糖脂代谢稳态调控的分子机制.doc
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项目名称:
糖脂代谢稳态调控的分子机制
首席科学家:
林圣彩厦门大学
起止年限:
2011.1至2015.8
依托部门:
教育部
二、预期目标
1.总体目标
确定机体和细胞在不同生理状况和环境因素下维持糖脂代谢稳态的分子机制,阐明在细胞生长和应激反应中起重要作用的调节因子调控细胞代谢的信号通路网络,为糖脂代谢紊乱造成的肥胖、脂肪肝、糖尿病和癌症的早期诊断和治疗提供理论依据。
2.五年预期目标
(1)建立对实验动物代谢相关的生理生化指标分析的技术平台,发现相关基因敲除或转基因小鼠造成糖脂代谢紊乱的信号通路。
(2)较系统地描述在逆境下机体和细胞调控糖脂代谢的分子网络以及调控过程中关键蛋白质和蛋白质复合体的动态调控机制。
(3)发现新的参与代谢调控的基因,为代谢性疾病和肿瘤的防治提供新的分子靶标。
(4)培养高质量博士研究生20-30名,培养3-5名享有国际知名度的专家和5-8名中青年学术带头人。
(5)在国际重要刊物发表SCI论文15-25篇,其中争取在Cell、Nature、Science或其子刊等影响因子10以上杂志发表研究论文5-10篇,申请发明专利3-5项。
三、研究方案
1.总体研究方案
细胞能量代谢是细胞最基本、最重要的活动之一,与细胞的繁殖、分化、凋亡、运动、信号转导及多种重要疾病的发生密切相关,是生命科学的一个重要领域。
细胞要通过能量感应系统随时监测其能量水平状态,在不同的物质和能量状态下要不断地通过细胞内的代谢调控途径来调节其代谢水平以达到一种稳态。
同时,细胞在面对内外界一些不良因素时也会做出相应的代谢变化,这些应激反应对细胞正常的生长和功能是极其重要的。
如果这些应激反应失调,就会使细胞代谢发生异变,导致如前所述的多种人类重大疾病的发生。
本项目的总体研究方案拟利用我们在蛋白质科学、细胞代谢、细胞信号转导等研究领域的研究优势和技术手段,结合细胞生物学、动物生理学等学科的研究方法,集中力量多层次、多角度地研究与细胞代谢调控相关的信号通路网络,分离和鉴定参与细胞代谢调控的新的基因和信号通路,探讨各个信号通路之间的动态调控机制,并研究细胞异常代谢的信号通路,揭示代谢异常与糖尿病、肿瘤等重大疾病的关系。
项目总体研究方案如下图1:
图1.项目总体研究方案
2.技术路线
由于代谢调控常常涉及多种组织、器官乃至整个机体,因此利用基因敲除小鼠模型来确证基因在代谢过程中的生理功能已成为“金标准”。
本项目组已经拥有或正在构建各种基因敲除小鼠和转基因小鼠模型,包括TNKS2、PTEN、CKIP-1、cideb、p53、Lkb1、Tip60基因敲除小鼠以及cidea转基因小鼠。
我们将利用这些小鼠模型,比较研究代谢调控在正常生理状况以及不同内外因素的刺激下细胞能量代谢的变化及其调控的信号通路网络。
同时,我们也将借助体外细胞培养,特别是比较研究正常细胞以及肿瘤细胞在低氧状况下和目前常规培养状况下代谢调控的异同,并与机体内生理条件下代谢调控的情况相比较,寻找适合代谢调控研究的细胞培养模型。
在此基础上验证从动物模型得到的结果,并在分子水平上进一步深入研究影响细胞代谢的信号通路网络和调控机制。
