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不适用于有机溶剂,特别适用于水基溶液,推荐用于蛋白质和其相关样品。
尼龙66滤膜:
适用于绝大多数有机溶剂和水溶液,可用于强酸,70%乙醇、二氯甲烷、不适用于二甲基甲酰胺。
再生纤维素滤膜:
具有蛋白吸收低,同样适用水溶性样品和有机溶剂。
流动相:
1、流动相应选用色谱纯试剂、高纯水或双蒸水,酸碱液及缓冲液需经过滤后使用,过滤时注意区分水系膜和油系膜的使用范围;
2、水相流动相需经常更换(一般不超过2天),防止长菌变质;
3、使用双泵时,最好不要有机相与水相直接调用,这样可能造成管路气泡,最好我们根据自己的需要配制一定浓度的有机相与水相的混合溶液,再与水相混合调用
4、换流动相后,要purge
样品:
1、采用过滤或离心方法处理样品,确保样品中不含固体颗粒;
2、用流动相或比流动相弱的溶剂制备样品溶液,若为反相柱,则极性比流动相大;
若为正相柱,则极性比流动相小,尽量用流动相制备样品液;
手动进样时,进样量尽量小,使用定量管定量时,进样体积应为定量管的3~5倍;
1、使用前仔细阅读色谱柱附带的说明书,注意适用范围,如pH值范围、流动相类型等;
2、使用符合要求的流动相;
3、使用保护柱;
4、如所用流动相为含盐流动相,反相色谱柱使用后,先用水或低浓度甲醇水(如5%甲醇水溶液),再用甲醇冲洗。
5、色谱柱在不使用时,应用甲醇或乙氰冲洗,取下后紧密封闭两端保存;
6、不要高压冲洗柱子;
7、不要在高温下长时间使用硅胶键合相色谱柱,使用硅胶柱时还要特别小心流动相的PH范围在2~8之间;
使用过程中注意轻拿轻放。
8、上柱时我们要注意柱子的方向,千万不要装反了
高效液相色谱法的分类及其分离原理
高效液相色谱法分为:
液-固色谱法、液-液色谱法、离子交换色谱法、凝胶色谱法。
1.液-固色谱法(液-固吸附色谱法)
固定相是固体吸附剂,它是根据物质在固定相上的吸附作用不同来进行分配的。
①液-固色谱法的作用机制
吸附剂:
一些多孔的固体颗粒物质,其表面常存在分散的吸附中心点。
流动相中的溶质分子X(液相)被流动相S带入色谱柱后,在随载液流动的过程中,发生如下交换反应:
X(液相)+nS(吸附)<
==>
X(吸附)+nS(液相)
其作用机制是溶质分子X(液相)和溶剂分子S(液相)对吸附剂活性表面的竞争吸附。
吸附反应的平衡常数K为:
K值较小:
溶剂分子吸附力很强,被吸附的溶质分子很少,先流出色谱柱。
K值较大:
表示该组分分子的吸附能力较强,后流出色谱柱。
发生在吸附剂表面上的吸附-解吸平衡,就是液-固色谱分离的基础。
②液-固色谱法的吸附剂和流动相
常用的液-固色谱吸附剂:
薄膜型硅胶、全多孔型硅胶、薄膜型氧化铝、全多孔型氧化铝、分子筛、聚酰胺等。
一般规律:
对于固定相而言,非极性分子与极性吸附剂(如硅胶、氧化铜)之间的作用力很弱,分配比k较小,保留时间较短;
但极性分子与极性吸附剂之间的作用力很强,分配比k大,保留时间长。
对流动相的基本要求:
试样要能够溶于流动相中
流动相粘度较小
流动相不能影响试样的检测
常用的流动相:
甲醇、乙醚、苯、乙腈、乙酸乙酯、吡啶等。
③液-固色谱法的应用
常用于分离极性不同的化合物、含有不同类型或不;
数量官能团的有机化合物,以及有机化合物的不同的异构体;
但液-固色谱法不宜用于分离同系物,因为液-固色谱对不同相对分子质量的同系物选择性不高。
2.液-液色谱法(液-液分配色谱法)
将液体固定液涂渍在担体上作为固定相。
①液-液色谱法的作用机制
