鸡卵类黏蛋白的分离纯化DOC文档格式.docx

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不同来源的卵类黏蛋白的N-末端残基有很大差异，鸡卵类黏蛋白的N-末端为Ala，C-末端为Phe。

卵类黏蛋白在中性或酸性溶液中对热和高浓度的尿素很稳定，在碱性溶液中比较不稳定，尤其当温度较高时易迅速失活。

鸡卵类黏蛋白对猪、牛的胰蛋白酶强烈抑制，对枯草杆菌蛋白酶有一定程度的抑制，但对人的胰蛋白酶无明显的抑制作用，对胰凝乳蛋白酶也无抑制作用。

2材料与方法

2.1材料

新鲜鸡蛋、0.05mol/L三氯乙酸溶液（TCA）、丙酮溶液、DEAE-纤维素、0.2mol/LpH6.5磷酸盐缓冲液、0.02mol/LpH6.5磷酸盐缓冲液、0.3mol氯化钠-0.02molPH6.5磷酸盐缓冲液、0.5mol/L氯化钠-0.02mol/LpH6.5磷酸盐缓冲液、3.0mLBAEE-0.05mol/LpH8.0Tris-HCl缓冲液、0.5mol/LpH8.0Tris-HCl缓冲液、0.05mol/LpH8.0Tris-HCl缓冲液胰蛋白酶、Folin-酚试剂：

试剂甲：

①4%碳酸钠溶液；

②0.2mol/L氢氧化钠溶液③1%硫酸铜溶液；

④2%酒石酸钾钠溶液。

先将①②等体积混合，再将③④等体积混合，再将这两种混合液按50：

1的比例混合，试剂乙、30%胶母液、pH8.9Tris-HCl缓冲液（含TEMED）、10%APs、pH6.7Tris-HCl缓冲液（含TEMED）、pH8.3Tris-甘氨酸缓冲液、BSA、Marker、考马斯亮蓝染色液、脱色液。

2.2仪器

离心机、恒温水浴锅、冰箱、紫外分光光度计、电泳仪、摇床、核酸蛋白检测仪、漏斗、透析袋、离心管（1.5mL）、烧杯（250mL、500mL、1000mL）、吸量管（0.5mL、1mL、5mL）、层析柱、铁架台、石英比色皿、微量进样器、十齿样品梳（厚度1mm）、细长头滴管离心管（1.5mL）、培养皿、成套玻璃板。

2.3方法

2.3.1有机溶剂分级沉淀CHOM粗品

2.3.1.1去除杂蛋白

两人一组，量取25mL新鲜鸡蛋清，盛于250mL烧杯内，烧杯置于25～30℃恒温水浴锅内，边搅拌边缓慢加入等体积4℃预冷的三氯乙酸（TCA）－丙酮溶液（1:

4体积比），出现大量白色沉淀，为杂蛋白，此时溶液的pH约为6～7，保温30min。

用大约7～8mL0.5mol/LTCA调节至pH3.5，使杂蛋白沉淀完全，在4℃下放置1h,4000r/min离心20min，轻轻将黄绿色上清液倒出，每2个人量取20mL（剩余的上清液扔掉），4个人合并为1组，共40mL，倒入250mL三角瓶中，用纸封口、贴标签放入冰箱中冷藏。

2.3.1.2沉淀粗品

4倍于上清液体积的-20℃预冷的丙酮（160mL），边搅拌边加入黄绿色上清液中，可见白色沉淀产生，在4℃冰箱中放置1－2h。

（课程安排在上午的，前一天下午沉淀，第二天上午上课时再离心）。

从冰箱中轻轻（不要将沉淀晃起！

）取出三角瓶，将上清液缓慢倒出，尽量少留上清液，总体积最多不超过40mL。

两两配平，4000r/min离心20min，弃上清液，得CHOM沉淀，加入4mL无离子水溶解。

2.3.1.3粗品获得

透析操作需戴上一次性手套或胶皮指套，以防手上的汗液等污染透析袋。

将透析袋用无离子水煮沸10min，再用无离子水清洗干净，一端用橡皮筋绑紧，用无离子水试漏，若不漏，再将4mL粗酶液装入透析袋，赶出透析袋中的气泡，留出约0.5cm富余，绑紧另一端，对无离子水透析，更换数次无离子水，以除去残留的TCA和丙酮，透析后可见少量沉淀（为变性蛋白），需离心去除。

