直线回归方程供计算时使用。
3.3.6计算
X=(c×
V/m)×
F×
(100/1000)
式中:
X-----样品中抗坏血酸及脱氢抗坏血酸总含量,mg/100g;
c------由标准曲线查得或由回归方程算得样品溶液浓度,μg/ml;
m-----试样质量,g;
F------样品溶液的稀释倍数;
V------荧光反应所用试样体积,ml。
例:
测定每一制备溶液的荧光强度。
用标准溶液每ml含2.5μg、5.0μg、7.5μg及10.0μg,各标准浓度管读数减去相应的标准空白读数的各平均值做标准曲线。
由样品液读数减去样品液空白读数之值,从标准曲线上查得相应的抗坏血酸(μg/ml),按取样量及稀释率计算样品中抗坏血酸的含量。
如:
取制备好的辣椒样品2.138g,稀释到100ml,氧化后分别取10ml滤液稀释到50ml
样品读数为23.34,样品空白读数为3.188,样品读数减去样品空白读数为20.152,查荧光标准曲线相当标准抗坏血酸的2.23μg。
23×
100×
50×
100
------------------------=52(mg/100g)
2.138×
10×
1000
3.3.7注意事项
(1)大多数植物组织内含有一种能破坏抗坏血酸的氧化酶,因此,抗坏血酸的测定应采用新鲜样品并尽快用偏磷酸-醋酸提取液将样品制成匀浆以保存维生素C。
(2)某些果胶含量高的样品不易过滤,可采用抽滤的方法,也可先离心,再取上清液过滤。
(3)活性炭可将抗坏血酸氧化为脱氢抗坏血酸,但它也有吸附抗坏血酸的作用,故活性炭用量应适当与准确,所以,应用天平称量。
我们的实验结果证明,用2g活性炭能使测定样品中还原型抗坏血酸完全氧化为脱氢型,其吸附影响不明显。
3.44-二硝基苯肼法
3.4.1原理
总抗坏血酸包括还原型、脱氢型和二酮古乐糖酸。
样品中还原型抗坏血酸经活性炭氧化为脱氢抗坏血酸,再与2,4-二硝基苯肼作用生成红色脎,脎的含量与总抗坏血酸含量成正比,进行比色测定。
3.4.2适用范围
本方法适用于蔬菜、水果及其制品中总抗坏血酸的测定。
3.4.3仪器
(1)恒温箱:
37±
0.5℃
(2)可见-紫外分光光度计
(3)打碎机
3.4.4试剂
本实验用水均为蒸馏水,试剂纯度均为分析纯。
(1)4.5mol/L硫酸:
谨慎地加250ml硫酸(比重1.84)于700ml水中,冷却后用水稀释至1000ml。
(2)85%硫酸:
谨慎地加900ml硫酸(比重1.84)于100ml水中。
(3)2%2,4-二硝基苯肼溶液:
溶解2g
2,4-二硝基苯肼于100ml4.5mol/L硫酸内,过滤。
不用时存于冰箱内,每次用前必须过滤。
(4)2%草酸溶液:
溶解20g草酸于700ml水中,稀释至1000ml。
(5)1%草酸溶液:
稀释500ml
2%草酸溶液到1000ml。
(6)1%硫脲溶液:
溶解5g硫脲于500ml
1%草酸溶液中。
(7)2%硫脲溶液:
溶解10g硫脲于500ml1%草酸溶液中。
(8)1mol/L盐酸:
取100ml盐酸,加入水中,并稀释至1200ml。
(9)活性炭:
将100g活性炭加到750ml
1mol/L盐酸中,回流1~2h,过滤,用水洗数次,至滤液中无铁离子(Fe3+)为止,然后置于110℃烘箱中烘干。
(10)标准
①抗坏血酸标准溶液(1mg/ml):
溶解100mg纯抗坏血酸于100ml
②标准曲线绘制
加1g活性炭于50ml标准溶液中,摇动1min,过滤。
取10ml滤液放入500ml容量瓶中,加5.0g硫脲,用1%草酸溶液稀释至刻度。
抗坏血酸浓度为20μg/ml。
取5,10,20,25,40,50,60ml稀释液,分别放入7个100ml容量瓶中,用1%硫脲溶液稀释至刻度,使最后稀释液中抗坏血酸的浓度分别为1,2,4,5,8,10及12μg/ml。
按样品测定步骤形成脎并比色。
以吸光值为纵坐标,以抗坏血酸浓度(μg/ml)为横坐标绘制标准曲线。
3.4.5操作步骤
①鲜样制备:
称100g鲜样和100g2%草酸溶液,倒入打碎机中打成匀浆,取10-40g匀浆(含1-2mg抗坏血酸)倒入100ml容量瓶中,用1%草酸溶液稀释至刻度,混匀。
②干样制备:
称1-4g干样(含1-2mg抗坏血酸)放入乳钵内,加入1%草酸溶液磨成匀浆,倒入100ml容量瓶中,用1%草酸溶液稀释至刻度,混匀。
③将上述两液过滤,滤液备用。
不易过滤的样品可用离心机沉淀后,倾出上清液,过滤,备用。
取25ml上述滤液,加入0.5g活性炭,振摇1min,过滤,弃去最初数毫升滤液。
取10ml此氧化提取液,加入10ml
2%硫脲溶液,混匀。
(3)呈色反应
①于三个试管中各加入4ml稀释液。
一个试管作为空白,在其余试管中加入1.0ml
2%2,4-二硝基苯肼溶液,将所有试管放入37±
0.5℃恒温箱或水浴中,保温3h。
②3h后取出,除空白管外,将所有试管放入冰水中。
空白管取出后使其冷到室温,然后加入1.0ml
2%2,4-二硝基苯肼溶液,在室温中放置10~15min后放入冰水内。
其余步骤同样品。
③85%硫酸处理:
当试管放入
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