相分离免疫分析的研究进展.docx
- 文档编号:38319
- 上传时间:2023-04-28
- 格式:DOCX
- 页数:18
- 大小:28.49KB
相分离免疫分析的研究进展.docx
《相分离免疫分析的研究进展.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《相分离免疫分析的研究进展.docx(18页珍藏版)》请在冰点文库上搜索。
相分离免疫分析的研究进展
相分离免疫分析的研究进展
(作者:
___________单位:
___________邮编:
___________)
【摘要】相分离免疫分析通过开展快速的均相反应和简单的异相分离而兼具了均相免疫与异相免疫的优点,方法易于实现自动化。
本文介绍了相分离免疫分析的基本原理,对相分离免疫分析载体、固定化方式、标记物、应用及发展方向进行了评述。
引用文献60篇。
【关键词】免疫分析,相分离,环境敏感,温度敏感,pH敏感,评述
1引言
相分离免疫分析是指将抗原(Antigen,Ag)或抗体(Antibody,Ab)与某种特殊载体偶联(这种载体会随着外部环境的微小变化而产生沉淀与溶解的突变),均相溶液中Ag和Ab温育反应,然后调节外界环境变化,偶联有反应复合物的载体沉淀,与原料分离后测定。
由于是均相反应,反应速度与程度均大于异相反应,又因为同异相免疫一样是在分离之后进行测定,灵敏度与异相免疫分析相当,因此该方法兼具了均相和异相免疫的优点。
1986年Jones等[1]以摘要形式首次报道了相分离免疫分析,随后Hoffman等发表了第一篇研究论文[2]。
目前,相分离免疫分析方法已经得到越来越广泛的应用。
以固定化Ag及标准Ag竞争性与标记Ab发生免疫反应的竞争法为例,其步骤如下:
(1)将Ag固定到相分离载体上,标记物与Ab相连,调节外界环境,在载体为均相时固定化Ag、标准Ag、标记Ab混合反应;
(2)改变外界环境,偶联有免疫复合物的载体沉淀;(3)离心,倾去上层清液,得到复合物沉淀;(4)调节外界环境,沉淀重新溶于缓冲溶液;(5)改变环境使载体沉淀析出;(6)离心倾去上清液(4~6步是清洗沉淀步骤,其目的是为了清除非特异吸附的标记Ab和标准Ag);(7)沉淀加入缓冲溶液或显色底物;(8)转移到比色皿或微孔板信号测定。
其分析步骤如图1所示[3]。
夹心型免疫分析只在第
(1)步有所不同,是将Ab固定在相分离载体上,均相条件下固定化Ab、标准Ag、标记Ab混合反应,形成夹心型复合物。
本文对相分离免疫分析载体种类、Ag或Ab在载体上的固定化方式、相分离免疫分析的标记物类型、相分离免疫分析的应用等方面进行了系统评价。
图1相分离免疫分析原理图(略)
Fig.1Schematicdiagramofphaseseparationimmunoassay
2相分离免疫分析载体种类
免疫分析的载体通常为聚苯乙烯微孔板、磁性微球等,但相分离免疫分析的载体为环境敏感物质,并以环境敏感相分离高分子为主,这些高分子能够因环境如温度、pH、离子强度、电场、光等[4]的微小变化产生相应的沉淀与溶解突变,其中用于相分离免疫的以温度敏感高分子和pH敏感高分子最为常见。
2.1温度敏感相分离高分子载体
温度敏感相分离高分子是指针对外界温度的细微变化,能够产生沉淀与溶解突变的一类高分子。
聚(N异丙基丙烯酰胺,polyNisopropylacrylamide,PNIP)是一种应用最为广泛的温度敏感高分子类载体,其水溶液在31℃左右发生相变,又称临界溶解温度(Lowercriticalsolutiontemperature,LCST)。
温度高于LCST时,PNIP沉淀;低于LCST时,PNIP溶解。
文献[5]报道,PNIP之所以出现温度敏感的特性,是因为低温时,PNIP的亲水基与水形成氢键,导致高分子溶解,随温度升高,氢键减弱,高分子链内部的疏水基通过疏水作用互相缔合,高分子便沉淀出来。