透析过程至少需要2.0h，隔1h更换一次无离子水。

用滴管取出透析袋中的黏蛋白溶液（及时将透析袋用无离子水清洗干净），放入7mL离心管8000r/min离心10min，弃沉淀，上清液倒入另一7mL离心管，贴好标签，放入冰箱冷冻。

2.3.2DEAE-Cellulose纯化CHOM

2.3.2.2DEAE-纤维素的处理及再生

新纤维素的处理：

取50gDEAE-纤维素-32或DEAE-52，用少量水溶胀1h，用0.5mol/L氯化钠-0.5mol/L氢氧化钠溶液搅拌处理20min，用大量的蒸馏水洗至中性，再用0.5mol/L盐酸与0.5mol/L氯化钠溶液搅拌处理20min，用大量的蒸馏水洗至中性，再用0.5mol/L氯化钠溶液—-0.5mol/L氢氧化钠溶液处理一次，最后用大量的蒸馏水洗至中性，放置冰箱中保存。

旧纤维素的再生：

省去酸处理一步，只用0.5mol/L氯化钠溶液-0.5mol/L氢氧化钠溶液处理一次，用大量的蒸馏水洗至中性，置4℃冰箱中保存。

2.3.2.3装柱

取一支层析柱，检查上下端的螺口，用洗耳球吹硅胶管，使之通气。

下端螺口旋紧，用水止夹紧软硅胶管。

将层析柱垂直安装在铁架台上，先加入1/3～1/2柱体积的水，在柱的上端插一合适大小的玻璃漏斗，使漏斗颈的外径与层析柱的内径吻合，以防层析柱中的水或缓冲液渗出。

将处理好的DEAE-纤维素调成浆糊状，倒入漏斗，不断搅拌，使之自然沉降到1cm左右的高度。

打开柱下端的水止，继续搅拌漏斗内的纤维素，使之沉降至3/4柱高。

计算柱体积：

量测柱床的高度，柱内径为1cm，底面积乘以高位柱床体积。

将柱下端的硅胶管连接在核酸蛋白检测仪样品池的入口，打开核酸蛋白检测仪电源，将波长置于280nm处，预热至少30min，准备一个烧杯，收集样品池出口的流出液。

2.3.2.4平衡

用3倍柱体积的0.02mol/LpH6.5磷酸盐缓冲液（起始液）平衡层析柱。

始终保持柱床上边最少有2cm高度的缓冲液。

平衡过程中要做3件事情：

1、调节流速，使之在1～1.5mL/min之间；

2、调试核酸蛋白检测仪：

调透光率为100，吸光度为0。

首先将旋钮拨到T100%（指透光率），调“光量”到显示100。

再将旋钮拨到A（吸光度）（A有不同灵敏度，一般选择0.5A），调节“调零”到显示0（图6）。

继续平衡，如数字有波动，反复调节几次，使A值保持为0；

3、粗品的处理：

首先用10mL量筒测量上周离心后的粗品体积，记录体积！

记为Vcrude。

取1支7mL离心管，加入0.20mL0.2mol/LpH6.5磷酸盐缓冲液，摇匀，1.8mL粗品，混合，盐终浓度为0.02mol/L，用于本次纯化实验。

剩余粗品都装入原来的7mL离心管，用于蛋白质浓度测定、活性测定和电泳。

2.3.2.5上样

待平衡缓冲液即将全部流入柱床时，立即贴壁加2.0mL粗提样品，使样品全部缓慢流入层析柱床内，立即加起始液到柱床上边保持2cm高度（图7）。

记录上样时间，几点几分。

2.3.2.6洗脱

①起始液洗脱

首先以3倍柱体积的起始液洗脱，保持流速不变，观察核酸蛋白检测仪的A值变化情况。

当A值上升时，开始计时，并记录A值，当A值上升到最高值时，计时，并记录A值，A值下降到数值稳定时，计时，并记录A值。

若有蛋白流出，一般为溶菌酶、胰凝乳蛋白酶抑制剂等杂蛋白。

