基于ISSR标记的扁玉螺Neveritadidyma自然Word文档格式.docx

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用13个引物对90只个体进行了PCR扩增,共检测到161个位点,3个居群的多态位点比例为74.53%~

85109%,各居群遗传多样性水平的高低依次为YT>

QD>

DL。

扁玉螺在物种水平上的Nei’s基因多样性指数和Shannon’s信

息指数分别为0.3395和0.5113,在居群水平上分别为0.2811和0.4189,显示出扁玉螺有着较高的遗传多样性。

AMOVA分子变异分析表明,扁玉螺的遗传变异有27.16%发生在居群间,72.84%发生在居群内,居群内的遗传变异大于居群间的遗传变异。

扁玉螺3个居群间的遗传分化系数（Gst为0.1720,基因流（Nm为2.4063,Nei’s遗传距离平均值为0.1228,表明扁玉螺居群间虽然存在着一定程度的遗传分化,但仍属于种内正常分化的范畴。

上述结果为保护和利用扁玉螺资源提供了科学依据。

关键词:

扁玉螺;

遗传结构;

ISSR

文章编号:

100020933（20081125499207　中图分类号:

Q145　文献标识码:

A

GeneticstructureofnaturalpopulationofNeveritadidymabasedonISSRmarkers

SUNShi2Wei,SUNZhen2Xing3

GEYi2He,YANDong2Chun,HUANGQing2Rong

CollegeofLifeScience,LudongUniversity,Yantai264025,ChinaActaEcologicaSinica,2008,28（11:

5499~5505.

Abstract:

ThegeneticstructureandgeneticdiversityinthreenaturalpopulationsofNeveritadidymawereanalyzedbyusingthemolecularmarkertechniqueofintersimplesequencerepeat（ISSR.ThesamplesofthethreepopulationsweretakenfromtheoffshoresofDalian（DL,Yantai（YTandQingdao（QD,respectively.Atotalof161locifrom90individualswerepolymerase2chain2reaction（PCRamplifiedwith13primers.

Theproportionofpolymorphiclociinthethree

populationsrangedfrom74.53%to85.09%.TheabundanceofgeneticdiversityinthethreepopulationsarrangedinadecentorderwasYT>

DL.TheNei′sgenediversityandShannon′sinformationindexofNeveritadidymawas013395and0.5113atspecieslevel,0.2811and0.4189atpopulationlevel,respectively,showingthatthegeneticdiversityofNeveritadidymawasrelativelyhigh.Ananalysisofthemolecularvariance（AMOVAdemonstratedthattheamong2populationcomponentaccountedfor27.16%ofthetotalvariation,whilethewithin2populationcomponentaccountedfor72.84%.Thewithin2populationgeneticvariationwasapparentlylargerthantheamong2population.Thegeneticdifferentiationcoefficient（Gst,geneflow（NmandtheaverageNei′sgeneticdistancewere0.1720,2.4063and

011228,respectivelyamongthethreepopulations.TheresultsindicatethatalthoughthereisgeneticdifferentiationofsomeextentamongthethreepopulationsofNeveritadidyma,suchdifferentiationiswellcontainedinthecontextofnormaldifferentiationwithinthespecies.TheresultshavelaidthescientificbasisfortheconservationandutilizationoftheNeveritadidymaresources.

KeyWords:

Neveritadidyma;

geneticstructure;

ISSR

物种的遗传结构和遗传多样性是一个物种的重要特征,遗传结构的空间分布与物种的繁育机制以及自然选择效应密切相关,遗传多样性则反映一个物种适应环境的能力和对环境变迁持续进化的潜力[1]。

因此,研究物种的遗传多样性和遗传结构,对生物资源的合理开发利用和种质保护,有着重要的意义。

简单重复序列区间（intersimplesequencerepeat,ISSR是一种新型分子标记技术,它以模板DNA用量少、多态性丰富、稳定性好等特点[2],被广泛用于各种经济动植物的群体遗传学研究。

