Western操作步骤Word格式.docx
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Western操作步骤Word格式.docx
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按前面方法配10%分离胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
灌胶时,可用10ml枪吸取5ml胶沿玻璃放出,待胶面升到绿带中间线高度时即可。
然后胶上加一层水,液封后的胶凝的更快。
(灌胶时开始可快一些,胶面快到所需高度时要放慢速度。
操作时胶一定要沿玻璃板流下,这样胶中才不会有气泡。
加水液封时要慢,否则胶会被冲变型。
)
3.当水和胶之间有一条折射线时,说明胶已凝了。
再等3min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。
4.按前面方法配4%的浓缩胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。
灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。
插梳子时要使梳子保持水平。
由于胶凝固时体积会收缩减小,从而使加样孔的上样体积减小,所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶(其实说经常有点过了,补1~2次就行了,不补胶问题也不大)。
待到浓缩胶凝固后,两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。
5.用水冲洗一下浓缩胶,将其放入电泳槽中。
(冲洗的话个人感觉可以使用5ml的针筒,当然操作不能太粗暴了)
6.测完蛋白含量后,计算含20-50μg蛋白(根据自己的实验需要进行选择,没有固定的量)的溶液体积即为上样量。
取出上样样品至200μl的EP管中,加入5×
SDS上样缓冲液至终浓度为1×
。
(上样总体积一般不超过15μl,加样孔的最大限度可加20μl样品)(其实大一点的垂直电泳槽每孔最大上样量可以达到40μl,胶做得很好的话50μl也是问题不大的)上样前要将样品于沸水中煮5~10min使蛋白变性。
(本人心得:
可以使用PCR仪进行变性,加快速度,这样就不用将水煮沸了,同时在水中煮蛋白样品有下面弊端:
1.EP管容易炸开,样品丢失;
2.容易进水,使样品体积增加,超过电泳最大上样量)
7.加足够的电泳液后开始准备上样。
(电泳液至少要漫过内测的小玻璃板)用微量进样器贴壁吸取样品,将样品吸出不要吸进气泡。
将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。
(加样太快可使样品冲出加样孔,若有气泡也可能使样品溢出。
加入下一个样品时,进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤数次,以免交叉污染)
(3)电泳:
电泳时间一般4~5h,电压为40V较好,也可用60V。
(本人为了加快速度,浓缩胶时用80-100V跑,到分离胶以后用150-200跑,结果也不错,总时间2h左右)电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳,进行转膜(如果目的条带比较大的话,最好使用可视的蛋白marker,Fermentas的0441和0671比较好,就是有点贵。
一般要让目的条带跑过分离胶的1/3比较好,不要局限于此说明)。
(四)转膜
(1)转一张膜需准备6张7.0~8.3cm的滤纸和1张7.3~8.6cm的PVDF膜。
切滤纸和膜时一定要戴手套,因为手上的蛋白会污染膜。
将切好的PVDF膜置于水上浸2h才可使用。
(用镊子捏住膜的一边轻轻置于有超纯水的平皿里,要使膜浮于水上,只有下层才与水接触。
这样由于毛细管作用可使整个膜浸湿。
若膜沉入水里,膜与水之间形成一层空气膜,这样会阻止膜吸水)(个人感觉其实转膜之前浸湿一下就ok了,没有多大问题,可能按照上述操作结果会更好)
(2)在加有转移液的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、一支玻棒、滤纸和浸过的膜。
(3)将夹子打开使黑的一面保持水平。
在上面垫一张海绵垫,用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。
(一手擀另一手要压住垫子使其不能随便移动)在垫子上垫三层滤纸(可三张纸先叠在一起再垫于垫子上,注:
个人感觉就垫1张滤纸也没问题呀),一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。
(4)要先将玻璃板撬掉才可剥胶,撬的时候动作要轻,要在两个边上轻轻的反复撬(应该边撬边用流水缓缓冲洗)。
撬一会儿玻璃板便开始松动,直到撬去玻板。
(撬时一定要小心,胶很易裂,要用巧劲)除去小玻璃板后,将浓缩胶轻轻刮去(浓缩胶影响操作),要避免把分离胶刮破。
小心剥下分离胶盖于滤纸上,用手调整使其与滤纸对齐,轻轻用玻棒擀去气泡。
将膜盖于胶上,要盖满整个胶(膜盖下后不可再移动)并除气泡。
在膜上盖3张滤纸并除去气泡。
最后盖上另一个海绵垫,擀几下就可合起夹子。
整个操作在转移液中进行,要不断的擀去气泡。
膜两边的滤纸不能相互接触,接触后会发生短路。
(转移液含甲醇,操作时要戴手套,实验室要开门以使空气流通)(最后做成的“三明治”千万不能形成短路,不然有可能会短路烧坏转膜装置(价格不菲,尤其是进口的),第一次做的应请老手指教)
(5)将夹子放入转移槽槽中,要使夹的黑面对槽的黑面,夹的白面对槽的红面。
电转移时会产热,在槽的一边放一块冰来降温。
一般用60V转移2h或40V转移3h。
(1.实际上应该根据蛋白分子量的大小确定转膜时间,对于小分子量的蛋白,转膜时最好垫两块PVDF膜,以免转膜过头,因为如果第一张膜上蛋白质已经转过了,第二张膜上还有蛋白质可以进行检测;
对于大分子量的蛋白,转膜时电压要高一点,一般80-100V,时间也要延长一点,开始最好也用两块膜,特别是务必注意加强降温措施。
当然转膜是要摸条件的,最好刚开始做的时候摸个转膜的时间梯度。
如果由于时间原因来不及做下面实验,可以在4度下12V转膜过夜)(2.PVDF膜建议使用0.22μm的小孔径膜,不容易转膜过头)(3.不同的转膜装置,转移效率是不一样的,所以换用转膜装置,最好再摸个条件)(4.
