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SOD的初步论文
专业基础综合实验
题目:
胡萝卜中SOD的提取及活力测定
学院:
化学化工学院
专业:
生物工程班级:
1101学号:
201106030132
学生姓名:
程晶晶
指导教师:
张何
完成日期:
2014年1月2日
专业基础综合实验任务书
院部:
化学化工专业:
生物工程班级:
1101
姓名:
程晶晶
1.专业基础综合实验题目:
胡萝卜中SOD的提取及活力测定
2.专业基础综合实验内容及实验要求:
本实验建立了邻苯三酚自氧化对胡萝卜中SOD测活方法的改进条件,并对不同方法提取的胡萝卜SOD样液进行测活。
结果表明:
胡萝卜中含有丰富的SOD,但是加工过程中温度对SOD活力影响很大。
为胡萝卜的加工方法的选择提供参考。
对于果蔬中的超氧化物歧化酶有数种的提纯技术和活力测定方法,在工艺研究或实际生产中,需要结合实际需求,制定合理的提纯方案,选择合适的测活方法。
3.实验时间安排:
2013年 12月 16 日至 1014年1月 2日
第16周根据实验要求设计实验,并准备相应的实验预备工作;根据方案进行实验。
第17、18周根据方案进一步完善实验内容,并根据实验结果进行分析,书写实验报告。
四.主要参考文献
[1]陶静,赵华,于会永.玉米超氧化物歧化酶的研究进展[J].粮食与饲料工业,
2005(4):
26-27.
[2]孙永君.大蒜中SOD的提取研究[J]化学与生物工程,2005(10):
23-25.
[3]邹国林.一种SOD测定方法——邻苯三酚自氧化法的改进[J].生物化学与生物物理进展1986(4):
71
指导教师:
张何
教研室主任:
谢涛
教学院长:
陈建芳
2014 年 1 月 2 日
目录
1前言1
1.1SOD的发现…………………………………………………………………1
1.2SOD的产业联盟…………………………………………………………...1
1.3SOD的研究现状…………………………………………………………...2
1.4果蔬中的SOD2
1.5邻苯三酚自氧化法3
1.6课题概述4
2试验部分4
2.1试验药品4
2.2试验仪器5
2.3试验原理与方法5
2.3.1SOD的检测方法5
2.3.2邻苯三酚自氧法测定SOD的活力6
2.4试验步骤6
2.4.1胡萝卜中SOD的提取6
2.4.2胡萝卜中SOD的活力测定7
3实验结果与分析讨论7
3.1SOD的提取分析7
3.2SOD活力测定的分析8
3.2.1不同的提取方案对SOD提取的影响8
3.2.2胡萝卜中SOD测定结果8
4结论9
参考文献10
1前言
1.1SOD的发现
神秘的生命原动力——SOD
1938年,英国Mann等人首次从小牛血液中分离出一种含铜的蓝绿色蛋白质。
1953年又有科学家从马胆中分离出相似的蛋白质,但当时他们并没有发现这种蛋白质的生理活性。
直到1968年,美国人Mccord在Fridovich指导下,从牛的红细胞中提取出一种定名为超氧化物歧化酶的活性物质——SOD。
SOD是生物体内最重要的抗氧化酶,它具有特殊的生理活性,能够分出一个电子给自由基,使自由基变成无害物质。
所以它是生物体内最重要的自由基清除剂,是人类对抗自由基的第一道防线。
事实证明,SOD的缺少和活性降低是人类生老病死的根本原因,补充SOD可以达到预防和治疗各种疾病,延缓衰老,防癌的目的。
1.2SOD产业联盟
全国SOD产业联盟(原名全国SOD应用开发产业化联盟,后曾一度更名为中国SOD生产应用联盟)始创于2009年10月,是由部分有志于发展壮大我国SOD应用开发产业化事业的单位发起,自愿结合组成的民间社团。