最初的相分离免疫分析研究均以PNIP作为载体[6~11],直到1998年才出现新型载体的报道[12]。
免疫反应一般要求在生理温度37℃附近最为适宜[13],但以PNIP为载体,反应温度必须低于31℃,这样会不可避免地影响反应速率和效率。
林鹏等[14]曾将N异丙基丙烯酰胺(Nisopropylacrylamide,NIP)与丙烯酰胺(Acrylamide,AA)共聚,合成了另一种温度敏感高分子P(NIPAA),有效提高了LCST,使得免疫反应能够在31℃以上进行。
2.2pH敏感相分离高分子载体
通过改变温度敏感高分子LCST的方法只能部分提高免疫反应温度,仍旧不能在生理温度进行免疫反应。
沉淀温度过高,易使Ag或Ab受到不同程度的破坏,应用pH敏感相分离高分子可以从根本上解决高温对Ag或Ab的破坏问题,该类高分子能对外界pH的细微变化做出响应,并产生相应的沉淀与溶解突变。
与温度敏感高分子相比,pH敏感高分子具有以下优点:
(1)可以在37℃进行免疫反应,从而进一步提高免疫反应的速度和效率;
(2)制备方法多,可以根据不同的免疫体系制备不同的高分子;(3)本身带有可标记基团,易于Ag或Ab的固定化。
因此,pH敏感高分子在相分离免疫分析中有着更好的应用前景。
周平等[12]合成了两种pH敏感高分子材料:
甲基丙烯酸甲酯(Methylmethacrylate,MMA)和丙烯酸(Acrylicacid,ACA)的共聚物P(MMAACA)以及甲基丙烯酸(Methacrylicacid,MAA)和AA的共聚物P(MAAAA),其发生相转变的pH值又称临界溶解pH(LowercriticalsolutionpH,LCSP),分别为3.2及3.7,他们将这种高分子材料首次用于相分离免疫分析中,使得免疫反应能够在生理温度进行,开拓了pH敏感高分子材料的应用范围,克服了温度敏感高分子材料作为载体的缺点。
但上述高分子材料的LCSP偏离中性的生理pH太远,又引入另外一个问题,分离时酸性环境仍会对AgAb免疫复合物造成破坏。
文献[15,16]曾以NIP和MAA共聚合成了高分子材料P(MIPMAA),在37℃下将LCSP提高到pH5.6。
疏水性共聚单体的引入可以使高分子材料的LCSP向中性移动[17],据此在P(MIPMAA)中,引入少量疏水性单体甲基丙烯酸丁酯(Butylmethacrylate,BMA),发现其LCSP增加到了pH6.0[18]。
这两种高分子材料均已成功应用于相分离免疫分析。
上述的高分子材料均含酸性基团,pH值在LCSP以下沉淀,在LCSP以上溶解。
研究发现,将NIP与含有氨基的N,N′二甲基氨丙基甲基丙烯酰胺(N,N′dimethylaminopropylmethacrylamide,DMAPM)共聚,可合成出LCSP在pH7.4含有碱基的敏感高分子材料P(NIPDMAPM),当溶液pH<7.4时,溶液呈透明状;pH>7.4时,该溶液出现沉淀。
这种高分子材料可与含酸性基团的敏感高分子材料互为补充,适用于酸性条件下不稳定物质的测定,将其用于免疫分析的载体,分离时对AgAb复合物造成的损坏达到最低[19,20]。
2.3聚电解质载体
聚电解质也是一种高分子材料。
Yazynina等[21]将Ab固定在聚甲基丙烯酸盐阴离子[poly(methacrylate)polyanion,PMA-]上,该聚电解质完全溶于水,均相状态下发生免疫反应,然后将免疫复合物溶液转移到聚(N乙基4乙烯基吡鎓盐)阳离子(Poly(Nethyl4vinylpyridinium,PVP+)包被的微孔板中,形成聚阳离子聚阴离子对沉淀,免疫复合物因此也被固定到微孔板中,倾倒上层清液异相分离,即可进行测定。