转膜时电极方向注意是膜正胶负)
(6)转完后将膜用1×
丽春红染液染5min(于脱色摇床上摇)。
然后用水冲洗掉没染上的染液就可看到膜上的蛋白。
将膜晾干备用。
(一般不需要做这步)
(五)免疫反应(个人建议:
还是使用杂交袋进行一抗和二抗的孵育,节约抗体)
(1)将膜用TBS从下向上浸湿后,移至含有封闭液的平皿中,室温下脱色摇床上摇动封闭1h。
(2)将一抗用TBST稀释至适当浓度(在1.5ml离心管中);
撕下适当大小的一块儿保鲜膜铺于实验台面上,四角用水浸湿以使保鲜膜保持平整;
将抗体溶液加到保鲜膜上;
从封闭液中取出膜,用滤纸吸去残留液后,将膜蛋白面朝下放于抗体液面上,掀动膜四角以赶出残留气泡;
室温下孵育1~2h后,用TBST在室温下脱色摇床上洗两次,每次10min;
再用TBS洗一次,10min。
(3)同上方法准备二抗稀释液并与膜接触,室温下孵育1~2h后,用TBST在室温下脱色摇床上洗两次,每次10min;
再用TBS洗一次,10min,进行化学发光反应。
(六)化学发光,显影,定影
(1)将A和B两种试剂在保鲜膜上等体积混合;
1min后,将膜蛋白面朝下与此混合液充分接触;
1min后,将膜移至另一保鲜膜上,去尽残液,包好,放入X-光片夹中。
(2)在暗室中,将1×
显影液和定影液分别到入塑料盘中;
在红灯下取出X-片,用切纸刀剪裁适当大小(比膜的长和宽均需大1cm);
打开X-光片夹,把X-光片放在膜上,一旦放上,便不能移动,关上X-光片夹,开始计时;
根据信号的强弱适当调整曝光时间,一般为1min或5min,也可选择不同时间多次压片,以达最佳效果;
曝光完成后,打开X-光片夹,取出X-光片,迅速浸入显影液中显影,待出现明显条带后,即刻终止显影。
显影时间一般为1~2min(20~25℃),温度过低时(低于16℃)需适当延长显影时间;
显影结束后,马上把X-光片浸入定影液中,定影时间一般为5~10min,以胶片透明为止;
用自来水冲去残留的定影液后,室温下晾干。
(如果使用柯达的显影定影液,时间很快的,显影结束后最好先用事先准备好的自来水洗一下片子,然后再放到定影液中进行定影,这样可以延长定影液使用时间,从而节约定影液)应注意的是:
显影和定影需移动胶片时,尽量拿胶片一角,手指甲不要划伤胶片,否则会对结果产生影响。
(七)凝胶图象分析
将胶片进行扫描或拍照,用凝胶图象处理系统分析目标带的分子量和净光密度值。
WesternBlot原理
WesternBlot是把电泳分离的组分从凝胶转移到一种固相支持体,并以针对特定氨基酸序列的特异性试剂作为探针检测之。
使用的探针是抗体,它与附着于固相支持体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应。
Western的作用是对非放射性标记蛋白组成的复杂混合物中的某些特异蛋白进行鉴别和鉴定。
仪器
高压锅、玻璃匀浆器、低温高速离心机、ASP-3700紫外光/可见光微量分光光度计、-20℃低温冰箱、稳压稳流电流仪、垂直式电泳槽、JY-系列半干式转移电泳槽、电热恒温培养箱、多用脱色摇床、杂交袋封口机、分析天平、pH值调节器、暗室红灯、压片暗盒、0.1~2.5µ
l/100µ
l/200µ
l/1000µ
l移液器
杂品与耗材
10µ
l吸头;
200µ
l离心管;
各种规格的烧杯、量筒和平皿等玻璃器材;
0.22umPVDF膜;
3mm滤纸;
吸水纸;
乳胶手套;
杂交袋;
保鲜膜;
搪瓷盘(>
20×
20cm);
柯达X-OMATBT胶片;
玻璃棒;
计时器;
ddH2O
试剂
单去污剂裂解液、0.01mol/LPBS(pH7.3)、10%分离胶、4%浓缩胶、G250考马斯亮蓝溶液、0.15mol/LNaCl溶液、2×
(5×
)SDS上样缓冲液、电泳缓冲液、转移缓冲液、10×