溶质在两相间进行分配时,在固定液中溶解度较小的组分较难进入固定液,在色谱柱中向前迁移速度较快;
在固定液中溶解度较大的组分容易进入固定液,在色谱柱中向前迁移速度较慢,从而达到分离的目的。
液-液色谱法与液-液萃取法的基本原理相同,均服从分配定律:
K=C固/C液
K值大的组分,保留时间长,后流出色谱柱。
②正相色谱和反相色谱
正相分配色谱用极性物质作固定相,非极性溶剂(如苯、正己烷等)作流动相。
反相分配色谱用非极性物质作固定相,极性溶剂(如水、甲醇、己腈等)作流动相。
一般地,正相色谱是固定液的极性大于流动相的极性,而反相色谱是固定相的极性小于流动相的极性。
正相色谱适宜于分离极性化合物,反相色谱则适宜于分离非极性或弱极性化合物。
③液-液色谱法的固定相
常用的固定液为有机液体,如极性的β,β′氧二丙腈(ODPN),非极性的十八烷(ODS)和异二十烷(SQ)等。
缺点:
涂渍固定液容易被流动相冲掉。
采用化学键合固定相则可以避免上述缺点。
使固定浓与担体之间形成化学键,例如在硅胶表面利用硅烷化反应:
形成Si-O-Si-C型键,把固定液的分子结合到担体表面上。
优点:
化学键合固定相无液坑,液层薄,传质速度快,无固定液的流失。
固定液上可以结合不同的官能团,改善分离效能。
固定液不会溶于流动相,有利于进行梯度洗提。
④液-液色谱法的应用
液-液色谱法既能分离极性化合物,又能分离非极性化合物,如烷烃、烯烃、芳烃、稠环、染料、留族等化合物。
化合物中取代基的数目或性质不同,或化合物的相对分子质量不同,均可以用液-液色谱进行分离。
3.离子交换色谱法
原理:
离子交换色谱法是基于离子交换树脂上可电离的离子与流动相中具有相同电荷的被测离子进行可逆交换,由于被测离子在交换剂上具有不同的亲和力(作用力)而被分离。
①离子交换色谱法的作用机制
聚合物的分子骨架上连接着活性基团,如:
-SO3-,-N(CH3)3+等。
为了保持离子交换树脂的电中性,活性基团上带有电荷数相同但正、负号相反的离子X,称为反离子。
活性基团上的反离子可以与流动相中具有相同电荷的被测离子发生交换:
离子交换色谱的分配过程是交换与洗脱过程。
交换达到平衡时:
K值越大,保留时间越长。
②溶剂和固定相
两种类型:
多孔性树脂与薄壳型树脂。
多孔性树脂:
极小的球型离子交换树脂,能分离复杂样品,进样量较大;
缺点是机械强度不高,不能耐受压力。
薄壳型离子交换树脂:
在玻璃微球上涂以薄层的离子交换树脂,这种树脂柱效高,当流动相成分发生变化时,不会膨胀或压缩;
缺点是但柱子容量小,进样量不宜太多。
③离子交换色谱法的应用
主要用来分离离子或可离解的化合物,凡是在流动相中能够电离的物质都可以用离子交换色谱法进行分离。
广泛地应用于:
无机离子、有机化合物和生物物质(如氨基酸、核酸、蛋白质等)的分离。
4.凝肤色谱法(空间排阻色谱法)
凝胶是一种多孔性的高分子聚合体,表面布满孔隙,能被流动相浸润,吸附性很小。
凝胶色谱法的分离机制是根据分子的体积大小和形状不同而达到分离目的。
①凝胶色谱法的作用机制
体积大于凝胶孔隙的分子,由于不能进入孔隙而被排阻,直接从表面流过,先流出色谱柱;
小分子可以渗入大大小小的凝胶孔隙中而完全不受排阻,然后又从孔隙中出来随载液流动,后流出色谱柱;
中等体积的分子可以渗入较大的孔隙中,但受到较小孔隙的排阻,介乎上述两种情况之间。
凝胶色谱法是一种按分子尺寸大小的顺序进行分离的一种色谱分析方法。
②凝胶色谱法的固定相
软质凝胶、半硬质凝胶和硬质凝胶三种。
③凝胶色谱法的应用特点
保留时间是分子尺寸的函数,适宜于分离相对分子质量大的化合物,相对分子质量在400~8×
105的任何类型的化合物。
