过氧化氢酶(CAT)活性的测定.doc
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过氧化氢酶(CAT)活性的测定:
紫外吸收法
一、目的与要求
过氧化氢酶普遍存在于植物的所有组织中,其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能力有一定关系,故常加以测定。
二、原理
过氧化氢酶(catalase)属于血红蛋白酶,含有铁,它能催化过氧化氢分解为水和分子氧,在此过程中起传递电子的作用,过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。
可根据H2O2的消耗量或O2的生成量测定该酶活力大小。
过氧化氢在240nm波长下有强烈吸收,过氧化氢酶能分解过氧化氢,使反应溶液的吸光度(A240)随反应时间而降低。
根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。
三、材料、仪器设备及试剂
(一)材料:
小麦或其它叶片
(二)仪器设备:
1.研钵;2.紫外分光光度计;3.离心机;4.恒温水浴;
5.容量瓶。
(三)试剂:
1.0.2mol/LpH7.8磷酸缓冲液(pH7.8:
0.2mol/LNa2HP0491.5ml;0.2mol/LNaH2P048.5ml);
2.0.1mol/LH2O2(30%的H2O2溶液5.68ml稀释至1000ml)
二、实验步骤:
1、酶液提取称取新鲜植物叶片或其它组织0.5g,置于研钵中,加入2~3ml4℃下预冷的pH7.0磷酸缓冲液和少量石英砂研磨匀浆后,转入25ml容量瓶中,并用缓冲液冲研钵数次,合并冲洗液,并定容到刻度。
混合均匀,将容量瓶置5℃冰箱中静置10min,取上清液在4000r/min下离心15min,上清液即为过氧化氢粗提液,5℃下保存备用。
2、测定10ml试管3支,其中2支为样品测定管,1支为空白管,按表1-1顺序加入试剂。
25℃预热后,逐管加入0.6ml0.1mol/l的H2O2,每加完1管立即记时,并迅速倒入石英比色杯中,260nm下测定吸光度,每隔1min读数1次,共测4min,待3支管全部测完后,按式(1-1)计算酶活性。
表1-1紫外吸收法测H2O2样品测定液配制表
管号
S1
S2
S0
空白
粗酶液(ml)
0.4
0.4
0.4(失活酶液)
0.4(磷酸缓冲液)
PH7.8磷酸缓冲液(ml)
3.0
3.0
3.0
3.0
蒸馏水(ml)
2.0
2.0
2.0
2.0
3、结果计算以1min内A240减少0.1的酶量为1个酶活单位(μ)。
过氧化氢酶活性(μ.g-1min-1)=ΔA240*Vt/(0.1*Vl*t*FW)(1-1)
式中ΔA240:
As0-(As1+As2)/2;
As0:
加入失活酶液的对照管吸光值;
As1,As2:
样品管吸光值;
Vt:
粗酶提取液总体积(ml);
Vl:
测定用粗酶提取液体积(ml);
FW:
样品鲜重(g);
0.1:
A240每下降0.1为1个酶活单位(μ);
t:
过氧化氢到最后一次读数时间(min)
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