此外,我们将通过酵母双杂交、分子筛层析、免疫共沉淀和质谱等等蛋白质研究手段捕捉并鉴定与代谢调控相关的蛋白质复合体及其组份,从而为阐明代谢调控中各种蛋白质复合体的动态组装奠定基础。
同时,利用蛋白质结构解析来揭示各种蛋白质复合体中蛋白质的相互作用关系。
故,项目的总体技术路线如图2:
图2.项目的总体技术路线
3.创新与特色
本项目拟利用已有或正在进行的各种基因敲除小鼠模型,在动物个体的基础上阐明代谢调控的机理和生理作用。
同时,借助我们在脂质组学、代谢组学、蛋白质组学、功能基因组学方面的研究基础和优势,对调控糖脂代谢稳态的分子机制进行研究,探索细胞在不同逆境(低氧、缺氧、高脂等)下的代谢方式的转变及其调控信号通路网络的动态变化,特别是深入探讨细胞生长和应激反应的重要调节因子对细胞代谢的调控作用,将在分子水平、细胞水平以及动物个体水平上增进我们对代谢调控以及异常代谢与细胞异常增殖之间的关系的认识。
为最终阐明细胞糖脂代谢稳态调控的分子机制和相关重大疾病的防治提供理论基础。
4.课题设置
课题1糖脂转运及其稳态调控的的分子机制
研究内容:
细胞内糖脂代谢的稳态调控是维持细胞或机体基本生命活动的基础,糖脂代谢的紊乱与糖尿病、肥胖、脂肪肝、心血管疾病、细胞异常增殖以及癌症的发生和发展密切相关。
本课题将在分子、细胞和基因敲除小鼠水平上研究Axin、AMPK、TNKS2、PTEN、Cideb、Cidea等基因对葡萄糖转运、脂肪合成和储存、脂滴的形成等代谢途径的调节作用及其与肥胖症、脂肪肝和细胞异常增殖的关系。
从细胞学的角度来看,肥胖的发生是由于脂肪细胞数量的增加以及脂肪细胞中脂滴变大两个方面引起的。
研究表明,伴随着脂滴的变大,脂肪细胞变大,导致细胞炎症因子分泌的变化,例如resistin、TNFα和游离脂肪酸等分泌的增加,最终导致机体内胰岛素抵抗和糖尿病的发生。
因此,对脂滴的形成过程的研究,不仅有助于我们了解脂滴的生物学功能,而且对肥胖及肥胖引起的其它代谢综合症疾病,有深远意义。
课题1拟开展以下几个方面的研究:
1.糖代谢的稳态调控
通过前期工作,我们发现Axin和AMPKb能相互作用并增强AMPK响应能量缺失的刺激,即AMPKα的第172位苏氨酸的磷酸化。
Axin敲低的细胞在受到低糖刺激的情况下,AMPKa的第172位苏氨酸的磷酸化水平增加幅度与正常细胞相比大幅降低。
这表明Axin是应对糖稳态变化的重要因子,且在AMPK活性调控的过程中扮演了重要角色。
我们拟进行以下实验,深入阐明Axin、AMPK和糖稳态调控的关系:
(1)研究Axin调控AMPK活性的分子机制研究Axin调节AMPK的激活是通过影响AMPK上游激酶与AMPK的相互作用还是影响了AMPK三个亚基之间的相互作用。
(2)应用小鼠模型研究Axin缺失或突变导致的AMPK活性的变化利用腺病毒感染系统特异性地敲低小鼠肝脏或肌肉中的Axin,或利用条件性基因敲除技术敲除小鼠肝脏或肌中的Axin,对这些小鼠施以饥饿等影响能量水平的刺激,观察动物体内AMPK活性的变化。
(3)应用小鼠模型研究Axin缺失或突变导致的糖稳态平衡的改变对上述小鼠进行糖代谢相关生化指标的测定以及AMPK参与糖代谢相关基因的表达水平的检测。
(4)研究Aurora在Axin调控AMPK活性中的作用Aurora是在生长中起重要作用的激酶,能调控Axin在中心粒上的定位,因此,我们拟研究Aurora是否在Axin调控AMPK活性中也起作用。