经有关部门批准,目前正式挂靠中国药学会生化与生物技术药物专业委员会、中国保健协会保健食品工作委员会和中国食品工业协会营养指导工作委员会。
长期以来,由于SOD研究还不够深入,各生产单位生产规模偏小,彼此互不沟通,各自为政,没有统一的质量标准和检测方法,限于分散微薄的实力,既影响了SOD生产技术、产品质量的提高,也阻碍了SOD产品宣传力度和销售市场的开拓。
为了彻底改变我国SOD应用开发产业化事业停滞不前的现状,谋求各自企业的生存发展,联合起来日益成为许多SOD及其相关产品生产企业的共同愿望。
2009年9月,由中国药学会生化与生物技术药物专业委员会主办的第六届全国SOD学术研讨会在江苏省苏州市召开。
许多SOD及其相关产品生产企业应邀出席会议。
在会上不少企业表达了联合起来共谋发展的热切期盼。
仅仅时隔一月,2009年10月,由中国药学会生化与生物技术专业委员会主办的SOD开发战略研讨会紧接着在首都北京市举行。
全国SOD应用开发产业化联盟应运而生,正式创建。
联盟的宗旨是:
组织集中各方力量,充分发挥各自优势,环绕SOD及其相关产品的研究开发、生产制造、市场营销等方面,为成员单位服务,在自愿的基础上,为它们牵线搭桥,采取灵活多样的方式,发展双边、多边互利共赢的协作,达到共同发展的目的,从而推动我国SOD及其相关产品、产业做大做强,产品走遍全国,迈向世界,为促进科学发展,构建和谐社会,保障人类健康作出应有的贡献。
1.3SOD的研究现状
目前国内外已对SOD的机理、纯化、应用作了大量的研究。
但注意力大都集中在以动物血液为来源制取SOD方面上。
对植物SOD的提取虽也有不少研究,但仅停留在初步验证阶段。
国外SOD主要应用于医疗、保健方面,有以动物血液及内脏为原料制取SOD的报导,但存在着成本高、含有致热因子等缺陷,因此,适用范围极为有限。
尤其是近年来受“疯牛病”的影响,许多国家和地区抵制以动物血液及内脏为原料制取的超氧化物歧化酶,使得超氧化物歧化酶在国际市场上极为紧缺。
因此开发植物资源提取SOD,以安全性极高且来源丰富、价格低廉的植物原料制取超氧化物歧化酶,创意新颖,其产品必将以其安全性、优异的品质及低成本等特点在国内、国际市场上成为走俏商品,因此可以预测市场应用前景广阔。
1.4果蔬中的SOD
超氧化物歧化酶Orgotein(SuperoxideDismutase,SOD),别名肝蛋白、奥谷蛋白,简称:
SOD。
SOD是一种源于生命体的活性物质,能消除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质。
对人体不断地补充SOD具有抗衰老的特殊效果。
超氧化物歧化酶(SuperoxideDismutase,EC1.15.1.1,SOD)是1938年Marn等人首次从牛红血球中分离得到超氧化物歧化酶开始算起,人们对SOD的研究己有七十多年的历史。
1969年McCord等重新发现这种蛋白,并且发现了它们的生物活性,弄清了它催化过氧阴离子发生歧化反应的性质,所以正式将其命名为超氧化物歧化酶。
超氧物歧化酶(SuperoxideDismutase简称SOD)是一种新型酶制剂。
它在生物界的分布极广,几乎从动物到植物,甚至从人到单细胞生物,都有它的存在。
SOD被视为生命科技中最具神奇魔力的酶、人体内的垃圾清道夫。
超氧化物歧化酶(SOD)为自由基清除剂,它广泛存在于生物体的各种组织中,能清除自由基O2(超氧阴离子自由基),而O2具有细胞毒性,可使脂质过氧化,损伤细胞膜,引起炎症,肿瘤和自身免疫性疾病,并可能促使机体衰老。
超氧化物歧化酶(SOD)正常值⑴酶速率法(37℃):
血清:
242~620U/L;红细胞:
5375~7975μg/g·Hb⑵邻苯三酚法健康搜索:
心肌:
300.3~406.3U/g;红细胞健康搜索:
1567~2241U/g。
⑶联大茴香胺法:
心肌:
1745~2231U/g;红细胞:
2906~4654U/g超氧化物歧化酶(SOD)临床意义超氧化物歧化酶(SOD)为自由基清除剂,它广泛存在于生物体的各种组织中,能清除自由基O2(超氧阴离子自由基),而O2具有细胞毒性,可使脂质过氧化,损伤细胞膜,引起炎症,肿瘤和自身免疫性疾病,并可能促使机体衰老。
SOD类型:
超氧化物歧化酶按其所含金属辅基不同可分为三种,第一种是含铜(Cu)锌(Zn)金属辅基的称(Cu.Zn—SOD),最为常见的一种酶,呈绿色,主要存在于机体细胞浆中;第二种是是含锰(Mn)金属辅基的称(Mn—SOD),呈紫色,存在于真核细胞的线粒体和原核细胞内;第三种是含铁(Fe)金属辅基的称(Fe—SOD),呈黄褐色,存在于原核细胞中。
超氧物歧化酶(SuperoxideDismutase简称SOD)是一种新型酶制剂,它在生物界的分布极广,几乎从人到细胞,从动物到植物,都有它的存在。
原多从牛血中
提取,1997年欧盟禁止使用动物中提取的SOD。
SOD是超氧化物歧化酶(superoxidedismutase)的英文缩写,是一种含有金属元素的活性蛋白酶,是目前生物学、医学和生命科学领域中世界级的高、尖、精课题。
超氧化物歧化酶(SOD)目前世界范围内的开发,大都从动物血里提取,不但代价昂贵,而且动物性SOD的排他性、不易常温保存、艾滋病等血液病毒的交叉感染及其它潜在危险,所以国际卫生组织呼吁:
立刻停止动物性SOD的使用。
我国传统工业多从动物的血液和内脏器官中提取SOD,但这类原料来源有限,成分复杂,在储存、运输方面存在诸多不便,因此导致生产工艺复杂化,使生产成本大幅度上升。
相比而言,人们日常食用的蔬果中含有丰富的SOD,资源丰富、易于处理,生产工艺得到简化,故成本低廉,且使用安全性高。
所以,寻找富含高活力SOD的果蔬并从中提纯SOD,开发抗癌产品具有深远意义。
1.5邻苯三酚自氧化法
SOD的活力测定方法很多,常见的有化学法、免疫法和等电点聚焦法。
其中化学法应用最普遍,化学法的原理主要是利用有些化合物在自氧化过程中会产生有色中间物和O2-,利用SOD分解而间接推算酶活力。
在化学方法中,最常用的有黄嘌呤氧化酶法,邻苯三酚法,化学发光法,肾上腺素法,NBT-还原法,光化学扩增法,Cyte还原法等。
其中改良的邻苯三酚自氧化法简单易行较为实用。
化学发光法和光化学扩增法不适用于测定Mn-SOD,但对于Cu/Zn-SOD反应极灵敏。
Cyte还原法用于Mn-SOD活力测定结果稳定,重复性好。
但专一性和灵敏度不够理想,而且需要特殊仪器,实际应用受到限制。
在一般情况下,SOD酶活性测定只能应用间接活性测定法。
本实验采用邻苯三酚自氧化方法。
邻苯三酚在碱性条件下,能迅速自氧化,释放出O2-,生成带色的中间产物,反应开始后反应液先变成黄棕色,几分钟后转绿,几小时后又转变成黄色,这是因为生成的中间物不断氧化的结果。
这里测定的是邻苯三酚自氧化过程中的初始阶段,中间物的积累在滞留30~45s后,与时间成线性关系,一般线性时间维持在4min的范围内,中间物在420nm波长出有强烈光吸收。
当有SOD存在时,由于它能催化O2-与H+结合生成O2和H2O2,从而阻止了中间产物的积累,因此,通过计算即可求出SOD的酶活性。
酶活力单位定义:
在25℃恒温条件下,每毫升反应液中,每分钟抑制邻苯酚自氧化率达50%的酶量定义为1个酶活力单位。
1.6课题概述
SOD被视为生命科技中最具神奇魔力的酶、人体内的垃圾清道夫。
SOD是氧自由基的自然天敌,是机体内氧自由基的头号杀手,是生命健康之本。