丽春红染液、封闭液、TBST、TBS、洗脱抗体缓冲液、显影液、定影液、抗体、化学发光试剂。
试剂配制
(一)母液
1.0mol/LTris•HCl
Tris(MW121.14)
30.29g
蒸馏水
200ml
溶解后,用浓盐酸调pH至所需点(见下所示),最后用蒸馏水定容至250ml,高温灭菌后室温下保存。
pH
HCl
7.4
约17ml
7.5
约16ml
7.6
约15ml
8.0
约10ml
1.74mg/ml(10mmol/L)PMSF
PMSF
0.174g
异丙醇
100ml
溶解后,分装于1.5ml离心管中,-20℃保存。
0.2mol/LNaH2PO4
NaH2PO4
(MW119.98)
12g
至500ml
溶解后,高压灭菌,室温保存。
0.2mol/LNa2HPO4
Na2HPO4
•12H2O(MW
358.14)
71.6g
至1000ml
10%SDS
SDS
10g
至
50℃水浴下溶解,室温保存。
如在长期保存中出现沉淀,水浴溶化后,仍可使用。
10%过硫酸胺(AP)
过硫酸胺
0.1g
超纯水
1.0ml
溶解后,4℃保存,保存时间为1周。
(可先将过硫酸胺干粉称好分量后放在EP管中,一次性多装几管,使用时加入超纯水即可)
1.5mol/LTris•HCl(pH8.8)
45.43g
溶解后,用浓盐酸调pH至8.8,最后用超纯水定容至250ml,室温下保存。
0.5mol/LTris•HCl(pH6.8)
Tris(MW121.14)
15.14g
溶解后,用浓盐酸调pH至6.8,最后用超纯水定容至250ml,室温下保存。
40%Acr/Bic(37.5:
1)
丙稀酰胺(Acr)
37.5g
甲叉双丙稀酰胺(Bic)
1g
至100ml
溶解后4℃保存。
使用时恢复至室温且无沉淀。
20%Tween20
Tween20
20ml
混匀后4℃保存。
(二)使用液
单去污剂裂解液(50mMTris-HClpH8.0、150mMNaCl、1%TritonX-100、100ug/mlPMSF)
1mol/LTris•HCl(pH8.0)
2.5ml
NaCl
0.438
TritonX-100
0.5ml
至50ml
混匀后4℃保存。
使用时,加入PMSF至终浓度为100μg/ml(0.87ml裂解液加入1.74mg/mlPMSF50μl)。
(一般实际用的比较多的其实是RIPA裂解配方:
50mMTris-HClpH7.4、150mMNaCl、1mMPMSF、1mMEDTA、1%Tritonx-100、1%脱氧胆酸钠、0.1%SDS)
1mol/LTris•HCl(pH7.4)
0.87g
100mMEDTA
10%Na-deoxycholate(10%脱氧胆酸钠)
5ml
10%SDS
使用时,加入PMSF至终浓度为1mMPMSF(1ml裂解液加入1.74mg/mlPMSF100μl)。
0.01mol/LPBS(pH7.2-7.4)
0.2mol/L
19ml
81ml
17g
2000ml
(如果用TBST进行洗膜的话,其实PBS用得很少,大可不必自己配制,向试剂公司购买20×
的PBS浓缩液即可,500ml的浓缩液不到50元,很方便)
G250考马斯亮蓝溶液(蛋白定量专用)
考马斯亮蓝G250
100mg
95%乙醇
50ml
磷酸
配制时,先用乙醇溶解考马斯亮蓝染料,再加入磷酸和水,混匀后,用滤纸过滤,4℃保存。
0.15mol/LNaCl
NaCl(MW58.44)
0.877g
至100ml
高温灭菌后,室温保存。
100mg/ml牛血清白蛋白(BSA)
BSA
1ml
溶解后-20℃保存。
制作蛋白标准曲线时,用0.15mol/LNaCl进行100倍稀释成1mg/ml,-20℃保存。
10%分离胶和4%浓缩胶
10%分离胶(两块胶,10ml)
4%浓缩胶(两块胶,5ml)