2.研究葡萄糖转运和脂肪细胞生成的分子机制以及糖脂代谢异常与肥胖和胰岛素抵抗的关系
(1)研究Axin和TNKS2对葡萄糖转运的调节机理我们通过酵母双杂交实验发现Axin能与TNKS2相互作用;TNKS2与Kif3a之间相互作用;Axin与Kif3a之间也存在相互作用。
Kif3是由Kif3a、Kif3b和KAP3构成的异源三聚体。
它是一种依赖于微管的马达动力蛋白质复合体,可以向微管正极定向移动,在细胞内承担膜性细胞器或生物大分子复合物的运输功能。
已有的研究表明在3T3-L1脂肪细胞中Kif3参与胰岛素调节的Glut4向细胞膜的转运。
TNKS2与GSV(Glut4storagevesicle)上的IRAP有相互作用。
我们将通过免疫荧光实验确定Kif3a、TNKS2、Axin和Glut4之间是否有共定位,而且在胰岛素刺激下是否有向细胞膜共转移的现象。
同时,我们将用siRNA干扰C2C12细胞中TNKS2、Axin及Kif3a的表达,观察细胞对胰岛素刺激下葡萄糖吸收的反应。
另外,用TNKS2抑制剂XAV939(由厦门大学生命科学学院沈月毛教授合成)刺激C2C12细胞,观察该抑制剂是否能降低胰岛素刺激引起的葡萄糖的吸收。
通过上述实验我们将证明Kif3a、TNKS2、Axin是否通过形成复合体来调控胰岛素刺激的Glut4的转运,从而调节葡萄糖的吸收。
(2)分离TNKS2的新的蛋白质复合体为了更全面的找到以TNKS2为核心的调节糖脂代谢的分子网络,我们拟构建TNKS2不同片段的饵,使其覆盖TNKS2全蛋白质序列,进行大规模的酵母双杂交实验。
另一方面,我们拟以小鼠的肌肉、脂肪组织为原料,采用以高效液相色谱为核心的生化分离手段结合蛋白质谱分析技术,分离鉴定出不同生理水平下TNKS2复合体中的蛋白质组份,并用免疫共沉淀、免疫荧光共定位及GST-pulldown等方法进一步验证这些蛋白质与TNKS2的相互作用。
(3)研究TNKS2的多聚ADP核糖化酶活性在调节葡萄糖转运及脂肪细胞生成中的作用。
首先我们将通过质谱手段检测胰岛素是否调控TNKS2的翻译后修饰,进而研究该修饰是否影响TNKS2的多聚ADP核糖化酶的活性及TNKS2和其相互作用蛋白质的结合。
此外,由于TNKS2具有多聚ADP核糖化酶的活性,我们将考察TNKS2是否介导与其相互作用的蛋白质的多聚ADP核糖化修饰。
在此基础上我们将构建TNKS2的多聚ADP核糖化酶活性缺失的表达载体,研究其形成复合体的能力及调节葡萄糖转运和脂肪细胞生成的作用。
(4)在动物水平上研究调控葡萄糖转运及脂肪细胞生成的分子机制。
全面分析TNKS2基因敲除小鼠与代谢相关的表型,包括小鼠在不同生长时期、不同生长条件(饥饿或饱食、缺氧等)下的体重、体温、不同部位脂肪组织的重量和脂肪细胞的数量、内脏器官的重量等。
同时测定小鼠血液中血糖、甘油三酯、不饱和脂肪酸、胰岛素、胰高血糖素及瘦素的含量;脂肪组织中脂肪的含量;肝脏和肌肉中糖原的含量等。
此外,对小鼠进行葡萄糖耐受试验、丙酮酸耐受试验及胰岛素耐受试验,测定小鼠脂肪和肌肉的葡萄糖吸收效率。
由于腺病毒感染系统可以特异性地攻击肝脏和肌肉,我们将利用该系统在小鼠的肝脏和肌肉中导入针对Axin及上述新发现的TNKS2的复合体的组份的siRNA,测定小鼠与代谢相关的表型,确定这些分子及其复合体在调控葡萄糖转运及脂肪细胞生成中的作用。
