胎盘生长因子定量检测试剂盒说明书Word下载.doc
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PLGFELISA试剂盒是一种固相的酶联免疫试剂盒,采用三明治夹心法的原理。
包被板的微孔中包被了能识别PLGF分子上独特抗原位点的单克隆抗体。
将含有一定量PLGF的病人样品加入到微孔中温育,之后洗板,洗板后加入对PLGF具有特异性的生物素标记多克隆抗体。
温育后洗板除去未结合的酶复合物。
过氧化酶的结合量与样品中PLGF的浓度成正比。
加入底物液后,溶液所显示的颜色与样品中PLGF的浓度成正比。
3、试剂盒成分
1)包被板,12*8(可拆),96孔,包被了抗PLGF抗体(单克隆)
2)零标准品,1支,1ml,即用,0pg/ml,内含<0.35的proclin防腐剂。
3)标准品1-5,5支,1ml,即用,浓度:
25;
50;
125;
500;
1000pg/ml,内含<0.35的proclin防腐剂。
4)质控品,2支,1ml,即用,质控品的浓度值及可允许范围请见试剂瓶标签或质控单。
内含<0.35的proclin防腐剂。
5)检测缓冲液,1支,30ml,即用,内含<0.35的proclin防腐剂。
6)酶联物,1支,14ml,即用,生物素标记的羊抗人PLGF抗体,内含<0.35的proclin防腐剂。
7)酶复合物,1支,14ml,即用,内含链酶素辣根过氧酶复合物,内含0.01%的methylisothiazolone和0.02%bromonitrodioxane防腐剂。
8)底物液,1支,14ml,即用,内含TMB底物液。
9)终止液,1支,14ml,即用,内含0.5M的H2SO4。
避免接触终止液,以免刺激或着烧皮肤。
10)洗涤液,1支,30ml(40倍浓缩),见试剂准备。
注意:
用于样品稀释的零标准品视需要而定。
4、实验所需器材但试剂盒不提供
1)可在450nm处读数的酶标仪
2)可校准的精密移液器
3)吸水纸
4)蒸馏水
5、样品
此实验中要使用到血清,不要使用溶血、黄疸血或脂血样品。
请注意:
含叠氮钠的样品不能用于此实验中。
5.1样品的采集
血清:
静脉穿刺采集全血,待其凝血,在室温下用离心获取血清。
未完全凝血前请勿离心,接受了抗凝剂治疗的病人样品可能需要更长的凝血时间。
5.2样品的储存
实验开始前,应当将样品用盖子盖好,2-8℃环境下可稳定存放48个小时。
如果实验前想要将样品存放更长的时间,则应将样品冻存于-20℃的环境下。
解冻的样品在实验前应反复倒置几次。
5.3样品的稀释
在首次实验时,如果血清样品中PLGF的浓度高于最高标准品中PLGF的浓度,则应将此样品用零标准品稀释10或100倍,并按实验步骤重新检测。
在计算浓度时应当将此稀释因子考虑进去。
例如:
1)1:
10的比例稀释:
10μl的血清+90μl零标准品(充分混合)
2)按1:
100的比例稀释:
10μl已稀释好的a)+90μl零标准品(充分混合)
6、实验步骤
为了保证检测条件的一致性,所有的标准品、样品和质控品都必须做双份检测。
每次实验都含有一条标准曲线。
1)将实验所需数目的板条置于板架上。
2)将标准品、质控品和样品分别25ul加入到相应的微孔中。
3)将250ul检测缓冲液加入到相应的微孔中。
4)室温温育30min(无需盖板)。
5)弃取孔内反应液,用稀释好的洗涤液洗板3次(每孔400ul),最后在吸水纸上拍干。
洗板步骤是否正确明显影响实验的灵敏度和精密度。
6)在每一微孔中加入100ul酶联物。
7)室温温育60min(无需盖板)
8)弃取孔内反应液,用稀释好的洗涤液洗板3次(每孔400ul),最后在吸水纸上拍干。
9)在每一微孔中加入100ul酶复合物。
10)室温温育30min
11)弃取孔内反应液,用稀释好的洗涤液洗板3次(每孔400ul),最后在吸水纸上拍干。
12)在每一微孔中加入100ul底物液。
13)室温温育30min
14)在每一微孔中加入100ul终止液终止酶促反应。
15)加终止液后10min钟内450nm处读取OD值。
7、结果计算
1)计算每个标准品、质控品和病人样本的平均吸光度值。
2)用吸光度值作为纵坐标(y),浓度值作为横坐标(x),以每个标准品的吸光度值对其相应的浓度值进行标绘,作一条标准曲线。
3)用每一样品的平均吸光度值在标准曲线上确定其相应的浓度。
4)自动计算方法:
IFU(说明书)上的结果是用四参数曲线自动计算出来的。
其它的归纳方法
可能会得出稍微不同的结果。
5)样品的浓度可直接从标准曲线上读取。
样品中PLGF浓度高于最高标准品的必须用进行进一步的稀释。
在计算样品浓度时就应当把此稀释因子考虑进去。
8、期望值
强烈建议每个实验室都确立自己的正常值及范围。
用DRGPLGFELISA试剂盒进行的一项研究中,得到如下健康人群的正常值(5%-95%)。
人群
数量
PLGF(pg/ml)
未孕成年妇女
65
20.3-85.9
男性
99
16.7-63.1
正常孕妇体内的PLGF水平比较平稳,在28到32周达到最高水平,之后便逐渐下降(5%-95%)。
妊娠中毒孕妇的中值与正常值相比,其结果明显下降:
PLGF中值(pg/ml)
5%-95%PLGF(pg/ml)
健康孕妇
59
207
33-918
健康孕妇(孕周27-32周)
17
537.95
161-950
妊娠中毒孕妇
34
33.08
12-139
妊娠中毒孕妇(孕周27-32周)
13
77.14
13.97-268
为了确定先兆性子痫妊娠的可能性,建议在20-22孕周检测PLGF水平。
如果血清PLGF浓度在20-22周内低于100pg/ml,则孕期产生先兆性子痫妊娠的可能性越大。
妊娠早期PLGF水平的检测也逐渐作为先兆性子痫妊娠的一个指标(15-16周时,PLGF水平低于50pg/ml),但此项研究还没完全完成。
本译文仅供参考,详情请以原文为准。
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