②0.3mol/L氯化钠-0.02mol/LpH6.5磷酸盐缓冲液洗脱

改用0.3mol/L氯化钠-0.02mol/LpH6.5磷酸盐缓冲液进行洗脱。

当A值急剧上升时收集，并计时，观察A的变化并记录A值和时间点。

当A值上升到最高值时，计时，并记录A值，下降到数值稳定时，计时，并记录A值。

（将洗脱峰的情况记录下来）

每管收集2mL。

准备更换另一种洗脱液。

若收集的洗脱液体积较小（小于5mL），则不需要浓缩！

若洗脱体积过大，纯品浓度较低，不能直接用于活性和蛋白质浓度测定，需要进行反透析。

先合并对应A值较高的收集液试管，如果透析袋装满，A值较低的收集液弃去不用。

如果透析袋未装满，则合并A值较低的收集液。

每组装满一根透析袋，上面加蔗糖晶体，利用蔗糖吸水性质，将透析袋里边的水吸出，最后，透析袋内的溶液浓缩到2~3mL之间。

将干瘪的透析袋一端的橡皮筋解开，将浓缩的纯品溶液（较粘）集中在一端，重新绑好皮筋（注意不要留空隙！

）。

透析袋再对无离子水透析（透析好的纯品，图10），测定纯化后鸡卵类黏蛋白的总体积，记为Vpurified，最大体积不要超过5mL。

③0.5mol/L氯化钠-0.02mol/LpH6.5磷酸盐缓冲液洗脱

继续用0.5mol/L氯化钠-0.02mol/LpH6.5磷酸盐缓冲液洗脱，观察是否有蛋白峰出现，如有蛋白峰，继续收集。

一般情况下不再有蛋白峰出现。

洗脱1个柱体积的溶液即可。

④起始液平衡

用1倍柱体积起始液继续平衡柱子。

用吸耳球将柱子内的纤维素吹到回收瓶回收。

⑤清洗核酸蛋白检测仪的样品池

以10mL无离子水清洗核酸蛋白检测仪样品池，从进样口注射无离子水，至出样口流出。

2.3.3粗品及纯品蛋白质浓度测定

2.3.3.1样品准备

实验三得到的CHOM纯品测量体积，记为Vpurified，装入7mL离心管中。

取1mL纯品稀释：

柱层析洗脱峰最大值在100以内的，先稀释5倍1。

柱层析洗脱峰最大值大于100以的，直接稀释10倍。

再取1mL用于本实验蛋白质浓度测定。

若A值超出标曲范围，在原来基础上再进行稀释。

从剩余粗品（稀释50、100倍），用于本实验蛋白质浓度测定。

2.3.3.2标准曲线的制作及样品的测定

试剂

管号及加量

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

BSA溶液/mL

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

无离子水/mL

蛋白质浓度/（ug/mL）

50

100

150

200

250

-

待测试样品/mL

混匀，于20-25℃放置10min

Folin-酚试剂甲/mL

5.0

Folin-酚试剂乙/mL

0.5

迅速混匀，于30℃水浴保温30min，以1号管反应液为空白，测A640

A640

注：

7号：

粗品稀释100倍8号：

粗品稀释100倍

9号：

纯品稀释20倍10号：

纯品稀释20倍

保温30min后，在722分光光度计上640nm处比色，以1号管溶液凋零，记录各试管的A640。

计算CHOM粗品、纯品的蛋白质浓度（单位：

mg/mL）；

查阅记录的Vcrude和Vpurified，计算粗品和纯品的总蛋白质含量（mg）。