扁玉螺（NeveritadidymaRoding属于腹足纲、前鳃亚纲,分布于我国南北方沿海及朝鲜半岛、日本和东南亚海域,是一种中型食用贝类,其肉味鲜美、营养丰富,有一定的经济价值。

但近年来扁玉螺的资源量日趋减少,已成为贝类增养殖潜在的开发对象。

利用ISSR方法研究海洋经济动物,已有一些鱼类[3~6]和双壳贝类[7~8]等方面的报道,迄今国内外尚未见有关扁玉螺群体遗传学的研究报道。

本文以我国北方沿海的扁玉螺为对象,利用ISSR分子标记技术,探讨了扁玉螺不同地理居群的遗传结构和遗传多样性差异,以期为扁玉螺种质资源的保护和利用提供基础资料。

1　材料与方法

1.1　材料

实验材料分别采自辽宁大连、山东烟台及青岛近海的3个自然居群,扁玉螺活体运回实验室后,解剖取足肌,放入-74℃超低温冰箱中保存;

每个居群各随机取30个样品,共90个样品（表1。

表1　扁玉螺居群的地理位置及采样数目

Table1　LocationsofNeveritadidymapopulationsandthenumbersofindividualssampled

居群名称

Nameofpopulation样品采集地

Sampledarea

经度/纬度

Longitude/Latitude

取样个体数

No.ofindividuals

大连DL辽宁大连近海OffshoreofDalian,LiaoningE121°

38′/N38°

54′30

烟台YT山东烟台近海OffshoreofYantai,ShandongE121°

20′/N37°

33′30

青岛QD山东青岛近海OffshoreofQingdao,ShandongE120°

19′/N36°

04′30

1.2　基因组DNA提取

采用常规的蛋白酶K消化和酚2氯仿抽提法[9]提取基因组DNA,用0.7%琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度法检测DNA纯度,-20℃保存备用。

1.3　ISSR引物筛选和PCR扩增

ISSR引物是根据加拿大哥伦比亚大学公布的序列（http:

//www.biotech.ubc.ca/services/naps/primers,由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

PCR扩增在PE29600型PCR仪上进行。

反应总体积为25μl,经优化的反应体系包括10×

buffer,2.0mmol/L的Mg2+,0.25mmol/L的dNTP,0.8U的TaqDNA聚合酶,0.2μmol/L的ISSR引物,20ng模板DNA。

PCR反应程序为94℃预变性5min,94℃变性45s,52℃退火45s,72℃延伸90s,45个循环后,72℃延伸10min,4℃保存。

利用优化后的反应体系,从30个ISSR引物中筛选出了13个重复性好、特异性高的引物用于ISSR2PCR反应（表2。

0055　生　态　学　报　　　28卷　

表2　用于ISSR分析的13个引物序列

Table2　Sequencesof13primersusedinISSRanalysis

引物编号Primercode

引物序列（5′23′

Primersequence引物编号Primercode

PrimersequenceUBC811（GA8CUBC835（AG8YCUBC812（GA8AUBC836（AG8YAUBC813（CT8TUBC840（GA8YTUBC814（CT8AUBC856（AC8YAUBC815（CT8GUBC857（AC8YGUBC825（AC8TUBC873

（GACA4

UBC834

（AG8YT

1.4　扩增产物的电泳检测与条带记录

PCR扩增产物以200~2000bp的标准分子量（DNALadderⅣMarker,北京鼎国公司产作为参照,阴性

对照加入除模板DNA以外的其它各成分,用双蒸水代替模板DNA。

以1.2%的琼脂糖凝胶进行电泳检测（胶中含终浓度为1μg/ml的溴化乙锭,电泳后在凝胶成像系统下观察并拍照。

由同一引物扩增的电泳迁移率一致的条带作为同一位点,记录清晰稳定的电泳条带,按条带的有无分别记为“1”和“0”,构成ISSR表型数据矩阵。

1.5　数据分析

用POPGENE（VERSION1.32软件

[10]

对ISSR表型数据矩阵进行遗传参数分析,分别计算:

多态位点比

例（proportionofpolymorphicloci,PPB、观测等位基因数（observednumberofalleles,Na、有效等位基因数（effectivenumberofalleles,Ne、Nei’s基因多样性指数（Nei’sgenediversity,h、Shannon’s信息指数（Shannon’sinformationindex,I、居群间的遗传分化系数（coefficientofgeneticdifferentiation,Gst、基因流（geneflow,Nm、遗传相似度（geneticsimilarity,S和遗传距离（geneticdistance,D。

利用Shannon’s信息指数,按照Wachira等[11]

的公式,分别计算基于各引物扩增位点在居群（Hpop和物

种水平的遗传多态度（Hsp,并根据Hpop/Hsp和（Hsp-Hpop/Hsp分别计算居群内和居群间遗传变异所占

的比例:

Ho=-

1

N

∑XilnXi

式中,Ho为各居群的遗传多态度,Xi为位点i在某一居群中出现的频率,N为在该居群中检测到的位点总数。

Hpop=

n

∑Ho式中,Hpop为居群内遗传多态度,n为所研究的居群数。

Hsp=-

∑XlnX

式中,Hsp为居群总的遗传多态度,X为n个居群的综合表型频率。

以DCFA（VERSION1.1软件计算Euclidean距离平方[12]

利用WINAMOVA（VERSION1.55软件对居

群间和居群内的遗传变异进行分子变异分析（analysisofmolecularvariance,AMOVA[13]

。

2　结果

2.1　扁玉螺居群的遗传多样性

13个ISSR引物对扁玉螺3个居群的90只个体共扩增出161个位点,平均每个引物记录12.4个位点,扩

增产物的分子量大多在200~1600bp之间（图1。

3个居群的多态位点比例、观测等位基因数、有效等位基因数、Nei’s基因多样性指数和Shannon’s信息指数如表3所示。

从表3可以看出,烟台居群的多态位点比例最高、为85.09%,虽然大连居群和青岛居群的多态位点比例相同,但根据Nei’s基因多样性指数（h和

055　11期　　　孙始威　等:

基于ISSR标记的扁玉螺（Neveritadidyma自然居群遗传结构

Shannon’s信息指数（I来看,二者的大小趋势相同,即各居群遗传多样性水平的高低依次为YT>

表3　扁玉螺3个居群的遗传多样性

Table3　ThegeneticdiversitywithinthreepopulationsofNeveritadidyma

Populationname

多态位点数

Numberof

polymorphicloci

多态位点比例

PPB（%

观测等位基因数

Na

有效等位基因数

Ne

Nei′s基因

多样性指数

h

Shannon′s

信息指数I

大连DL12074.531.7453±

0.43701.4280±

0.35530.2546±

0.18590.3836±

0.2619烟台YT13785.091.8509±

0.35731.5434±

0.34960.3134±

0.17500.4642±

0.2393青岛QD

120

74.53

1.7453±

0.4370

1.4734±

0.3648

0.2753±

0.1900

0.4088±

0.2673

　　3PPB:

Proportionofpolymorphicloci;

Na:

Observednumberofalleles;

Ne:

Effectivenumberofalleles;

h:

Nei’sgenediversity;

I:

Shannon’s

informationindex

图1　引物UBC835对DL、QD和YT居群扩增的电泳图谱　Fig.1　ElectrophoretogramofPCRproductfrompopulationDL,YT

andQDbyprimerUBC835

Nei’s基因多样性指数（h和Shannon’s信息指

数（I在居群水平上分别为0.2811和0.4189,在物种水平上分别为0.3395和0.5113,显示出扁玉螺居群拥有较高的遗传多样性水平,物种水平的遗传多样性高于居群水平。

从Shannon’s信息指数（I在扁玉螺居群中的分布情况看,物种水平的遗传多态度（Hsp为0.3130,居群水平的遗传多态度（Hpop为0.2457;