保留时间短,色谱峰窄,容易检测。
固定相与溶质分子间的作用力极弱,趁于零,柱的寿命长。
不能分辨分子大小相近的化合物,分子量相差需在10%以上时才能得到分离
高效液相色谱的类型
(一)吸附色谱
在吸附色谱中,样品的极性官能团牢固地保留在填料的吸附活性中心上,非极性烃基几乎不予保留。
所以,要清楚地辨别极性功能团的种类、数量和位置。
通常,样品能用吸附色谱分离的应是能溶解于有机溶剂并是非离子型的,强离子样品是不适宜的。
吸附色谱所使用的流动相以正己烷、三氯甲烷、二氯甲烷作为基础,按照样品的极性加上乙醇,然而,最好是使所加入醇的浓度为10%或更少一些。
如有可能,可进一步减小百分数。
因为高浓度的醇会减少填料的吸附活性,减弱吸附能力,并使重现困难。
(二)分配色谱
1.正相分配色谱
正相分配色谱适用于不溶于水而溶于有机溶剂且带有极性基团的样品,但正相分配色谱不适合于离子型物质。
2.反相分配色谱
这种方法目前应用非常广泛,应用的范围也很广,在反相分配色谱中,样品的非极性部分起保留作用。
通过使用的流动相是水—甲醇和水—乙腈,通过加入甲醇或乙腈的量的不同来调节分离,但如果样品带有离子型基团,需要在流动相中加入盐或调节流动相的PH值,例如,如果样品有一个—COOH基团,使流动相的PH值是偏向酸性的,由于抑制了—COOH基团的电离而加强了保留。
这个方法叫离子抑止法,如果样品有强离子基,有时候采用在流动相中加入适当抗衡离子以形成离子对的离子对法。
在调节PH值中,保持PH值在填料说明书手册中所规定的范围内,大多数化学键式的二氧化硅使用在PH=2-9,然而,当加入盐以后,最好使其PH=7.5-8或更小的,多孔聚合物填料能应用非常广泛的PH值。
(三)离子交换色谱
这个方法是用填料的固定相的离子交换基团和样品的离子基团之间的离子交换来分离样品组分的,按照所交换的离子分成阳离子交换和阴离子交换。
离子交换色谱使用于能溶于水的离子型物质。
在离子交换色谱中,流动相的盐的浓度、PH及盐的种类等都对保留值有很大的影响。
在高效液相色谱的离子交换中所用的盐有磷酸盐、醋酸盐和硼酸盐。
因为氯化物会腐蚀不锈钢仪器,在高效液相色谱中不能使用NaCI或其他的氯化物盐类。
根据测量波长有些盐也不能使用,例如,醋酸吸收大约在210nm,当检测处在短波端的时候,用醋酸作流动相是不合适的。
(四)凝胶色谱
凝胶色谱不同于以上三种分离方法。
凝胶色谱是根据分子大小用分子筛效应来分离样品组分的。
这个方法也叫排阻色谱或粒度排阻色谱。
具有一定孔径的多孔性合成聚合物经常用作填料。
因为在样品中,小尺寸的分子深深地渗透到微孔中,所以迟流出,而大尺寸的分子没有渗透到微孔中,就很快流出。
通常合成树脂的分离使用有机溶剂作流动相,叫做凝胶渗透色谱。
凝胶色谱依样品的性质又可分为凝胶渗透和凝胶过滤。
1.凝胶渗透色谱
凝胶渗透色谱简称GPC。
此一类的色谱,使用于有机性溶媒的样品中,如PVC,PS,ABS等等,而所用的洗脱液有THF等等。
2.凝胶过滤色谱
凝胶过滤色谱GFC。
此一种类的层析法,使用于水溶媒的试剂中,如蛋白质、淀粉及水性合成高分子等等,而所用的溶液有水、缓冲液等等。
凝胶的种类很多,按其原料来源可分为有机胶和无机胶。
按其制备的方法又可分为均匀、半均匀和非均匀三种凝胶。
而根据凝胶的强度又可分为软胶、半硬胶和硬胶三大类。
根据它对溶剂的适用范围又可分为亲水性、亲油性和两性凝胶等等。
高压液相色谱HPLC培训教程
(二)基本概念和理论
一、基本概念和术语
1.色谱图和峰参数
色谱图(chromatogram)--样品流经色谱柱和检测器,所得到的信号-时间曲线,又称色谱流出曲线(elutionprofile)。