同时,我们将建立上述基因的条件性敲除或敲入小鼠,分析这些小鼠与糖脂代谢相关的表型,为分子及细胞水平的研究结果提供生理证据。
另一方面,我们拟与厦门大学附属第一医院合作,在肥胖症、糖尿病等代谢相关疾病的病人中检测脂肪组织中TNKS2的表达及基因突变情况,以期为代谢相关性疾病的早期分子诊断提供依据。
3.脂代谢稳态调控的机制
研究Cide家族蛋白质(Cidea,Cideb和Fsp27),PTEN和AMPK在脂肪细胞和肝细胞中脂代谢稳态包括脂储存,脂分解和分泌中的作用,运用转基因和基因敲除模型在动物水平上研究脂代谢与脂肪肝发生,肝组织纤维化,炎症反应,细胞异常增殖之间关系。
(1)Cide家族蛋白质在脂肪细胞中脂滴形成、融合与水解的作用及其机制
我们通过Fsp27基因敲除小鼠,小鼠胚胎纤维细胞和脂肪细胞株3T3-L1的研究表明Fsp27蛋白质定位于脂滴表面,可控制脂肪细胞中脂滴的形成,脂水解,并在脂肪细胞中基因表达调控以及胰岛素的敏感性中起重要作用。
但其作用的分子机制还不清楚。
我们将通过生物化学方法分离和纯化Fsp27以及脂滴,建立体外脂滴融合体系,并通过细胞影像系统活体详细研究脂滴的动态变化过程。
我们将采用酵母双杂交、免疫共沉淀的方法,寻求与Fsp27相互作用的蛋白质,研究其与Fsp27相互协调调控脂滴的动态变化。
同时,我们还将建立脂肪细胞特异过表达Fsp27的转基因小鼠,研究在Fsp27过表达后动物脂肪细胞的脂滴的大小、脂水解的活性、脂肪细胞的分化以及胰岛素敏感性、血脂的含量以及脂肪过量积累对肝脏和骨骼肌的脂代谢等的关系;并用脂质组学、蛋白质组学和基因组学等方法研究Fsp27调控脂肪细胞脂代谢的分子机制。
(2)CIDE蛋白质、PTEN、AMPK等调控肝脏细胞脂代谢的机制
利用我们现有的Cide家族敲除小鼠和将建立的PTEN肝脏特异敲除小鼠,我们将研究:
①CIDE家族蛋白质和PTEN在肝脏细胞中脂肪积累、脂肪合成、脂肪酸氧化以及VLDL分泌等脂代谢的调控机制;肝脏脂代谢稳态调控与脂肪肝的发生;利用酵母双杂交、免疫共沉淀、基因组学和蛋白质组学等手段找寻在肝脏中与CIDE家族蛋白质相互作用蛋白质以及受CIDE蛋白质调控的代谢网络。
②利用化学诱变剂促使肝脏细胞发生癌变。
研究从脂肪肝发生后到肝脏的癌变过程中糖脂代谢的变化,炎症因子的变化情况及致癌相关基因的表达情况。
检测脂肪肝发生、组织纤维化、癌变以及与炎症反应之间关系。
③利用原代肝细胞或肝细胞系为模型详细研究CIDE蛋白质、PTEN和AMPK在肝细胞中脂肪积累、脂代谢的调控、细胞增殖和凋亡的分子机制。
从转基因和肥胖小鼠中分离原代肝细胞及利用实验室已有的肝细胞系,用各种因子如炎症因子、脂肪酸、细胞凋亡因子等刺激,详细研究肝细胞的脂肪积累、细胞增殖和凋亡的机制,在细胞和分子水平上解释肝脏的脂肪积累和其病变的关系。
4.研究甘油代谢限速酶GK、胰岛素信号通路重要节点分子Akt1以及肝脏重要转录因子HNF1α在糖尿病发生、发展、与调控过程中的分子机制。
(1)GK/TR3相互作用在肝细胞糖原异生代谢的影响:
GK与TR3相互作用的特性,如相互作用结构域、影响因素、特异性等;GK对TR3调控功能的影响,包括TR3的转录活性及DNA结合活性;GK/TR3相互作用对肝细胞功能及糖异生代谢的影响;应用转基因小鼠分析GK/TR3相互作用对糖异生代谢及胰岛素水平等的影响。
