详谈青蒿素脂质纳米粒的体外释放的摄取特性Word文档下载推荐.docx
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本研究在本实验室先前工作的基础上,构建3种不同聚合度的聚乙二醇硬脂酸酯(PEGn-SA,n=25、40、55)表面修饰的青蒿素脂质纳米粒(PEGn-ART-NLC),探讨PEGn-ART-NLC的体外释放及巨噬细胞(J774)摄取特性,为静脉注射PEG-NLC长循环给药系统提供理论和实验依据。
1材料与方法
药品和试剂
青蒿素原料药(ART,重庆华立武陵山制药有限公司,纯度%~%,批号C00120130510);
青蒿素标准品(中国食品药品检定研究所,批号20100609);
中链甘油酸三酯(MCT,德国萨索尔);
单硬脂酸甘油酯(GMS,天津市光复精细化工研究所,批号20130326);
PEGn-硬脂酸酯(n=25、40、55)(梯希爱化成工业发展有限公司);
聚氧乙烯氢化蓖麻油(RH40,上海运宏化工制剂辅料有限公司);
泊洛沙姆188(F68,德国巴斯夫);
纯化水(HealForce);
巨噬细胞细胞株(J774,中科院上海细胞库);
DMEM培养基(Dulbecco’smodifiedEagle’smedium)、胎牛血清(fetalbovineserum)购自Gibco公司;
乙腈、甲醇(色谱纯,山东禹王试剂有限公司,批号2013061005);
其他试剂均为分析纯。
仪器
高效液相色谱仪(美国Agilent1200);
马尔文粒度仪(Malvern,1079008);
高压乳匀机(APV-2000);
高速分散均质机(上海标本模型厂,FJ-200);
台式离心机(上海安亭科学仪器厂,TDL-5-A);
HY-2调速多用振荡器(江苏中大仪器厂);
FA1104N电子天平(上海民桥精密科学仪器有限公司);
85-2数显恒温磁力搅拌器(荣华仪器制造有限公司)。
方法
的制备PEGn-ART-NLC和ART-NLC的处方见表1,处方筛选及工艺优化工作将另文报道。
制备方法均采用高压乳匀法。
体外含量测定采用本实验室已建立的HPLC-柱后衍生化-UV检测方法测定ART含量。
青蒿素分子结构内无共轭基团,仅在紫外区203nm处有较弱的末端吸收。
与碱反应后,分子内的过氧桥结构被破坏,重排形成共轭结构,产物在289nm处有最大吸收。
由于反应有碱存在,损坏色谱柱,不宜直接进样,因此选用柱后衍生化法进行测定。
色谱条件如下:
色谱柱:
C18液相色谱柱(5μm,150mm×
);
流动相:
乙腈-/L醋酸盐缓冲盐(77∶23);
流速:
流动相/min,柱后衍生试剂(1mol/LKOH90%乙醇溶液)/min;
柱温:
30℃;
柱后反应温度:
70℃;
进样量:
20μL;
检测波长:
289nm。
体外释放实验
释放介质的选择为研究ART-NLCs体外释放规律,经试验选用磷酸盐缓冲液(PBS)作释放介质。
体外释放分别精密量取各ART-NLCs溶液1mL,置于预先处理好的透析袋(截留相对分子质量1~万)中,平行操作3份,扎紧袋口后,完全放入装有溶液的磨口三角锥瓶中,封口,于(37±
)℃,100rpm恒温振荡。
在设定的不同时间点1、2、3、4、6、8、12、24、36、48h分别取样2mL,同时补加(37±
)℃空白释放介质2mL。
48h后,将透析袋取出剪开,转移到10mL容量瓶中,加入5mL乙腈,超声5min使NLC完全破乳,乙腈定容。
以该溶液作为时间无穷大时刻的样品。
μm微孔滤膜过滤样品,取续滤液20μL,按“”项HPLC-柱后衍生化-UV检测方法测定药物浓度。
考察透析袋对释放的影响用乙腈配制/mLART溶液,精密量取该溶液1mL,置于预先处理好的透析袋(截留相对分子质量1~万)中,按“”项下操作进行。
考察血浆对释放的影响另精密量取各ART-NLCs溶液1mL,置于预先处理好的透析袋(截留相对分子质量1~万)中,随即加入人血浆,混合均匀,按“”项下操作进行。
体外释放计算公式按公式F(%)=mi/mo×
100%
(1)计算累计释放量。
其中F为累计释放量,mi为每个时间点的累计药物含量,mo为ART-NLCs中药物的含量。
细胞体外摄取实验
细胞混悬液的制备用含10%胎牛血清(FBS)DMEM吹打混悬细胞,稀释至细胞数1×