基线(baseline)--经流动相冲洗,柱与流动相达到平衡后,检测器测出一段时间的流出曲线。
一般应平行于时间轴。
噪音(noise)--基线信号的波动。
通常因电源接触不良或瞬时过载、检测器不稳定、流动相含有气泡或色谱柱被污染所致。
漂移(drift)--基线随时间的缓缓变化。
主要由于操作条件如电压、温度、流动相及流量的不稳定所引起,柱内的污染物或固定相不断被洗脱下来也会产生漂移。
色谱峰(peak)--组分流经检测器时响应的连续信号产生的曲线。
流出曲线上的突起部分。
正常色谱峰近似于对称形正态分布曲线(高斯Gauss曲线)。
不对称色谱峰有两种:
前延峰(leadingpeak)和拖尾峰(tailingpeak)。
前者少见。
拖尾因子(tailingfactor,T),用以衡量色谱峰的对称性。
也称为对称因子(symmetryfactor)或不对称因子(asymmetryfactor)。
《中国药典》规定T应为0.95~1.05。
T<0.95为前延峰,T>1.05为拖尾峰。
峰底-基线上峰的起点至终点的距离。
峰高(peakheight,h)-峰的最高点至峰底的距离。
峰宽(peakwidth,W)-峰两侧拐点处所作两条切线与基线的两个交点间的距离。
W=4σ
半峰宽(peakwidthathalf-height,Wh/2)-峰高一半处的峰宽。
Wh/2=2.355σ
标准偏差(standarddeviation,σ)-正态分布曲线x=±
1时(拐点)的峰宽之半。
正常峰的拐点在峰高的0.607倍处。
标准偏差的大小说明组分在流出色谱柱过程中的分散程度。
σ小,分散程度小、极点浓度高、峰形瘦、柱效高;
反之,σ大,峰形胖、柱效低。
峰面积(peakarea,A)-峰与峰底所包围的面积。
2.定性参数(保留值)
死时间(deadtime,t0)--不保留组分的保留时间。
即流动相(溶剂)通过色谱柱的时间。
在反相HPLC中可用苯磺酸钠来测定死时间。
死体积(deadvolume,V0)--由进样器进样口到检测器流动池未被固定相所占据的空间。
它包括4部分:
进样器至色谱柱管路体积、柱内固定相颗粒间隙(被流动相占据,Vm)、柱出口管路体积、检测器流动池体积。
其中只有Vm参与色谱平衡过程,其它3部分只起峰扩展作用。
为防止峰扩展,这3部分体积应尽量减小。
V0=F×
t0(F为流速)
保留时间(retentiontime,tR)--从进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大值的时间。
保留体积(retentionvolume,VR)--从进样开始到某组分在柱后出现浓度极大值时流出溶剂的体积。
又称洗脱体积。
VR=F×
tR
调整保留时间(adjustedretentiontime,t'
R)--扣除死时间后的保留时间。
也称折合保留时间(reducedretentiontime)。
在实验条件(温度、固定相等)一定时,t'
R只决定于组分的性质,因此,t'
R(或tR)可用于定性。
t'
R=tR-t0
调整保留体积(adjustedretentionvolume,V'
R)--扣除死体积后的保留体积。
3.柱效参数
理论塔板数(theoreticalplatenumber,N)--用于定量表示色谱柱的分离效率(简称柱效)。
N取决于固定相的种类、性质(粒度、粒径分布等)、填充状况、柱长、流动相的种类和流速及测定柱效所用物质的性质。