4.85ml
3.16ml
40%Acr/Bic(37.5:
2.5ml
1.5mol/LTris•HCl(pH8.8)
-
0.5mol/LTris•HCl(pH6.8)
-
1.26ml
10%SDS
100μl
50μl
10%AP(过硫酸胺)
50μl
25μl
TEMED
5μl
5μl
加TEMED后,立即混匀即可灌胶。
(为了加快凝胶,可以将过硫酸胺和TEMED量加大,一般加至原来的2-3倍,根据实验当时的温度适当调整)
还原型5×
SDS上样缓冲液(0.25mol/LTris•HCl(pH6.8),0.5mol/L二硫叔糖醇,10%SDS,0.5%
溴酚蓝,50%甘油)
0.5mol/LTris•HCl(pH6.8)
二硫叔糖醇(DTT,MW154.5)
0.39g
SDS
0.5g
溴酚蓝
0.025
甘油
混匀后,分装于1.5ml离心管中,4℃保存。
电泳液缓冲液
Tris(MW121.14)
3.03g
甘氨酸(MW75.07)
18.77g
蒸馏水至
1000ml
溶解后室温保存,此溶液可重复使用3~5次。
(电泳液可以回收重复利用,一般将回收的电泳液加入垂直电泳槽的下半部分,上半部分最好使用新鲜的电泳缓冲液)
(可以配制成10×
电泳液缓冲液进行保存,稀释10倍使用)
转移缓冲液
甘氨酸(MW75.07)
2.9g
5.8g
0.37g
甲醇
溶解后室温保存,次溶液可重复使用3~5次(此溶液最好保存在4度冰箱,最多使用5次左右,不然影响转移效率)。
(先用蒸馏水溶解甘氨酸、Tris和SDS,然后再加入甲醇,最后补足液体。
如果先加入甲醇,溶解甘氨酸、Tris和SDS等比较困难)
(可以配制成2×
转移缓冲液进行保存,稀释后使用)
10×
丽春红染液
丽春红S
2g
三氯乙酸
30g
磺基水杨酸
使用时将其稀释10倍。
TBS缓冲液
1mol/LTris•HCl(pH7.5)
10ml
NaCl
8.8g
TBS缓冲液进行保存,稀释10倍使用)
TBST缓冲液
1.65ml
TBS
700ml
混匀后即可使用,最好现用现配。
封闭液
脱脂奶粉(国产,光明牌)
5g
TBST
最好现用现配。
洗脱抗体缓冲液(100mmol/L2-Mercaptoethanol,2%SDS,62.5mmol/LTris•HClpH6.8)
14.4mol/L2-Mercaptoethanol(β-巯基乙醇)
700μl(通风厨里加)
12.5ml
配制时,在通风厨内进行。
4℃保存。
可重复使用1次。
显影液(5×
)
自来水(加热至50℃)
375ml
(以下药品加到温水中)
米吐尔
1.55g
亚硫酸钠(无水)
22.5g
碳酸钠(无水)
33.75g
溴化钾
20.95g
水
配制时,上述药品应逐一加入,待一种试剂溶解后,再加入后一种试剂。
使用时用自来水稀释至1倍。
(不需要自己配制,有钱的直接买柯达的显影液,上千;
没钱的到专业的照相器材市场购买即可,很便宜,一包5毛钱左右)
定影液
自来水(50~60℃)
700ml(以下药品按顺序加入前者溶解后再加后者)
硫代硫酸钠
240g
15g
冰乙酸
12.6ml
硼酸
7.5g
钾明矾
15g(水温冷至30℃以下时再加入)
室温保存
(不需要自己配制,有钱的直接买柯达的定影液,上千;
没钱的到专业的照相器材市场购买即可,很便宜,一包5毛钱左右)
抗体
用TBST稀释至一定浓度使用,建议使用杂交袋(小商品市场购买,很便宜,可以多买一点,但是务必注意质量,千万不能漏,不然抗体就浪费了,在使用之前先检查一下杂交袋的完整性)。
化学发光试剂
分A和B两种试剂,有钱可以购买Amersham、Pierce或者SantaCruz的,没钱的话碧云天的ECL也能凑合
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