扁玉螺的遗传变异有78.73%存在于居群内,21.27%的变异存在于居群间（表4。

2.2　扁玉螺居群的遗传结构

2.2.1　居群间的遗传距离和遗传相似度

遗传距离（D和遗传相似度（S是衡量居群间遗传变异程度的重要参数,S值越大,表明亲缘关系越近,遗传变异越小;

而D值越大,则表明亲缘关系越远,遗传变异越大。

根据Nei的公式

[14]

计算居群间的

无偏遗传距离和遗传相似度的结果如表5,可见遗传距离与遗传相似度所得结果是一致的,即在扁玉螺3个居群中,DL与YT之间的亲缘关系较近,DL与QD之间的亲缘关系较远。

2.2.2　居群间的遗传分化

利用AMOVA的等级剖分法得出的居群间和居群内对总遗传变异的贡献率表明,扁玉螺27.16%的变异发生在居群间,72.84%的变异发生在居群内（表6,显著性检验显示扁玉螺居群间和居群内均有极显著的遗传分化（Φst=0.2720,P<

0.001。

居群间遗传分化系数（Gst为0.1720,由Gst估算的基因流（Nm为2.4063。

3　讨论

3.1　关于扁玉螺的遗传多样性

遗传多样性可评价物种对环境的适应能力以及进化潜力,多态位点比例则是这种评价的量化参数之一。

本文中扁玉螺的多态位点比例为74.53%~85.09%,与用ISSR方法得出的其它海洋动物多态位点比例相比,

扁玉螺自然居群的遗传多样性水平较高。

如小黄鱼（Pseudosciaenapolyactis为65.63%[3]

牙鲆（Paralichthys

olivaceus为27.45%~33.92%

[4]

刀鲚（Coiliaectenes为57158%~68.18%[5]

斜带髭鲷（Hapalogenysnitens

2055　生　态　学　报　　　28卷　

表4　扁玉螺3个居群内和居群间Shannon’s信息指数的分布

Table4　PartitionoftheShannon’sindexwithinandamong3populationsofNeveritadidyma

引物

Primers各居群的遗传多态度Ho

Shannon′sindexof3populations

DL

YTQD居群内遗

传多态度

Hpop

居群总的遗传多态度

Hsp

居群内遗传多态度比例

Hpop/Hsp居群间遗传多态度比例（Hsp2Hpop/Hsp

UBC8110.22680.19840.20250.20920.32380.64630.3537UBC8120.30700.26830.20430.25990.29740.87390.1261UBC8130.26060.30680.24300.27010.31980.84470.1553UBC8140.19530.27740.33750.27010.32060.84230.1577UBC8150.30750.30610.22290.27880.28930.96360.0364UBC8250.24040.29100.22700.25280.31830.79430.2057UBC8340.21870.26280.24580.24240.32330.74980.2502UBC8350.18130.28460.14740.20440.28630.71390.2861UBC8360.24330.20960.24890.23400.32220.72620.2738UBC8400.21100.26880.25560.24510.32120.76320.2368UBC8560.24030.26110.19750.23300.32260.72210.2779UBC8570.25700.25750.31390.27610.29870.92450.0755UBC873

0.21710.24320.19440.21830.32590.66970.3303平均Mean

0.2389

0.2643

0.2339

0.2457

0.3130

0.7873

0.2127

　　3Hpop:

Geneticdiversitywithinpopulations;

Hsp:

Totalgeneticdiversity;

Hpop/Hsp:

Ratioofgeneticdiversitywithinpopulations;

（Hsp2Hpop/Hsp:

Ratioofgeneticdiversityamongpopulations

　　表5　扁玉螺3个居群间的遗传距离和遗传相似度

　　Table

5　Geneticdistancesandgeneticidentitiesindexamong3

populationsofNeveritadidyma

居群名称Populationname

大连DL

烟台YT

青岛QD

大连DL2

0.8987

0.8683烟台YT0.10692

0.8867

0.1412

0.1203

2

　　　　3对角线右上方为遗传相似度,左下方为遗传距离　Genetic

identity（abovediagonalandgeneticdistance（belowdiagonal

为44.83%~51.72%[6]

文蛤（Me