超氧化物歧化酶(SOD)目前世界范围内的开发,大都从动物血里提取,不但代价昂贵,而且动物性SOD的排他性、不易常温保存、艾滋病等血液病毒的交叉感染及其它潜在危险,所以国际卫生组织呼吁:
立刻停止动物性SOD的使用。
通过查阅资料了解到SOD属于金属蛋白酶,按照结合金属离子种类不同,该酶有以下三种:
含铜与锌超氧化物歧化酶(Cu-ZnSOD)、含锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD)和含铁超氧化物歧化酶(Fe-SOD)。
三种SOD都催化超氧化物阴离子自由基,将之歧化为过氧化氢与氧气。
它广泛存在于自然界的动物、植物以及一些微生物中。
许多资料表明,SOD对人体有着广泛的保护作用。
本实验建立了邻苯三酚自氧化对胡萝卜中SOD测活方法的改进条件,并对不同方法提取的胡萝卜SOD样液进行测活。
为工艺研究或实际生产中,在结合实际需求前提条件下,为制定合理的提纯方案,提供了合适的测定方法。
2试验部分
2.1试验药品
药品名称
纯度
生产厂家
Hcl
分析纯
广东汕头市光华化学厂
Tris
分析纯
广东汕头市光华化学厂
EDTA-2Na
分析纯
广东汕头市光华化学厂
邻苯三酚
分析纯
广东汕头市光华化学厂
磷酸氢二钠
分析纯
广东汕头市光华化学厂
磷酸二氢钠
分析纯
天津市光复科技发展有限公司
胡萝卜
市场购买
2.2试验仪器
名称
厂商
高速离心机
赛特湘仪
高速组织捣碎机
新加坡AppliedBiosystems公司
紫外—可见分光光度计
天能科技(上海)有限公司
DK-8D型电热恒温水槽
巩义市予华仪器有限责任公司
FA1104A电子天平
上海精天电子仪器有限公司
SL磁力辅助加样枪
美国RAININ
2.3试验原理与方法
2.3.1SOD的检测方法
常用的几种SOD检测方法:
1.分光光度法分光光度法是最为典型的检测SOD的方法,这种方法使用了细胞色素C(cytochromeC)或者氮蓝四唑(NBT)(图1)。
用cytochromeC的还原法来检测O2-是因为还原后的cytochromeC会生成紫色的染料(图解2)。
这是自SOD被发现以来最常用的方法。
Cyt(FeⅢ)+O2-—>Cyt(FeⅡ)+O2因为cytochromeC很容易被NADPH还原酶或者其他的还原剂所还原,因此必须要考虑样品的污染因素。
而且,这种方法需要每隔1.5分钟就要察看一下,因此不适合做大批量的实验。
NBT法的原理是生成不溶于水的蓝色甲臢染料(lmax:
560nm)去和O2-反应。
这种染料不溶于水,在做长时程分析时会生成不均一的沉淀物,从而影响实验数据的重现性。
为了得到水溶性的甲臢染料,许多改良后的方法如添加BSA被人们所采用。
但是,添加了不必要的蛋白质会使数据分析变得十分复杂,而且NBT会被多种还原剂所还原。
NBT的这种特性被用于酮胺的检测,酮胺可以作为糖尿病的标记物并且是Maillard反应的中间体。
NBT法的最大缺点是即使加入过量的SOD也不能获得100%的抑制率,原因是NBT会与黄嘌呤氧化酶直接反应。
2.化学发光法用于O2-检测的化学发光探针同样也能用于SOD的检测,这种探针分为2种,一种是光泽精,另一种是荧光素衍生物(MCLA)。
这种化学发光反应对pH有高度的依赖性。
例如,光泽精只有在pH9.0或者更高处会发出强烈的化学光。
因此,在生理的pH条件下用这种方法检测SOD是不可行的。
另一方面,MCLA在生理条件下能够发出较强的化学荧光,因此可以用于人脑的Cu,Zn-SOD活性的检测。
但是,MCLA不适合用作SOD检测的探针,因为它不单单和O2-反应,还会和单质氧反应。
而且MCLA与溶解氧反应后会发出化学光,转移的金属离子还会加速氧化反应。
3.电子自旋共振(ESR)光谱法在室温下,溶液中O2-的ESR信号不能直接被检测出,但能够通过自旋捕捉法间接获得。