2.3.4BAEE法测定CHOM活性

2.3.4.1胰蛋白酶活性测定

本实验采用10mg/mL胰蛋白酶溶液，加量为50μL。

取一只石英比色皿（带盖，光程为1cm），加入25℃预热的BAEE3.0mL，在紫外分光光度计的动力学模式下，测定A253，以此为空白，校正100%T/0Abs。

取出比色皿，加入50μL胰蛋白酶液（酶浓度10mg/mL），立即混匀，测定A253的增加，每隔30秒读一次数，测定185秒。

一般情况下，此浓度酶液催化底物显色，A值呈线性增加.

计算胰蛋白酶活性和比活力：

根据时间－光密度关系曲线中的直线部分，任选一时间间隔（∆t）与相应吸光度值变化（∆A），按以下公式计算胰蛋白酶的活力单位和比活力。

胰蛋白酶活力单位（BAEE单位）=∆A/∆t×

0.001；

比活力=酶活力单位/毫克蛋白质=（∆A/∆t×

0.001）÷

M测；

（式中:

∆A/∆t为每min吸光度值的增加）

M测指测定时所加胰蛋白酶的量，单位为mg；

（M测=50μL×

10mg/mL=500μg=0.5mg）

0.001为吸光度值增加0.001单位定为1个BAEE活力单位的常数。

2.3.4.2黏蛋白粗品的抑制活力

（1）调节粗品pH至8.0，浓度至0.05mol/L：

从剩余粗品管中，取0.9mL，加入0.10mL的0.5mol/LpH8.0Tris-HCl缓冲液，混匀，使缓冲液为0.05mol/LpH8.0Tris-HCl，供本次实验BAEE法测定黏蛋白对胰蛋白酶的抑制活性之用。

剩下的依旧放冰箱冷冻保存。

粗品的稀释：

从调节好pH的1mL粗品溶液中，取10μL粗品，加90μL0.05mol/LpH8.0Tris-HCl缓冲液，混匀（即稀释10倍）。

（3）粗品对胰蛋白酶的抑制作用

取20μL稀释的粗品与100μL胰蛋白酶溶液混合、混匀（卵类蛋白量不能超过胰蛋白酶量，一般以抑制50%较为合适，具体视卵类黏蛋白的纯度而异），在25℃保温10min，使酶与抑制剂充分结合。

（4）粗品抑制后剩余活力测定

取一只石英比色皿，加入25℃预热的3mLBAEE，动力学模式下测定A253，以此空白校准。

将黏蛋白粗品抑制后的60uL混合液，加入比色皿中，迅速混匀（盖盖，颠倒混匀！

），动力学模式下测定A253变化，每隔30秒读一次数，测定185秒。

记录每30秒的测定数据。

测定一个样品之后，一定要按“Esc”退出。

倒掉石英比色皿中的液体，清洗干净！

测定下一个样品，重新装入3mLBAEE，一定要重新按“100%T/0Abs”校准。

根据时间－光密度关系曲线中的直线部分，任选一时间间隔（∆t）与相应吸光度值变化（∆OD），按前述公式计算粗品抑制后的胰蛋白酶剩余活力。

胰蛋白酶活力（U）－粗品抑制后的剩余活力（U）=黏蛋白粗品的抑制活力（U）。

计算出每mL粗品的抑制活力，再乘以粗品体积，计算出黏蛋白粗品的总抑制活力。

2.3.4.3黏蛋白纯品的抑制活力

（1）调节纯品的pH至8.0，浓度至0.05mol/L

从剩余的纯品管中，取0.9mL纯品，加入0.10mL0.5mol/LpH8.0Tris-HCI缓冲液，使缓冲液为0.05mol/LpH8.0Tris-HCl，供本次实验BAEE法测定纯品对胰蛋白酶的抑制活性.剩下的依旧放冰箱冷冻保存。