在一张多组分色谱图上,如果各组分含量相当,则后洗脱的峰比前面的峰要逐渐加宽,峰高则逐渐降低。
用半峰宽计算理论塔数比用峰宽计算更为方便和常用,因为半峰宽更易准确测定,尤其是对稍有拖尾的峰。
N与柱长成正比,柱越长,N越大。
用N表示柱效时应注明柱长,如果未注明,则表示柱长为1米时的理论塔板数。
(一般HPLC柱的N在1000以上。
)
若用调整保留时间(t'
R)计算理论塔板数,所得值称为有效理论塔板数(N有效或Neff)。
理论塔板高度(theoreticalplateheight,H)--每单位柱长的方差。
实际应用时往往用柱长L和理论塔板数计算。
4.相平衡参数
分配系数(distributioncoefficient,K)--在一定温度下,化合物在两相间达到分配平衡时,在固定相与流动相中的浓度之比。
分配系数与组分、流动相和固定相的热力学性质有关,也与温度、压力有关。
在不同的色谱分离机制中,K有不同的概念:
吸附色谱法为吸附系数,离子交换色谱法为选择性系数(或称交换系数),凝胶色谱法为渗透参数。
但一般情况可用分配系数来表示。
在条件(流动相、固定相、温度和压力等)一定,样品浓度很低时(Cs、Cm很小)时,K只取决于组分的性质,而与浓度无关。
这只是理想状态下的色谱条件,在这种条件下,得到的色谱峰为正常峰;
在许多情况下,随着浓度的增大,K减小,这时色谱峰为拖尾峰;
而有时随着溶质浓度增大,K也增大,这时色谱峰为前延峰。
因此,只有尽可能减少进样量,使组分在柱内浓度降低,K恒定时,才能获得正常峰。
在同一色谱条件下,样品中K值大的组分在固定相中滞留时间长,后流出色谱柱;
K值小的组分则滞留时间短,先流出色谱柱。
混合物中各组分的分配系数相差越大,越容易分离,因此混合物中各组分的分配系数不同是色谱分离的前提。
在HPLC中,固定相确定后,K主要受流动相的性质影响。
实践中主要靠调整流动相的组成配比及pH值,以获得组分间的分配系数差异及适宜的保留时间,达到分离的目的。
容量因子(capacityfactor,k)--化合物在两相间达到分配平衡时,在固定相与流动相中的量之比。
因此容量因子也称质量分配系数。
容量因子的物理意义:
表示一个组分在固定相中停留的时间(t'
R)是不保留组分保留时间(t0)的几倍。
k=0时,化合物全部存在于流动相中,在固定相中不保留,t'
R=0;
k越大,说明固定相对此组分的容量越大,出柱慢,保留时间越长。
容量因子与分配系数的不同点是:
K取决于组分、流动相、固定相的性质及温度,而与体积Vs、Vm无关;
k除了与性质及温度有关外,还与Vs、Vm有关。
由于t'
R、t0较Vs、Vm易于测定,所以容量因子比分配系数应用更广泛。
选择性因子(selectivityfactor,α)--相邻两组分的分配系数或容量因子之比。
α又称为相对保留时间(《美国药典》)。
要使两组分得到分离,必须使α≠1。
α与化合物在固定相和流动相中的分配性质、柱温有关,与柱尺寸、流速、填充情况无关。
从本质上来说,α的大小表示两组分在两相间的平衡分配热力学性质的差异,即分子间相互作用力的差异。
5.分离参数
分离度(resolution,R)--相邻两峰的保留时间之差与平均峰宽的比值。
也叫分辨率,表示相邻两峰的分离程度。
R=。
当W1=W2时,R=。
当R=1时,称为4σ分离,两峰基本分离,裸露峰面积为95.4%,内侧峰基重叠约2%。
R=1.5时,称为6σ分离,裸露峰面积为99.7%。
R≥1.5称为完全分离。
中国药典规定R应大于1.5。
提高分离度有三种途径:
①增加塔板数。
方法之一是增加柱长,但这样会延长保留时间、增加柱压。