最常见的诱捕剂是5,5-dimethyl-1-pyrrolineN-oxide(DMPO)。
由于O2-诱捕DMPO会产生一个特
殊的光谱图,因此ESR法是O2-检测的方法中特异性最好的一种。
然而,DMPO与O2-间的二阶速度常数比O2-自发反应常数相对要低,因此需要向溶液中加入大量的DMPO(如:
终浓度为0.45M)。
这样,每次试验所要用的DMPO将花去大笔的经费。
这种方法的另一个问题是在实验中需要一套较为昂贵的ESR设备。
4.利用水溶性四唑盐检测SOD的新方法为了克服上述的诸多问题,我们在做SOD检测时需要考虑如下几个方面:
实验设备要简单、经济,pH灵敏度要低,对O2-有高度的特异性。
如果用分光光度计作为一种简单的实验设备的话,就需要一种与cytochromeC和NBT相似的比色探针。
检测中最重要的一点是在没有其他物质干扰的情况下,测定出SOD100%的抑制率。
为了得到一种新的检测SOD的方法,我们对还原后能生成水溶性甲臢的四唑盐作了一系列的实验。
2.3.2邻苯三酚自氧法测定SOD的活力
SOD的活力测定方法很多,常见的有化学法、免疫法和等电点聚焦法。
其中化学法应用最普遍,化学法的原理主要是利用有些化合物在自氧化过程中会产生有色中间物和O2-,利用SOD分解而间接推算酶活力。
在化学方法中,最常用的有黄嘌呤氧化酶法,邻苯三酚法,化学发光法,肾上腺素法,NBT-还原法,光化学扩增法,Cyte还原法等。
其中改良的邻苯三酚自氧化法简单易行较为实用。
化学发光法和光化学扩增法不适用于测定Mn-SOD,但对于Cu/Zn-SOD反应极灵敏。
Cyte还原法用于Mn-SOD活力测定结果稳定,重复性好。
但专一性和灵敏度不够理想,而且需要特殊仪器,实际应用受到限制。
改良的邻苯三酚自氧化法简单易行较为实用。
1.在一般情况下,SOD酶活性测定只能应用间接活性测定法。
本实验采用邻苯三酚自氧化方法。
邻苯三酚在碱性条件下,能迅速自氧化,释放出O2-,生成带色的中间产物,反应开始后反应液先变成黄棕色,几分钟后转绿,几小时后又转变成黄色,这是因为生成的中间物不断氧化的结果。
这里测定的是邻苯三酚自氧化过程中的初始阶段,中间物的积累在滞留30~45s后,与时间成线性关系,一般线性时间维持在4min的范围内,中间物在420nm波长出有强烈光吸收。
当有SOD存在时,由于它能催化O2-与H+结合生成O2和H2O2,从而阻止了中间产物的积累,因此,通过计算即可求出SOD的酶活性。
2.酶活力单位定义:
在25℃恒温条件下,每毫升反应液中,每分钟抑制邻苯酚自氧化率达50%的酶量定义为1个酶活力单位。
2.4试验步骤
2.4.1胡萝卜中SOD的提取
方法A:
100g胡萝卜加少量水在组织捣碎机中高速破碎成匀浆,过滤;滤渣加适量水提取约3小时再过滤;重复前面操作一次。
合并三次过滤液,即为SOD粗酶液,置4℃冰箱尽早测定。
方法B:
100g胡萝卜按1g:
2-3ml的比例加50mmol/L的磷酸缓冲液,在组织捣碎机中高速破碎成匀浆,用离心机15000r/min离心15min,上清液即为SOD粗酶液,置4℃冰箱及时测定。
2.4.2胡萝卜中SOD的活力测定
1、邻苯三酚自氧化速率的测定
取两支试管按下表加入25℃预热过的缓冲液,然后加入预热过的邻苯三酚(空白管用10mmol/LHCl代替邻苯三酚),迅速摇匀,立即倾入1cm比色杯中,在325nm波长处测定光吸收值,每隔30s读数一次,测定4min内每分钟光吸收值的变化。
要求自氧化速率控制在每分钟的光吸收值为0.07(可增减邻苯三酚的加入量,以控制光吸收值)。
试剂空白管(mL)自氧化管(mL)pH8.2、50mmol/LTris-HCl2.982.9810mmol/LHCl0.020.0150mmol/L邻苯三酚-0.01