（2）纯品对胰蛋白酶的抑制作用

取20μL纯品与100μL胰蛋白酶溶液混合（卵类蛋白量不能超过胰蛋白酶量，一般以抑制50%较适合，具体视卵类黏蛋白的纯度而异），在25℃保温10min左右，使酶与抑制剂充分结合。

（3）纯品抑制后的剩余活力测定：

在一只石英比色皿中，加入25℃预热的3mLBAEE，动力学模式下测定A253，以此调零。

将黏蛋白纯品抑制后的60uL混合液，加入比色皿中，混匀（盖盖，颠倒混匀！

），动力学模式下测定A253变化，每隔30秒测定一次，记录数据，测定3～5min。

根据时间－光密度关系曲线中的直线部分，任选一时间间隔（∆t）与相应光密度值变化（∆OD），

按前述公式计算抑制后的胰蛋白酶剩余活力。

胰蛋白酶活力（U）－纯品抑制后的剩余活力（U）=黏蛋白纯品的抑制活力（U）。

2.3.5SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）检测CHOM纯度及相对分子质量

2.3.5.1配制分离胶和灌胶

1、分离胶制备及灌胶：

按下表配制分离胶

表2SDS-PAGE分离胶的配制方法

加量

30%胶母液/mL

2.8

pH8.9Tris-HCl缓冲液/Ml（含TEMED）

1.8

蒸馏水定容至/mL

混匀后加入10%APS/uL

灌分离胶：

先将配制的分离胶加在玻璃板之间，7mL胶液几乎全部灌入，至高出灰色横梁2mm。

在加入过硫酸铵之后，应在5min内灌胶。

再取100微升水，轻轻加在胶面上。

2、浓缩胶制备及灌胶：

按下表配制浓缩胶

表3SDS-PAGE浓缩胶的配制方法

pH6.7Tris-HCl缓冲液/Ml（含TEMED）

40

灌浓缩胶：

一定要待分离胶聚合以后（大约20-30min），可见水与凝固的胶面之间有折射率不同的界线，倒去上层水，再用滤纸条吸去胶面上多余的水，注意不要碰到胶面。

灌浓缩胶，插上样品梳（注意：

梳子的平面对准高玻璃板）浓缩胶大约20min聚合。

2.3.5.2加入电极缓冲液

在电泳槽中加入pH8.3Tris-甘氨酸缓冲液（旧），使之没过电极丝即可；

在矮板之间加入pH8.3Tris-甘氨酸缓冲液（新），使之没过矮板。

2.3.5.3点样样品的制备

低分子量Marker由指导教师准备，每组用一支Marker。

牛血清白蛋白（BSA）：

取0.5mL离心管，加25μLBSA（0.5mg/mL）和25μL样品缓冲液，混匀，由指导教师准备；

粗品CHOM：

取1.5mL离心管，加100μL粗品和100μL2×

样品缓冲液，混匀；

纯品CHOM:

取1.5mL离心管，加100μL纯品和100μL2×

样品液，混匀；

4支离心管置海绵托上沸水浴加热3min；

制样之后，将纯品和粗品管放回塑料袋，冷冻保存。

2.3.5.4点样

按下表点样：

表4SDS-PAGE上样表

泳道

样品

粗品

BSA

Marker

纯品

点样量（ul）

15

20

30

2.3.5.4电泳

A：

在电泳槽的正极槽加电泳缓冲液，没过电极丝即可；

负极槽加缓冲液，一定要没过矮玻璃板。

B：

插好电泳仪电源，连接电泳仪和电泳槽之间的电极线。

样品在浓缩胶里，调节电压：

150V。

样品在分离胶里，调节电压：

200V。

当指示剂染料距离凝胶底部约1cm时，停止电泳，记录电泳时间。

2.3.5.5剥胶

A:

弃去电泳槽正极缓冲液，回收负极缓冲液。

B:

取出玻璃板，小心撬开玻璃，在1#上样井对应的胶底部切下一个小三角做标记。

小心将胶剥入大培养皿中（大培养皿底的边上贴好各组的标签）。

2.3.5.6染色、脱色

在大培养品皿中加入考马斯亮