与环境敏感相分离高分子材料作为载体相比,这样的实验设计方式省去了离心步骤,方法更加简便,同时,通过离子对的方式形成沉淀与改变温度或者pH值相比,对免疫复合物几乎没有损害。
2.4生物大分子类载体
目前,用于相分离免疫载体的生物大分子仅有类弹性蛋白(elastinlikepolypeptide,ELP),ELP在水溶液中的沉淀溶解性质与温度敏感高分子材料相似,其LCST约为32℃,Kim等[22,23]以ELP为载体进行了相分离免疫法的探索工作。
高分子材料的分子量具有多分散性特点,合成高分子材料的单体及引发剂均对生物体有一定毒性,并对环境造成污染,由于ELP本身就是蛋白质,与Ag和Ab有更好的生物相容性,同时,ELP可以根据其编码基因在大肠杆菌中得到表达,分子量及结构可预先严格控制,克服了高分子材料作为载体的缺点,是相分离免疫分析的一个发展方向。
但其缺点是ELP为生物活性物质,易失活,稳定性不如高分子材料,同时实验成本较昂贵。
3Ag(或Ab)在载体上的固定化方式
3.1氧化还原引发聚合的固定方式
以Ag的固定为例,Ag上的氨基与N羟基琥珀酰亚胺丙烯酸酯(Nhydroxysuccinimidylacrylate,NAS)偶联,然后以N,N,N′,N′四甲基乙二胺(N,N,N′,N′tetramethylethylenediamine,TEMED)和过硫酸铵(Ammoniumpersulphate,APS)为引发剂,通过氧化还原引发和形成高分子材料的单体共聚(如图2)。
这是一种应用最为广泛的固定化方式[24,25],利用同样具有双键结构的NAS可将Ag分别固定到温度敏感高分子材料PNIP上[26]和pH敏感高分子材料P(MAAAA)上[27]。
固定方式简便快速,但是在固定之后再聚合,自由基引发过程会对Ag活性造成损害,高分子材料在生物活性物质表面的缠绕有可能造成Ag免疫活性的降低,固定化效率也不高,此外NAS的存在使得共聚产生的高分子材料环境敏感性质受到影响。
图2氧化还原引发聚合的固定方式(略)
Fig.2Immobilizationmodebyredoxinitiationpolymerization
3.2热引发聚合的固定化方式
为了解决以上问题,采用热引发聚合的固定方式,将NAS与高分子材料单体在有机溶剂中溶解,加热状态下以偶氮二异丁腈(2,2′azobisisobutyronitrile,AIBN)为引发剂热引发共聚,高分子材料分离出来后,由于NAS是一种非常容易与Ag的氨基发生反应的活性酯,因此在缓冲溶液中即可将Ag固定到高分子材料上(如图3)。
赵金富等[28]采用热引发聚合的方法将半抗原固定到温度敏感高分子材料PNIP上。
本课题组[29]也采用这种方法将Ag固定在pH敏感高分子材料P(MIPMAA)上,Ag的固定化效率、免疫反应活性和检测限均有明显改进。
此外,在由BMA,MAA和NIP共聚的pH敏感高分子材料中,BMA不溶于水,如果采用先将NAS与Ag偶联,后与单体共聚的氧化还原引发固定方式,Ag在有机溶剂中反应,导致活性丧失,改用NAS在有机溶剂中先以热引发方式与单体共聚,然后在水溶液中与Ag偶联,有效解决了Ag的活性丧失问题[18]。
Ag在pH敏感高分子材料P(MMAACA)的固定是以顺丁烯二酸酐(Maleicanhydride,MAD)代替NAS,热引发聚合后MAD与Ag的氨基形成酰胺得以固定[12]。
由于是在共聚反应之后再固定,和氧化还原引发聚合相比,固定化抗原保持了更高的免疫活性,也避免了高分子材料链在Ag表面的缠绕,但NAS对pH敏感性质的影响仍不能消除。
此外,操作比较繁琐,残留的有机溶剂可能影响Ag的活性。
图3热引发聚合的固定方式(略)
Fig.3Immobilizationmodebythermalinitiationpolymerization
3.3碳二亚胺(EDC)偶联的固定化方式
