胎肝细胞移植加ALR治疗急性肝衰竭Word下载.doc
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65:
32-36
-3-
三、研究方案
1.研究目标、研究内容和拟解决的关键问题
(1)研究目标:
通过本研究探讨胎肝细胞移植与ALR联合运用治疗急性肝功能衰竭的可行性及其相关机制,期望为临床治疗重症肝炎找到确实有效,又经济可行的治疗方法。
同时探索胎肝细胞的最佳冻存、复苏条件,评价冻存细胞作为供者细胞的可行性,为今后临床应用时出现供者细胞短缺提供解决办法。
同时通过观察在急性肝损伤时血和肝组织中ALR和TNF-α、IL-1等炎症因子的变化关系来进一步阐明ALR的作用机理。
(2)研究内容:
a:
D-氨基半乳糖制造大鼠急性肝功能衰竭模型;
b:
Ⅳ型胶原酶灌注消化胎鼠肝脏制备胎肝细胞;
c:
电转化带有HBV-S基因的重组真核表达质粒pCDNA3.1-S入胎肝细胞;
d:
ELISA法或免疫组化法检测含pCDNA3.1-S的胎肝细胞体外培养时表达HBsAg的情况;
e:
比较经不同冻存条件、不同冻存时间处理后,胎肝细胞复苏存活率;
f:
用ELISA法和免疫组化法检测造模组和正常鼠血及肝组织中的ALR,了解ALR的变化情况;
g:
用组氨酸亲和层析柱纯化大肠杆菌BL21(DE3)表达的大鼠ALR;
h:
比较不同治疗组与对照组间、不同治疗组间动物存活率的差别;
i:
比较不同治疗组与对照组间、不同治疗组间肝脏生化指标、常规病理变化;
j:
免疫组化法检测不同治疗组存活动物肝组织内HbsAg的表达及分布,以判断移植细胞的存活情况;
k:
用ELISA法和Northernblot检测不同处理组动物血中和肝组织内TNF-α、IL-1水平及它们的mRNA表达情况,探讨ALR的作用机理;
l:
比较不同治疗组与对照组间、不同治疗组间肾脏生化指标、常规病理变化。
(3)拟解决的关键问题:
重症肝炎的高死亡率一直困扰着临床医生,除肝移植外至今仍无有效治疗方法。
我们拟通过本研究探明胎肝细胞移植加ALR治疗急性肝衰竭的可行性,希望能为重症肝炎的治疗找到突破性方法。
探索胎肝细胞的最佳冻存、复苏条件,评价冻存细胞作为供者细胞的可行性,为今后临床应用时出现供者细胞短缺提供解决办法。
同时可进一步阐明ALR的作用机理、在急性肝损伤时的变化规律以及明确它在肝脏的细胞来源。
-4-
2.拟采取的研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析
(1)研究方法、技术路线、实验方案:
D-氨基半乳糖制备胶原酶消化胎鼠肝冻存、复苏
大鼠急性肝衰竭模型制备胎肝细胞
纯化的大鼠ALR
电转化质粒pCDNA3.1-S
至胎肝细胞
对照组 FLC+CsA FLC+ALR FLC ALR
比较各项检测指标
如果FLC+ALR组有效,
再与冻存细胞进行治疗比较
注:
图中FLC为胎肝细胞;
CsA为环孢霉素A;
ALR为肝再生增强因子。
(2)可行性分析:
本课题的难点是消化分离胎肝细胞、胎肝细胞的冻存复苏、获取大量纯品ALR和鉴定移植的胎肝细胞存活状况。
对于前两项相信通过反复摸索实验条件一定能获得满意结果。
由于本课题是我们前一自然科学基金项目的延续。
我们已构建了人和大鼠ALR的真、原核重组表达质粒,并成功地将其在真核和原核表达系统中进行了表达,获得了高效表达菌株,只要将表达产物用带镍离子的层析柱分离就可得到大量纯品ALR。
我们研究所已构建了一系列含HBV-S基因的重组真核表达质粒,只要将这些表达质粒转入胎肝细胞再用于移植,就能区判定移植细胞的存活情况。
此外我们还完成了人和大鼠ALR的多克隆和单克隆抗体的制备,为检测血和肝组织中的ALR提供了检测手段,要完成本课题研究应不成问题。
3.本项目的创新之处
(1)首次探讨胎肝细胞移植加ALR治疗急性肝功能衰竭的可行性;
(2)首次观察急性肝损伤时血和肝组织内ALR的表达变化情况及它对TNF-α、IL-1等炎症产生的影响;
(3)首次探讨胎肝细胞低温保存和复苏条件,以及作为移植供者细胞的可行性。
-5-
4.年度研究计划及预测进展
2002年1-12月:
完成动物肝损伤模型建立的预实验、ALR表达的肝内定位;
完成胎肝细胞的制备、胎肝细胞的转化、HbsAg表达的鉴定;
完成大鼠ALR的表达及纯化;
完成不同保存条件、不同保存时间胎肝细胞复苏存活率比较;
2003年1-12月:
完成胎肝细胞移植与ALR联合治疗大鼠急性肝衰的疗效评价;
完成新分离与冻存胎肝细胞与ALR联合治疗大鼠急性肝衰的疗效评价;
完成不同处理组动物血及肝组织内TNF-α、IL-1变化的比较;
2004年1-6月:
完成所有的研究工作。
6-12月:
总结资料,发表文章及申报成果。
5.预期研究成果
通过本研究探明胎肝细胞移植加ALR治疗急性肝衰竭的可行性,如能成功将为临床治疗重症肝炎找到了突破性方法,这必将产生巨大的社会效益和经济效益。
同时探索出胎肝细胞的最佳冻存、复苏条件,为今后临床应用时出现供者细胞短缺提供解决办法。
通过本研究还进一步阐明ALR的作用机理、在急性肝损伤时的变化规律,为重组人ALR今后的临床应用前景作出科学评估并提供实验依据。
研究成果将以论文形式发表在中华系列或国际刊物上(预计完成论文4-7篇),并申报相应的科技成果奖。
-6-
四、研究基础
1.与本项目有关的研究工作积累和已取得的研究工作成绩
本课题为我们前一“自然科学基金项目“的延续。
在前一课题中我们已完成人ALR读码框的cDNA克隆及测序,与国外报道的大量鼠ALR读码框的核苷酸及氨基酸序列比较,其同源性分别为86.5%和85.6%,构建了人ALR的真、原核重组表达质粒,并成功地将其在真核和原核表达系统中进行了表达,获得了高效表达菌株和重组的人ALR。
此后又完成了大鼠ALR读码框的cDNA克隆和真、原核表达质粒的构建及表达。
去年我们又进一步完成了由重庆市卫生局资助的针对人和大鼠ALR的多克隆和单克隆抗体的制备。
此外,我们研究所已构建了一系列含HBV-S基因的重组真核表达质粒。
这些成果的取得为本课题的研究提供了可靠的物质保障。
课题申请者长期从事病毒性肝炎的发病机理及治疗的研究。
作为课题的主研人员之一曾参加过研究所承担的国家“六.五”、“七.五”、“八.五”有关病毒性肝炎防治的攻关课题研究,多次荣获国家科委、卫生部、四川省和重庆市的科技进步奖。
90-93年底作为访问学者赴英国伯明翰大学医学院附属医院肝病中心从事免疫抑制药物FK506作用机理的课题研究,回国后又承担了国家教委优秀青年教师基金和国家自然科学基金资助的“肝细胞生长多肽基因克隆及其对免疫系统影响”的课题研究。
申请者具有扎实的分子生物学和免疫学理论知识,极强的科研能力和实验技能,课题组主要成员均有长期从事实验研究的工作经历,这为本课题能顺利进行提供了可行的人员和技术力量的保证。
2.已具备的实验条件,尚缺少的实验条件和拟解决的途径(包括利用国家重点实验室和部门开放实验室的计划与落实情况)
我所为国家教委重点学科,我所为卫生部临床药理实验基地和重庆市分子生物学重点实验室,拥有良好的工作条件和许多精密仪器。
其主要设备有:
超速离心机、液相闪烁计数仪、高速冷冻离心机、台式高速冷冻离心机2台、全波长分光光度仪、γ-射线能谱仪、CO2培养箱3台、PCR仪2台、超净工作台、多功能电泳仪、核酸测序仪、低温冰冻离心机、超低温冰箱、电转化仪、凝胶成像系统、高压和常压层析系统、超声破碎仪、蛋白质电泳装置、荧光显微镜、细胞收集器、倒置显微镜、多功能扫描仪等。
-7-
3.申请者和项目组主要成员的学历和研究工作简历,近期已发表与本项目有关的主要论著目录*和获得学术奖励情况及在本项目中承担的任务;
青年科学基金申请者还应注明学位论文名称及导师姓名与工作单位
8篇
*论文:
作者·
题目·
刊名·
年份·
卷(期)·
页码
专著:
书名·
出版者·
年份
-8-
五、经费预算
支出科目
金额
(万元)
计算根据及理由
1.合计
20.0
(一)科研业务费
2.5
实验动物
0.8
大白鼠、胎鼠各200只(15元/只)及饲料等
文献检索,资料复印
0.3
论文发表,会议,成果鉴定
临工费
0.6
300元/月×
20月
(二)实验材料费
15.8
生化试剂
4.0
D-氨基半乳糖、IV胶原酶、组氨酸亲和柱等
免疫学试剂