更好的方法是降低塔板高度,提高柱效。
②增加选择性。
当α=1时,R=0,无论柱效有多高,组分也不可能分离。
一般可以采取以下措施来改变选择性:
a.改变流动相的组成及pH值;
b.改变柱温;
c.改变固定相。
③改变容量因子。
这常常是提高分离度的最容易方法,可以通过调节流动相的组成来实现。
k2趋于0时,R也趋于0;
k2增大,R也增大。
但k2不能太大,否则不但分离时间延长,而且峰形变宽,会影响分离度和检测灵敏度。
一般k2在1~10范围内,最好为2~5,窄径柱可更小些。
高效液相色谱实验技术
一、色谱柱
1.液相色谱柱的安装
液相色谱仪由高压液体泵、检测器及液相色谱柱等三部分组成,其中液相色谱柱的正确安装和使用,是液相色谱工作的关键;
也是液相色谱工作者获得正确可靠的实验数据的关键所在。
(1)、液相色谱柱的结构:
a、空柱由柱接头、柱管及滤片组装而成。
柱接头采用低死体积结构,柱接头是两端螺纹组件,一端是为7/16英寸外螺纹,另一端是3/16英寸的内螺纹(国内外已规范化)。
7/16英寸外螺纹与1/4英寸柱管(Φ6.35mm)连接,中间放置压坏用于密封。
3/16英寸的内螺纹与1/16英寸(Φ1.57mm)的连接管连接,中间也放置压环用于柱接头的密封。
为了尽量减少柱外死体积,在安装色谱柱时,用Φ1.57mm连接管通过空心螺钉压环后要尽量插到底,然后再拧紧空心螺钉。
压环被空心螺钉挤压变形后紧箍在连接管上(连接管通过压环后露出的管长度应严格控制在2.5mm长或其他固定尺寸)。
在两端柱接头内,柱管两端各放置一片不锈钢滤片(或滤网),用于封堵柱填料不被流动相冲出柱外而流失。
空柱各组件均为316#不锈钢材质,能耐受一般的溶剂作用。
但由于含氯化物的溶剂对其有一定的腐蚀性,故使用时要注意,柱及连接管内不能长时间存留此类溶剂,以避免腐蚀。
b、柱填料:
液相色谱柱的分离作用是在填料与流动相之间进行的,柱子的分类是依据填料类型而定。
正相柱:
多以硅胶为柱填料。
根据外型可分为无定型和球型两种,其颗粒直径在3—10μm的范围内。
另一类正相填料是硅胶表面键合—CN,-NH2等官能团即所谓的键合相硅胶。
反相柱:
主要是以硅胶为基质,在其表面键合十八烷基官能团(ODS)的非极性填料。
也有无定型和球型之分。
常用的其他的反相填料还有键合C8、C4、C2、苯基等,其颗粒粒径在3—10μm之间。
(2),色谱柱的安装:
a、拆开柱包装盒,确认色谱柱的类型、尺寸、出厂日期以及柱内贮存的溶剂。
b、拧下柱两端接头的密封堵头放回包装盒供备用。
c、按柱管上标示的流动相流向,将色谱柱的入口端通过连接管与进样阀出口相连接(如条件允许,建议在柱前使用保护柱);
柱的出口与检测器连接。
连接管是外径为1.57mm、内径为0.1-0.3mm的不锈钢管。
连接管的两端均有空心螺钉及密封用压环。
在接管时一定要设法降低柱外死体积。
连接管通过空心螺钉、压环后尽量用力插到底,然后顺时针拧紧空心螺钉,直到拧不动为止,再用扳手继续顺时针拧1/4-1/2圈,切记不要用力过大。
如色谱柱通过流动相加压后有漏液现象,请用扳手继续顺时针拧1/4圈,直至不漏液为止。
2、液相色谱柱的使用:
色谱柱在使用前,最好进行柱的性能测试,并将结果保存起来,作为今后评价柱性能变化的参考。
但要注意:
柱性能可能由于所使用的样品、流动相、柱温等条件的差异而有所不同;
另外,在做柱性能测试时是按照色谱柱出厂报告中的条件进行(出厂测试所使用的条件是最佳条件),只有这样,测
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