通过双功能试剂碳二亚胺(NethylN′(3dimethylaminopropyl)carbodiimidehydrochloride,EDC)活化高分子材料的羧基,然后与Ag氨基相连(如图4),发现固定化效率及固定Ag的免疫反应活性有较大提高[30]。
而且由于是在合成高分子材料后再固定,开始的共聚阶段无论采用热引发还是氧化还原引发均不影响后续偶联Ag过程。
对于pH敏感高分子材料P(NIPMAA),由于其本身即带有羧基,通过此方式可以成功进行Ag的固定,但对于不带有活性基团的温度敏感高分子材料如PNIP,文献[31,32]采用加入链转移试剂巯基乙酸的方式合成了带羧基末端的敏感高分子材料,通过EDC将Ag的氨基与高分子材料的羧基相连。
而Ab在聚电解质载体PMA-上的固定[21],是通过PMA-本身所带羧基被EDC激活,和N羟基琥珀酰亚胺(NHydroxysuccinimide,NHS)反应,高分子材料链上具有高度反应活性的琥珀酰亚胺基团被葡萄球菌蛋白A(StaphylococcalproteinA,SpA)的氨基取代后将SpA固定到高分子材料上,SpA特异性地和Ab的Fc段反应,从而达到固定Ab的效果,这种固定方式可以有效防止Ab之间的偶联。
图4EDC偶联的固定方式(略)
Fig.4ImmobilizationmodebyNethylN′(3dimethylaminopropyl)carbodiimidehydrochloride(EDC)
3.4分子生物学固定化方式
Ag(或Ab)在高分子材料上的固定均是采用化学偶联的方法,相对于分子生物学固定化方式,具有相对简便、快速的优点,但Ag(或Ab)在高分子材料上的固定是随机的,并不能严格控制Ag(或Ab)在高分子材料上的固定个数和位置,这势必会影响到免疫分析的精确性。
Kim等[23]将ELP基因与Ab基因进行重组,构建重组表达质粒,转化大肠杆菌,经异丙基βD硫代半乳糖苷(IsopropyβDthiogalactoside,IPTG)诱导后得到ELPAb的融合蛋白,用这种基因重组技术可以准确控制Ab在ELP上的位置和个数。
后来他们又将这种方法进行了改进[22],以SpA基因代替Ab基因,构建ELPSpA重组基因,表达后得到偶联有SpA的ELP,由于SpA与Ab的Fc段有特异亲和力,因此可以和各种Ab特异性结合,方法更具有通用性。
但这种固定方法只有载体为生物活性物质才适用,高分子材料上的固定无法通过基因重组表达的方式得到。
4相分离免疫分析的标记物类型
4.1荧光标记物
免疫分析的灵敏度与标记物类型密切相关,其中荧光标记物由于免疫反应之后可以直接测量荧光信号,简便快速,因此应用更为广泛,其中又以异硫氰酸荧光素(Fluoresceinisothiocyanate,FITC)为主。
既可以进行竞争型免疫,又可以进行夹心型免疫分析,竞争型免疫分析有两种类型:
Ab和载体偶联固定,FITC标记的Ag与标准Ag竞争性地与固定化Ab反应[33,34];Ag与载体偶联,FITC标记Ab(AbFITC),固定化的Ag与标准Ag竞争性与AbFITC反应[35,36]。
夹心型免疫分析是将Ab固定在载体上,加入标准Ag和AbFITC,免疫反应后形成夹心型免疫复合物[37]。
4.2酶标记物
酶是另外一种常用于相分离免疫分析的标记物,最常用的是辣根过氧化物酶(Horseradishperoxidase,HRP)[38],由于酶的放大作用,灵敏度相对较高。
根据反应后测量信号的不同可以将底物分为显色底物和荧光底物,高军等[39]以4氨基安替比林和H2O2为显色剂,通过505nm处吸光度变化测量反应初速度,对Ag进行定量分析。
邻苯二胺(oPhenylenediamine,OPD)[2]是另一种常用显色试剂,但需避光保存,反应产物为黄色,在492nm处有最大吸光度。