(2)研究Akt蛋白质复合体功能:
拟通过串联亲和纯化技术联合质谱技术的实验策略纯化鉴定人肝癌细胞的Akt1蛋白质复合体,获得一批Akt1的候选相互作用蛋白质。
(3)HNF1α/14-3-3ξ相互作用的分子机制及其在HNF1α选择性调控基因表达中的作用进行深入研究:
HNF1α/14-3-3ξ相互作用的特性(如作用位点、特异性、影响因素等)及相互作用的功能(如促进二聚化、稳定磷酸化、增强DNA的结合、增强转录激活活性、介导泛素化、以及是否介导HNF1α与其它蛋白质的协同调控等)。
研究目标:
1.鉴定5-10个与糖脂代谢相关的基因的功能,并阐述其在维持糖脂代谢稳态的过程中的分子机制;
2.阐述以上基因是如何通过调控糖脂代谢稳态而影响肥胖、糖尿病、细胞异常增殖的发生发展的。
承担单位:
厦门大学、清华大学、中国医学科学院肿瘤研究所
课题负责人:
林圣彩
学术骨干:
李蓬、宋咏梅、杨叔禹、林舒勇、李丹
课题经费比例:
33%
课题2调节细胞生长及应激反应的关键因子调控能量代谢的分子机制
研究内容:
细胞在异常增殖和应激反应下会发生能量代谢的改变,但是导致代谢改变的分子机理仍不清楚。
目前的研究表明调节细胞生长及应激反应的关键因子在调控能量代谢中也起重要作用,如我们发现CKIP-1可以影响肥胖的发生和痩素的分泌;p53被发现在细胞代谢特别是肿瘤细胞的异常代谢中具有重要的功能,通过对不同靶基因表达的调控和参与调节mTOR、NF-κB等代谢核心信号转导途径来调控氧化磷酸化、糖酵解等过程;TR3除了调节糖异生途径外,还参与调控糖酵解、糖原分解和磷酸甘油的穿梭转运。
此外,低氧是典型的逆境应激反应;适度低氧所引起的细胞代谢的变化和能量的产生及利用不同于以往的缺氧效应。
低氧引起细胞代谢改变的分子机制及生化过程目前仍不清楚。
本课题拟以CKIP-1、p53、TR3和HIF1信号通路为中心,深入探讨细胞在各种应激反应中能量代谢的变化和分子机制。
课题2拟开展的研究内容如下:
1.研究CKIP-1在肥胖和瘦素分泌过程中的地位以及TGFβ超家族信号通路在能量代谢稳态调控中的作用
利用CKIP-1-/-小鼠模型研究CKIP-1在肥胖和瘦素分泌过程中的地位以及TGFβ超家族信号通路在能量代谢稳态调控中的作用,阐明其发挥功能的信号转导机制。
(1)前期研究发现,在正常饮食下,CKIP-1+/+与CKIP-1-/-小鼠体重增加并无二致;而在高脂饮食下,CKIP-1-/-小鼠体重显著增加。
我们首先拟开展实验的是检测高脂饮食下的血糖稳态维持有无异常,即以空腹血糖,葡萄糖耐受和胰岛素抵抗等指标来确定CKIP-1-/-小鼠是否具有Ⅱ型糖尿病表型。
此外,检测CKIP-1+/+与CKIP-1-/-小鼠血清中甘油三酯、总胆固醇、高密度和低密度载脂蛋白质含量,以确定CKIP-1是否影响了血脂代谢。
另一方面,我们也会对高脂饮食下CKIP-1-/-小鼠体重显著增加的原因作出探究,拟对两种基因型小鼠摄食量,活动性,呼吸熵,线粒体氧化效率等反映能量利用的指标做出评估,以期找到CKIP-1-/-小鼠肥胖易感的原因。
(2)我们拟研究正常和高脂饮食下CKIP-1+/+与CKIP-1-/-小鼠脂肪组织总量、脂肪细胞个体大小以及脂肪细胞分泌的细胞因子如瘦素(leptin)、脂联素(adiponectin)、抵抗素(resistin)等重要指标的变化,检测两种基因型小鼠肝细胞内甘油三酯储存量以及调控其储存的关键蛋白质如PPARα等的表达水平,明确CKIP-1基因对脂肪细胞、肝细胞和骨骼肌细胞功能的调控作用。