105/mL。
聚合度对J774细胞体外摄取的影响于离心管中分别加入J774细胞悬液1mL和样品(PEGn-ART-NLC或ART-NLC)(n=5),以双蒸水作为对照组,于(37±
)℃水浴中50rpm振摇30min,取出后在冰浴中终止吞噬,离心(1000rpm,5min),弃去上清液。
用的PBS分次洗涤,离心,弃去上清后得J774细胞样品。
取离心分离后得到的J774细胞样品,依次加入乙腈400μL,超声粉碎(超声时间1s,间隔1s,超声30次),3500rpm离心15min,μm微孔滤膜过滤样品上清液,取续滤液20μL,按“”项HPLC-柱后衍生化-UV检测方法测定药物浓度。
Uptakepercentage=WU/Wt×
100%
(2)上式中Wt为加入药物的总量,WU为J774细胞摄取的药物量。
蛋白吸附对J774细胞体外摄取的影响另取J774细胞悬液1mL,样品(PEGn-ART-NLC或ART-NLC)及血浆,按“”项下操作进行。
孵育时间对J774细胞体外摄取的影响在(37±
)℃分别孵育、1、2h,按“”项下操作进行。
估算水化层的厚度[7]NLC表面覆有柔顺的PEG长链,亲水性的PEG链上具有很多亲水位点,可吸附大量水分形成一层水分子的空间位阻,称为固定水化层。
利用Gouy-Chapmann扩散双电层模型,估算固定水化层厚度(Fixedaqueouslayerthichness,FALT),公式如下:
lnξ=lnA-KL=×
L(3)其中,ξ为Zeta电位的绝对值,A为常数,K为Debye-Hü
ckel参数,等于槡,C为电解质的浓度,L为FALT/nm。
以0、、、/L的NaCl电解质溶液将ART-NLC、PEG25-ART-NLC、PEG40-ART-NLC和PEG55-ART-NLC稀释,测得Zeta电位,代入公式3求算L。
2结果与讨论
体外含量测定
ART在2~20μg/mL浓度范围内线性关系良好,标准曲线为A=+,r=。
ART高、中、低3个浓度(18、10、5μg/mL)的平均回收率分别为%、%、%(n=3)。
日内精密度(RSD)%、%和%(n=5),日间%、%和%(n=3)。
ART-NLCs的包封率及载药量。
考察透析袋对释放的影响ART溶液在4h内基本完全透过透析袋,并测得药物溶液体外释放透析袋回收率,为(±
)%,结果表明,透析袋对ART脂质纳米粒的释放无限速作用。
聚合度对体外释放的影响按“”项下处方,考察PEGn-SA的加入量不变,PEG聚合度n分别为25、40、55时,PEG25-ART-NLC、PEG40-ART-NLC、PEG55-ART-NLC、ARTNLC及青蒿素溶液的体外释放曲线,结果见图1(A)。
加入血浆后以上各制剂的体外释放曲线。
由图1中A、B可见,随PEGn-SA聚合度增大,PEGn-ART-NLC(n=0、25、40、55)体外释放增加,48h内分别释放了94%、76%、80%、87%。
加入人血浆后,ART-NLC、PEGn-ART-NLC均比在未加入血浆的PBS中释放加快;
但随PEGn-SA聚合度增大,PEGn-ART-NLC(n=0、25、40、55)体外释放减少,48h内分别释放了88%、69%、64%、60%。
采用透析与血浆透析两种方法研究ART-NLCs体外释放,结果表明不加血浆PEGn-ART-NLC(n=25、40、55)三种制剂释放度随PEGn-SA聚合度的增大而增加,其原因可能是NLC表面的PEGn-SA聚合度越大,亲水性越强,使得药物与NLC胶体溶液扩散层的亲和力增大,更易于释放。
血浆的加入使得ART-NLC、PEGn-ART-NLC(n=25、40、55)四种制剂释放速度均明显加快,其主要机理可能是由于血浆中多种蛋白成分迅速吸附于NLC表面,发生相互作用,影响了脂质的膜稳定性,导致药物通透性有所增加;
血浆中其他成分如酶也可能促进药物从NLC中的释放速度。
但PEGn-ART-NLC与血浆混合释放度降低的原因可能是PEGn-SA插嵌到NLC的表面,形成一层厚厚的“云层”,避免了纳米粒之间的聚集,并阻止其他聚合物与之发生相互作用,使PEGn-ART-NLC膜更加稳定,从而使药物不易被释放出来。
细胞体外摄取实验与ART-NLC相比,J774细胞对PEGn-ART-NLC的摄取量明显减小(P<