2、SOD样液的活性测定样品管取代自氧化管。
样品管测定时先加入预热的待测酶液,再加邻苯三酚。
其余步骤同邻苯三酚自氧化速率的测定。
试剂空白管(mL)样品管(mL)pH8.2、50mmol/LTris-HCl2.982.9810mmol/LHCl0.02-SOD样液-0.0150mmol/L邻苯三酚-0.01
3实验结果与分析讨论
3.1SOD的提取分析
表1试剂用量
试剂
试管号
空白对照0123456
0.1mol/LTris-Hcl
2ml
双蒸水
2ml
SOD终浓度
0
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
1.50
20mmol/LPR
0
20ul
系统PR浓度
0
0.10mmol//L
系统PH
8.2±0.01
表2PR的自氧化速率
PR自氧化时间(min)
1
2
3
4
5
6
OD
自氧化速率△A(min)
0.133
0.225
0.314
0.078
0.392
0.462
0.525
3.2SOD活力测定的分析
3.2.1不同的提取方案对SOD提取的影响
表3SOD终浓度对PR自氧化抑制率之间的关系
SOD终浓度
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
1.50
OD
抑制率(%)
0.392
/
0.340
13.26
0.297
24.23
0.255
35.00
0.205
47.70
0.168
57.14
0.145
65.87
标准方程
Y=0.0226X-0.0349R=0.9984
3.2.2胡萝卜中SOD测定结果
表4胡萝卜SOD测定结果
样品
胡萝卜A
胡萝卜B
SOD酶液总量(ml)
SOD酶液测定取样量(ul)
本底吸收值(OD)
反应液吸光度(OD)
抑制率(%,平均值)
反应液SOD浓度(U/ml)
胡萝卜SOD测定值(U/g,Fw)
300
50
0.183
0.464
28.24
0.59
140
2550
30
0.088
0.319
41.15
0.90
3051
注:
表中“胡萝卜A”指胡萝卜经“方法A”提取SOD,其他类推。
4结论
(1)胡萝卜含有丰富的SOD,不同的SOD提取方法对其活性影响很大,测定值相差几十倍。
实验表明,胡萝卜在加工过程中温度对SOD活力影响很大,常温下较长时间的处理破坏了SOD的活性(如方法A);而低温则能很好的保护其SOD的活性(如方法C)。
(2)在高等植物中,植物体内源SOD类型主要为Cu、Zn—SOD和Mn—SOD;有资料报道Mn—SOD对温度比较敏感,而Cu—SOD则对温度比较稳定。
据此,我们初步分析胡萝卜SOD类型很可能主要为Mn—SOD。
根据本实验对胡萝卜不同贮藏条件SOD活性的测定结果,我们建议在胡萝卜加工利用时,为了保护SOD的活性,原料应该在低温条件下贮藏,加工过程也应该尽量在低温下进行。
参考文献
[1]王钢.自由基与中医中药[M].南京:
南京大学出版社,1993.42-492.
[2]江苏省植物研究所.新华本草纲目(第三册)[M].上海:
上海科学技术出版社,1990,121.
[3]袁勤生.超氧化物歧化酶的研究进展[J].中国医学杂志,1989,24(7):
387-391.
[4]宋金耀.超氧化物歧化酶—邻苯三酚自氧化测活方法的改进[J].河北农业技术师范学院学报,1992,6
(2):
30—35.
[5]邹国林,桂兴芬,钟晓凌.一种SOD的测定方法—邻苯三酚自氧化法的改进[J].生
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