同时,进行两种基因型小鼠骨骼肌能量代谢指标的比较,评估氧化磷酸化过程中重要蛋白质UCP家族的表达变化差异。
(3)阐明CKIP-1基因调控细胞代谢的信号转导通路,研究在正常和高脂饮食下CKIP-1缺失对JNK通路及PI3K-AKT-mTOR通路的影响;研究CKIP-1对于p53在代谢调控中作用的影响及其信号通路;并研究CKIP-1是否可以通过调节泛素连接酶Smurf1降解Smad1来影响TGFβ/BMP超家族信号通路对于能量稳态的维持。
2.异常细胞代谢的分子调控网络及调控的分子机制
以p53为节点分子寻找选择性调控p53代谢相关途径的分子,并对这些分子的功能及作用机制进行研究,揭示在细胞变异及在逆境应激反应中p53参与代谢调控的调控网络及调控机制。
(1)KRAB型锌指蛋白质家族中代谢相关的p53选择性调控分子筛选:
第一轮筛选:
比照Apak的功能特点,即在应激信号下,发生磷酸化与p53解离,解除对p53的抑制功能,提供生物信息学分析,将含有各种应激信号相关激酶磷酸化位点的成员克隆及确认表达;第二轮筛选:
通过报告基因活性测定筛选出能抑制p53转录活性的成员;第三轮筛选:
通过实时定量PCR及ChIP实验筛选能够选择性调控p53代谢相关靶基因表达的成员;
(2)代谢相关的p53选择性调控分子的功能及作用机制研究:
A.经过以上三轮筛选,得到p53选择性代谢调控分子成员后,检测它们如何调控p53的活性、稳定性,是否影响p53的翻译后修饰;针对细胞代谢途径,选择性的检测它们对糖代谢途径、合成代谢途径、细胞自噬、脂类代谢等途径的调控功能及变化等进行系统研究。
B.分析在细胞异变及在逆境应激反应,如缺氧及营养匮乏等条件下,调控分子与p53的结合状态,p53活性的变化及变化机制等。
(3)对p53选择性代谢调控分子进行组织细胞表达谱分析:
通过Northernblot、q-PCR、Westernblot等手段分析相关成员的细胞、组织、器官表达谱,揭示它们的分布规律,不同成员之间的重叠性。
(4)对p53选择性代谢调控分子进行功能协同关系研究:
对于组织表达谱有重叠的p53选择性代谢调控分子,通过单一和联合RNAi技术敲低一个或多个成员的表达,检测它们在p53调控中的功能重叠度。
3.细胞在逆境应激反应中能量代谢的调控机制
我们将在低氧和缺氧条件下研究细胞代谢的变化及其分子机制。
利用不同的类型的细胞为模型,明确低氧和缺氧与细胞行为的关系,分离鉴定参与低氧和缺氧逆境中的能量代谢调控的关键因子分子并阐明其分子机制。
(1)揭示细胞在低氧或缺氧环境中能量代谢的变化
比较分析细胞在低氧或缺氧环境中能量代谢的变化与细胞行为的关系,以及对HIF1信号通路和代谢调控相关的酶的调节作用。
①研究细胞在低氧和缺氧环境中的代谢变化。
主要检测氧化磷酸化水平,葡萄糖的转运和酵解,糖原的合成和ATP的产生和利用等;以及对低氧诱导因子(HIF1)和下游靶基因如调控氧化磷酸化和糖酵解相关酶的活性和表达的变化和调控关系。
②从缺氧的另一方面,研究缺氧诱导ROS产生过程中,对细胞损伤修复具有重要调节作用的APE/Ref-1的作用和对代谢的调节。