),并受PEGn-SA聚合度的影响,PEGn-SA含量一定时,PEGn-ART-NLC与J774细胞37℃孵育分别、1、2h后,J774细胞对PEGn-ART-NLC的摄取量均随PEGn-SA聚合度增大而降低。
其中J774细胞对PEG55-ART-NLC的摄取量明显小于PEG40-ART-NLC和PEG25-ART-NLC(P<
)。
J774细胞对PEGn-ART-NLC和ART-NLC的体外摄取作用受孵育时间的影响,摄取量随孵育时间的延长而增大。
分别在1h和2h后出现显著性差异(P<
J774细胞对ART-NLCs体外细胞摄取作用受蛋白吸附的影响,与不加血浆相比,加入血浆后各试管中J774细胞对ART-NLCs的摄取量均明显增大(P<
),其中J774细胞对PEG25-ART-NLC的摄取量要明显大于PEG40-ART-NLC和PEG55-ART-NLC(P<
J774细胞与ART-NLCs孵育不同时间后,各时间点可见,与不加血浆相比,加入血浆后各试管中J774细胞对PEGn-ART-NLC和ART-NLC的摄取量均明显增大(P<
J774细胞对PEGn-ART-NLC和ART-NLC的摄取结果体外巨噬细胞摄取实验是体外评价PEG-NLC长循环能力的常用方法。
机体MPS系统识别异物的机制为:
当异物进入体内后多种蛋白成分迅速吸附于纳米粒表面。
若增加纳米粒的表面亲水性,就可减少调理素(蛋白质)的吸附,因此PEG的亲水性柔韧长链及其高密度覆盖层是减小蛋白吸附的必要条件。
J774细胞对PEGn-ART-NLC与ART-NLC的摄取量相比,PEGn-SA表面修饰的NLC表现出显著的抗吞噬性,可能是用PEGn-SA对ART-NLC进行表面修饰后,PEG长链的柔韧性使PEGn-ART-NLC的空间结构时刻发生变化而使J774细胞难以对其产生有效的识别,从而使J774细胞对PEGn-ART-NLC的摄取减少。
一般而言,PEG长链的长度越长,其柔韧性越好,其抵抗细胞摄取的作用越强,本实验可见随PEGn-SA(n=25、40、55)聚合度增大,J774细胞对PEGn-ART-NLC的摄取量增加。
高哲等的研究获得了同样的结果,可能与PEGn-ART-NLC具有较厚的表面固定水化层和较高的PEG链密度和较强的干扰蛋白吸附到脂质纳米粒表面的能力有关。
固定水化层厚度的估算
以0、、、/L的NaCl电解质溶液稀释PEG25-ART-NLC、PEG40-ART-NLC和PEG55-ART-NLC,测得Zeta电位结果见表4。
根据公式3将lnξ对进行线性回归,其斜率即为L。
ART-NLC、PEG25-ART-NLC、PEG40-ART-NLC和PEG55-ART-NLC的固定水化层厚度L分别为、、和。
L是影响PEG表面修饰长循环给药系统的重要表面性质,增加L可显著延长粒子的体内循环时间。
PEGn-SA含量相同时,随着PEGn-SA聚合度的增加,PEGn-ART-NLCZeta电位(绝对值)减小,L增大,体外J774细胞摄取减少。
可见PEGn-SA对ART-NLC的修饰作用,与PEGn-SA在ART-NLC表面的空间结构密切相关。
根据Needham的模型,L可体现PEG链在纳米粒表面的长度;
Needham认为,PEG可在纳米粒表面形成“线型”或“蘑菇”样的构型,在线性构型中,PEG链是舒展的,理论上聚合度为40的PEG线型构型的链长为,而实际上,PEG链在纳米粒表面往往以弯曲、折叠、压缩的形式存在,即“蘑菇”样构型,PEG25-ART-NLC、PEG40-ART-NLC和PEG55-ART-NLC形成的固定水化层分别仅有、和;
“蘑菇”样构型对PEGn-ART-NLC有两方面的影响:
其一,PEG链减少了其摆动的可能性,也就是说PEG链的柔韧性下降;
其二,表观上增加了单位PEG链对纳米粒表面的覆盖面积,从而一定程度上增加了保护作用。
本研究为构建PEGn-SA表面修饰的NLC长循环给药系统提供了理论和实验依据,下一步本文拟进行不同PEGn-ART-NLC体内动力学的比较性研究,证明PEG表面修饰青蒿素脂质纳米粒具有长循环作用,将另文报道。
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