3,3′,5,5′四甲基联苯胺(3,3′,5,5′Tetramethylbenzidine,TMB)[1,6,9,12,27]对光比较稳定,因此应用更为广泛,可分别在450和630nm处测量吸光度。
2,2次偶氮基双(3乙基苯噻唑啉6磺酸)[2,2azinobis(3ethylbenzthiazoline6sulfonicacid),ABTS][21]是另一种新型显色剂,在400~410nm处有最大吸收。
对羟基苯乙酸(pHydroxyphenylaceticacid,pHPA)是一种荧光底物试剂,与H2O2作用后可产生最大激发和发射波长分别为320和410nm的荧光[19]。
对羟基苯丙酸(pHydroxyphenylpropionicacid,pHPPA)是另一种性能优良的荧光底物试剂[6]。
酶的空间位阻大,标记酶会对抗原抗体的结构产生一定的影响,此外对热、碱、酸都不稳定,极易失活,限制了它的应用。
基于此,Zhu等[40]对模拟酶在相分离免疫分析中的应用进行了深入研究,模拟酶性质稳定,在室温下可保存数月,且分子量小,标记后对抗原抗体免疫反应影响不大,他们以氯化血红素(Hemin)为HRP模拟酶,首次用作相分离免疫分析的标记物,并且开发了一种价格低廉的新型荧光底物试剂——盐酸硫胺素,荧光反应后激发波长在373nm,发射波长在440nm[41]。
此外,他们还合成了四磺基铁酞菁(Irontetrasulfonatophthalocyanine,FeTSPc)作为HRP模拟酶进行相分离免疫分析[42]。
而用带活性末端的温度敏感高分子材料PNIP修饰FeTSPc,由于改变了FeTSPc的微环境,其模拟酶活性明显高于游离FeTSPc[43]。
Li等[44]将Hemin与温度敏感高分子材料共聚,也发现了同样的效果。
4.3胶体金标记物
利用胶体金吸附蛋白质的特性进行标记,结果可通过胶体金本身的颜色进行定性检测,或者通过常规可见吸收光谱仪进行定量检测,与荧光标记、酶标记免疫分析法相比,在快速、简便性上有一定优势。
但由于标记是通过吸附进行,没有共价结合稳定,此外在灵敏度方面与其它标记物相比亦不占优势,因此在相分离免疫分析中只有个别报道[45]。
5相分离免疫分析的应用
5.1病理检验
由于体液组成复杂,样品在测定时背景干扰较大,利用标记免疫分析的高特异性进行选择性地测定已成为生物样品分析的重要手段,相分离免疫分析兼具了均相免疫的快速性和异相免疫的高灵敏性,很适合针对体液样品的病理检验。
乙肝表面抗原(HBsAg)是乙肝病毒的外壳包膜,在乙肝感染者血清中具有很高浓度,是常见的临床检验指标,相分离免疫分析与常用的ELISA法相比,检测速度快,灵敏度相当,目前HbsAg检测在相分离免疫分析中的应用最为广泛[6,12,38,46~48]。
甲胎蛋白(αAFP)是肿瘤相关抗原,血清中其含量测定对癌症诊断有重要意义,相分离免疫用来检测αAFP亦有满意结果[16,40]。
雌酮和雌二醇是体内主要雌激素,很多疾病具有雌激素相关性,应用相分离免疫检测已有报道[28,36]。
5.2药物检测
临床药物检测要求快速简便,相分离免疫分析灵敏度高、特异性强,且快速、灵敏,如对苯妥因的荧光免疫分析[11],灵敏度达到25μg/L,超过了均相免疫法;一次分析最多需要30min,而一般免疫检测需要2h左右。
吗啡的相分离免疫检测也具有简便快速的优点[45]。
紫杉醇对癌症有一定疗效,采用相分离免疫法测定紫杉醇时,方法的检出限可达2.94nmol/L[22]。
此外,氨苯磺胺[49]、磺胺甲噁唑[50]、磺胺地索辛[51]的相分离免疫检测也有报道。
5.3其它分析
农药在农作物生产中的应用日益广泛,过去常采用色谱法分离检测,但操作繁琐,成本较高,相分离免疫检测技术也已开始在农药检测中得到应用,Elena等[21]采用相分离免疫技术检测了除草剂西玛津,与ELISA相比,灵敏度同样为0.5μg/L,但检测时间却从100~120min缩短到45min。