确认缺氧诱导的ROS是否引起APE/Ref-1的泛素化修饰,及该泛素化途径是否通过p53-MDM2通路介导。
探讨APE/Ref-1可否被缺氧诱导的ROS磷酸化,及ROS清除剂是否具有抑磷酸化作用,并在此基础上探讨该作用是否为其泛酸化的前提。
探究氧化应激中APE/Ref-1在低氧或缺氧环境中对细胞能量代谢的调节和调控机制的研究
(2)探究细胞在低氧或缺氧环境中对细胞能量代谢调节的分子机制,筛选鉴定在不同氧浓度条件下参与能量代谢的重要的蛋白质激酶、蛋白质磷酸酶及泛素连接酶①蛋白质激酶、蛋白质磷酸酶和泛素连接酶筛选:
通过2Dgel/DIGE法筛选蛋白质激酶。
在常氧、正常低氧、低氧和无氧的条件下培养细胞,提取细胞提取物,然后利用ATP-sepharose亲和层析柱子来分离、富集蛋白质激酶。
利用DIGE技术在2D胶上分离显示差异表达的蛋白质激酶,用质谱蛋白质鉴定技术来鉴定这些差异表达的蛋白质激酶。
②过表达筛选:
构建HRE(hypoxiaresponseelement)-luciferase报告基因,然后与蛋白质激酶cDNA表达文库、蛋白质磷酸酶cDNA表达文库以及泛素连接酶cDNA表达文库共转染细胞。
通过比较在常氧、正常低氧、低氧和无氧的细胞培养条件下luciferase的表达差异来筛选能够诱导激活HRE的蛋白质激酶、蛋白质磷酸酶以及泛素连接酶。
③在细胞中瞬间过表达蛋白质激酶、蛋白质磷酸酶以及泛素连接酶cDNA表达文库,然后在常氧、正常低氧、低氧和无氧的条件下培养这些细胞。
然后利用乳糖产生的检测报导系统来比较细胞中乳糖产生量的不同来筛选出能够调节糖酵解的蛋白质激酶、蛋白质磷酸酶和泛素连接酶。
④在细胞中瞬间过表达蛋白质激酶、蛋白质磷酸酶以及泛素连接酶cDNA表达文库,然后在常氧、正常低氧、低氧和无氧的条件下培养这些细胞。
用葡萄糖荧光类似物2-NBDG(2-[N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino]-2-deoxy-glucose)来标记细胞。
比较2-NBDG被转运的不同来筛选能够调节糖酵解的蛋白质激酶、蛋白质磷酸酶和泛素连接酶。
(3)对参与低氧或缺氧环境中细胞能量代谢调控的蛋白质激酶、蛋白质磷酸酶和泛素连接酶的信号通路和分子机制的研究①通过RNAi技术,用这些候选基因的siRNA来敲低它们在细胞中的表达,在常氧、正常低氧、低氧和无氧的条件下培养这些细胞。
然后检测HRE-luciferase的表达、乳糖的产生或对2-NBDG转运的影响来进一步核实这些候选基因是否参与了在低氧或缺氧环境中对细胞能量代谢的调节。
如果数目太多,将会根据这些基因的具体情况分别挑选4-5个蛋白质激酶、蛋白质磷酸酶、泛素连接酶做进一步的生化功能研究。
②对于挑选的蛋白质激酶,寻找它们参与的信号转导路径、作用底物以及作用底物的磷酸化位点。
作用底物被磷酸化后对底物的亚细胞定位、酶活性等等功能的影响。
对于挑选的蛋白质磷酸酶,同样的要寻找它们作用的底物以及底物上被影响的磷酸化位点,这些位点对底物的亚细胞定位、酶活性等的影响。
对于挑选的泛素连接酶,通过Yeast-2-Hybrid,TAP-tag(
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- 糖脂 代谢 稳态 调控 分子 机制