IL-1、TNF-α检测Kit,ELISA和免疫组化检测试剂
分子生物学试剂
4.5
DIG-标记、总RNA提取Kit,引物合成,Taq酶,dNTP,
细胞培养
DEME、RPMI-1640培养基、胎牛血清、液氮、CO2等
其他常用试剂
1.5
细菌培养基、Hank氏液、常用试剂等
低值易耗物品
0.8
细胞培养板、酶标检测板、细菌培养瓶、培养皿等
(三)协作费
0.7
病理切片制作、病理诊断等
(四)项目组织实施费
1.0
占总经费的5%
注:
预算支出科目按下列顺序填写:
1.科研业务费2.实验材料费3.仪器设备费4.实验室改装费
5.协作费6.项目组织实施费。
开支范围详见《国家自然科学基金资助项目财务管理办法》第二章。
-9-
六、申请者正在承担的其它研究项目
(攀登计划、863计划、攻关任务和各部委、省市任务等项目的名称及编号、任务来源、起止年月、负责或参加以及与本申请项目的关系等情况)
作为课题负责人正在执行教育部骨干教师基金[教技司(2000)65文]资助的研究。
起止日期:
2000.1—2002.12。
此研究属ALR系列研究之一。
七、申请者承担(负责或参加)国家自然科学基金资助项目的情况
批准号
项目名称
起止年月
负责或参加
进展或完成情况
1996年1月-1998年12月
负责
已完成
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对申请者负责的前一个已结题科学基金资助项目(项目名称及批准号)完成情况,后继研究进展及与本申请项目的关系加以详细说明。
另附该已结题项目《研究工作总结摘要》(300字)及已发表主要相关论文首页复印件(限三篇)。
申请者负责的由自然科学基金资助的已于98年12月结题。
现已构建大鼠ALR的原核表达系统,为进一步研究ALR的生物学功能和作用机理打下基础。
ALR是近年才发现并克隆的一种新的促肝细胞生长因子,人ALR是最近两年由国内学者率先克隆成功的,所以对它的生物学功能才刚刚起步。
从在体内的广泛分布来看,它的生物学功能应远不止限于促肝细胞生长,其作用部位也不应限于肝脏。
目前即使是它在肝脏损伤后再生时的作用机理的研究也少有报道。
我们希望通过本课题研究进一步阐明它的作用机理以及与临床肝损伤后肝再生的关系,为它今后的临床应用提供切实可靠的实验依据。
结题项目≤研究工作总结摘要≥:
以人胎肝总RNA为模板,用RT-PCR和基因重组技术克隆了人ALR阅读框cDNA,它全长378个核苷酸,编码125个氨基酸。
与大鼠ALR和人ALR阅读框的核苷酸序列同源性分别为86.5%和99.2%。
将克隆片段分别装入pET-11a和pcDNA3质粒中,构建了原核表达质粒pET-11a-hALR和真核表达质粒pcDNA3-hALR,并在大肠杆菌BL21(DE3)和COS-7细胞中进行了表达。
在BL21(DE3)中的表达量占菌体蛋白量的20%,分子量约为15KD,用转染的COS-7细胞培养上清和细胞匀浆测活,仅细胞匀浆有刺激活性。
在体外它能刺激HepG2、QGY等肝源性细胞增殖,不能使L929细胞增殖。
首次观察了重组人ALR在体外对人外周血淋巴细胞在PHA刺激下产生IL-2和T13细胞(NK细胞系瘤株)在LPS刺激下产生IL-1、TNF-α的影响,发现它对以上两种细胞产生的细胞因子均无影响。
八、申请者承诺
我保证上述填报内容的真实性。
如果获得资助,我与本项目组成员将严格遵守国家自然科学基金委员会的有关规定,切实保证研究工作时间,按计划认真开展研究工作,按时报送有关材料。
申请者(签章)
年月日
-11-
九、推荐意见
(不具有高级专业技术职务的申请者,须有两名具有高级专业技术职务的同行专家推荐。
推荐时,请认真负责地介绍申请者及其项目组成员的业务基础、研究能力、科研态度及研究条件等。
项目组成员不能做推荐者)
推荐者(签章)专业技术职务专长
所在单位:
- 配套讲稿:
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- 肝细胞 移植 ALR 治疗 急性 衰竭
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