而相分离免疫技术测定除草剂阿特拉津,检出限可达0.01μg/L[23]。
文献[24,39]报道了以温度敏感高分子材料PNIP为载体,检测兴奋剂甲基睾酮。
蓖麻毒素[34]是一种毒物,极少量蓖麻毒素就足以使一个成年人呼吸衰竭导致死亡,但在骨髓移植与癌症治疗方面也有一些潜在的医疗用途,相分离免疫分析检测蓖麻毒素检出限30μg/L。
此外,该法也被用来检测日本血吸虫抗体,检出限为1.3μg/L,相对标准偏差3.6%[52]。
林鹏等[30]将相分离免疫分析技术首次用于水产养殖业,用来检测危害养殖业的重要病原菌——嗜水气单胞菌的外膜蛋白,也取得满意效果。
6结论与展望
相分离免疫作为一种新兴的分析技术,自20世纪80年代末提出以来,应用日益广泛。
可以认为,相分离免疫分析将在以下几方面的研究取得新进展:
(1)相分离免疫分析与自动化技术相结合相分离免疫的最大特点是兼具了均相免疫的快速性和异相免疫的高灵敏性,但目前快速性的特点并没有完全发挥,影响速度的瓶颈是分离步骤需要手工离心清洗,步骤繁琐,消耗时间,免疫反应后分离和清洗一体化的自动化技术,将大大节省时间,提高分析效率。
(2)开发合成新的载体目前的载体仍旧有不尽如人意之处,例如LCSP接近于中性的pH敏感高分子材料均为温度pH同时相关,分离清洗等步骤必须严格控制在37℃进行,生物大分子载体成本过高,不宜商业化等等。
环境敏感物质已经在药物的控制释放[53,54]等领域得到比较广泛的应用,新型载体的开发可以借鉴这些成熟的研究成果。
此外,光敏感高分子材料[55]、电场敏感高分子材料[56]作为潜在的相分离免疫分析载体,也有可能克服上述缺点。
(3)探索Ab或Ag在载体上的新型固定化方式目前的固定方式有其局限性,Ab或Ag在高分子材料上的固定个数和位置不能严格控制,分子生物学的固定化方式并不适用于高分子材料载体,高分子材料载体的固定必须依赖于生物活性物质上的氨基才能与之相连,尚缺少针对小分子的通用型偶联方式。
(4)开拓相分离免疫的标记研究免疫分析的灵敏度与标记物类型有关,将新型标记物研究与相分离免疫技术相结合,可提高相分离免疫分析的灵敏度,而最近龚褔春等[52]直接将荧光单体与高分子材料单体共聚合成了一种pH敏感荧光高分子材料,此高分子材料既起到相分离的作用,又给出了荧光信号,无须另外的标记物,提高了免疫分析的简便性,李楠等[57]曾将模拟酶金属酞菁固定在敏感高分子材料上,也有望将相分离载体功能和信号测量功能集于一体。
(5)开展联用技术的研究充分发挥相分离免疫分析与其它技术的优势互补作用,基于温度敏感高分子材料PNIP的相分离免疫传感器已见报道[58],还有研究者将相分离免疫分析与膜分离技术相结合用来检测样品[59,60]。
(6)拓展相分离免疫的分析目标物质相分离免疫分析的快速性与高灵敏性的优点特别适用于临床检验,此外在食品分析、环境监测、毒品检验方面也有进一步开拓的空间。
(7)进一步降低分析成本开发相分离免疫分析试剂盒,适应市场要求。
【参考文献】
1JonesT,HoughtonRL.Clin.Chem.,1986,32:
1067
2MonjiN,HoffmanAS.Appl.Biochem.Biotechnol.,1987,14:
107~120
3WangYongCheng(王永成),LiYuanZong(李元宗),ChangWenBao(常文保),CiYunXiang(慈云祥).J.Anal.Sci.(分析科学学报),1999,15(6):
510~515
4MaJunTao(马俊涛),ZhaoLin(赵林),HuangRongH
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 分离 免疫 分析 研究进展