切片的制作PPT文档格式.ppt
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灌注法固定可使固定液迅速达到全身各组织。
达到充分固定之目的。
3、固定液,醛类固定剂非醛类固定剂丙酮及醇类固定剂,醛类固定剂,双功能交联剂,其作用是使组织之间相互交联。
包括:
甲醛、多聚甲醛、戊二醛通常与其他的试剂联合使用优点是对组织穿透性强,收缩性小。
可以保存蛋白质、脂肪、黏液物质以及一定量的糖原。
缺点:
长期固定使组织过度硬化及细胞核不着色,并且产生“福尔马林色素”,它是由于血红蛋白与甲醛转化的酸形成正铁血红素。
非醛类固定剂,氯化汞(HgCI2):
蛋白的强固定剂重铬酸钾:
保存类脂、高尔基复合体、及染色体等结构。
苦味酸:
三硝基苯酚,蛋白、糖原固定剂,醋酸:
固定染色体。
软化组织,缓解收缩。
蔗糖:
防止某些细胞成分扩散,保持酶活性,良好形态。
四氧化锇:
保存细胞蛋白质细微结构有良好效应,应用与电镜观察切片的固定与染色。
丙酮及醇类固定剂,丙酮:
沉淀蛋白质和糖,对组织穿透性很强。
可以单独使用,低温下保持酶活性效果好。
乙醇:
固定糖原和核酸的作用。
低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质保存效果较差。
必须与其他试剂混合使用,单独使用使组织收缩严重,对细胞形态保存不良。
混合固定剂,固定组织时,单独使用一种固定剂很难对组织成分有理想的固定效果。
通常几种固定剂混用,制成混合固定剂。
以求得补偿某试剂对组织所致的缺陷。
4%多聚甲醛磷酸缓冲液pH7.4成分:
4%多聚甲醛溶于1倍的磷酸缓冲液中,1倍的磷酸缓冲液:
PBSMVNaCl140mM58.44KCl2.7mM74.55NaH2PO412H2O,10mM358.14KH2PO41.8mM136.09调pH至7.4。
Bouins液,苦味酸饱和水溶液75ml15固定糖原37%-40%福尔马林液25ml5固定蛋白和脂肪冰醋酸5ml1凝固核染色质,固定组织时应注意:
应力求保持组织新鲜,勿使其干燥,尽快固定处理。
组织块不易过大过厚,必须小于2cm1.5cm0.3cm,尤其是组织块厚度必须控制在0.3cm以内。
固定液必须有足够的量,在体积上一般大于组织20倍以上,否则组织中心固定不良影响效果。
固定时间的选择,不同的研究目的所需使用的固定液。
材料的大小,组织的特性与致密度。
温度的不同有所差别。
组织固定后的处理,冲洗或漂洗:
组织固定后应充分水洗,去除固定液造成的人为假象。
修块:
大小合适、去除形态不好的部分,,四、脱水,脱水目的:
运用某种溶剂置换组织内的水分。
脱水剂:
乙醇、丙酮、正丁醇等,乙醇:
最常用的脱水剂一般组织:
70%-80%-90%-100%-100%特殊组织:
30%-40-%-50%-60%-70%-80%-90%-100%-100%每步30分钟左右。
要求:
完全脱净,保证脱水梯度和每一步脱水时间不能过度脱水(使组织变脆)不同组织脱水时间不同:
大的致密的组织需要延长脱水时间为加速各级酒精的穿透力,脱水可在37温箱中进行。
五、透明或媒浸,目的与作用对组织的最后脱水处理与包埋剂置换透明剂:
苯、甲苯、二甲苯、氯仿等有机溶剂100%乙醇脱水后进入二甲苯两次,保证透明完全。
六、包埋,包埋剂的特点:
具有一定的强度和韧度,满足切片的要求。
能完全进入组织。
对组织内部成分损伤小。
石蜡包埋,石蜡特点:
熔点:
45-50软蜡55-60硬蜡常用石蜡的处理:
新蜡应溶一次,增加密度。
并用滤纸过滤去处杂质。
加5%10%的蜂蜡,增加石蜡的韧性。
反复溶的旧蜡包埋效果更好。
程序:
在溶蜡箱中进行55-60,恒温。
浸蜡:
二甲苯透明后的组织块在二甲苯:
石蜡(1:
1)中两次,在石蜡中两次,每次一个小时左右。
包块:
在室温进行,七石蜡切片,载玻片处理:
切片:
展片:
背面与玻片。
烘片:
37的温箱内烤干(约需12小时)。
优点:
操作比较简便、容易,可以切出较薄的切片,并且易于制成连续切片,也容易附着于载玻片上。
是不适于较大的标本,材料在经过脱水、浸蜡的过程中容易收缩。
火棉胶切片法,透明剂:
乙醚与乙醇等量混合包埋剂:
火棉胶溶于透明剂包埋:
常温进行凝固:
在乙醚中过夜,在氯仿中过夜。
在70%乙醇中保存。
可切大的组织可切较硬的组织如硬骨缺点:
操作所用时间长一般切片厚度为20-30m。
不能连续切片全部试剂为易燃物质,注意防火,冰冻切片法,取材:
液氮保存载玻片处理切片保存:
-70或-20,
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