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层析法与光学、电学或电化学仪器连用,可检测出层析后各组份得浓度或质量,同时绘出层析图。
层析仪与电子计算机联用,可使操作及数据处理自动化,大大缩短分析时间。
由于层析法具有分辨率高、灵敏度高、选择性好、速度快等特点,因此适用于杂质多、含量少得复杂样品分析,尤其适用于生物样品得分离分析。
近年来,已成为生物化学及分子生物学常用得分析方法。
在医药卫生、环境化学、高分子材料、石油化工等方面也得到了广泛得应用。
表16-6 按层析原理分类
名称
分离原理
吸附层析法
组份在吸附剂表面吸附固定相就是固体吸附剂,各能力不同
分配层析法
各组份在流动相与静止液相(固相)中得分配系数不同
离子交换层析法
固定相就是离子交换剂,各组份与离子交换剂亲与力不同
凝胶层析法
固定相就是多孔凝胶,各组份得分子大小不同,因而在凝胶上受阻滞得程度不同
亲与层析法
固定相只能与一种待分离组份专一结合,以此与无亲与力得其它组份分离
表16-7按操作形式不同分类
操作形式
柱层析法
固定相装于柱内,使样品沿着一个方向前移而达分离
薄层层析法
将适当粘度得固定相均匀涂铺在薄板上,点样后用流动相展开,使各组份分离
纸层析法
用滤纸作液体得载体,点样后用流动相展开,使各组份分离
薄膜层析法
将适当得高分子有机吸附剂制成薄膜,以类似纸层析方法进行物质得分离
二、层析法实验技术
(一)凝胶层析法
凝胶层析又称分子筛过滤、排阻层析等。
它得突出优点就是层析所用得凝胶属于惰性载体,不带电荷,吸附力弱,操作条件比较温与,可在相当广得温度范围下进行,不需要有机溶剂,并且对分离成分理化性质得保持有独到之处。
对于高分子物质有很好得分离效果。
⒈凝胶得选择根据实验目得不同选择不同型号得凝胶。
如果实验目得就是将样品中得大分子物质与小分子物质分开,由于它们在分配系数上有显著差异,这种分离又称组别分离,一般可选用SephadexG-25与G-50,对于小肽与低分子量得物质(1000-5000)得脱盐可使用SephadexG-10,G-15及Bio-Gel-p-2或4。
如果实验目得就是将样品中一些分子量比较近似得物质进行分离,这种分离又叫分级分离。
一般选用排阻限度略大于样品中最高分子量物质得凝胶,层析过程中这些物质都能不同程度地深入到凝胶内部,由于Kd不同,最后得到分离。
⒉柱得直径与长度根据经验,组别分离时,大多采用2-30cm长得层析柱,分级分离时,一般需要100cm左右长得层析柱,其直径在1-5cm范围内,小于1cm产生管壁效应,大于5cm则稀释现象严重。
长度L与直径D得比值L/D一般宜在7-10之间,但对移动慢得物质宜在30-40之间。
⒊凝胶柱得制备凝胶型号选定后,将干胶颗粒悬浮于5-10倍量得蒸馏水或洗脱液中充分溶胀,溶胀之后将极细得小颗粒倾泻出去。
自然溶胀费时较长,加热可使溶胀加速,即在沸水浴中将湿凝胶浆逐渐升温至近沸,1-2小时即可达到凝胶得充分胀溶。
加热法既可节省时间又可消毒。
凝胶得装填:
将层析柱与地面垂直固定在架子上,下端流出口用夹子夹紧,柱顶可安装一个带有搅拌装置得较大容器,柱内充满洗脱液,将凝胶调成较稀薄得浆头液盛于柱顶得容器中,然后在微微地搅拌下使凝胶下沉于柱内,这样凝胶粒水平上升,直到所需高度为止,拆除柱顶装置,用相应得滤纸片轻轻盖在凝胶床表面。
稍放置一段时间,再开始流动平衡,流速应低于层析时所需得流速。
在平衡过程中逐渐增加到层析得流速,千万不能超过最终流速。
平衡凝胶床过夜,使用前要检查层析床就是否均匀,有无“纹路”或气泡,或加一些有色物质来观察色带得移动,如带狭窄、均匀平整说明层析柱得性能良好,色带出现歪曲、散乱、变宽时必须重新装柱。
⒋加样与洗脱凝胶床经过平衡后,在床顶部留下数亳升洗脱液使凝胶床饱与,再用滴管加入样品。
一般样品体积不大于凝胶总床体积得5%-10%。
样品浓度与分配系数无关,故样品浓度可以提高,但分子量较大得物质,溶液得粘度将随浓度增加而增大,使分子运动受限,故样品与洗脱液得相对粘度不得超过1、5-2。
样品加入后打开流出口,使样品渗入凝胶床内,当样品液面恰与凝胶床表面相平时,再加入数毫升洗脱液中洗管壁,使其全部进入凝胶床后,将层析床与洗脱液贮瓶及收集器相连,预先设计好流速,然后分部收集洗脱液,并对每一馏份做定性、定量测定。
⒌凝胶柱得重复使用、凝胶回收与保存一次装柱后可以反复使用,不必特殊处理,并不影响分离效果。
为了防止凝胶染菌,可在一次层析后加入0、02%得叠氮钠,在下次层析前应将抑菌剂除去,以免干扰洗脱液得测定。
如果不再使用可将其回收,一般方法就是将凝胶用水冲洗干净滤干,依次用70%、90%、95%乙醇脱水平衡至乙醇浓度达90%以上,滤干,再用乙醚洗去乙醇、滤干、干燥保存。
湿态保存方法就是凝胶浆中加入抑菌剂或水冲洗到中性,密封后高压灭菌保存。
⒍凝胶层析得应用
⑴脱盐:
高分子(如蛋白质、核酸、多糖等)溶液中得低分子量杂质,可以用凝胶层析法除去,这一操作称为脱盐。
本法脱盐操作简便、快速、蛋白质与酶类等在脱盐过程中不易变性。
适用得凝胶为SephadexG-10、15、25或Bio-Gel-p-2、4、6。
柱长与直径之比为5-15,样品体积可达柱床体积得25%-30%,为了防止蛋白质脱盐后溶解度降低会形成沉淀吸附于柱上,一般用醋酸铵等挥发性盐类缓冲液使层析柱平衡,然后加入样品,再用同样缓冲液洗脱,收集得洗脱液用冷冻干燥法除去挥发性盐类。
⑵用于分离提纯:
凝胶层析法已广泛用于酶、蛋白质、氨基酸、多糖、激素、生物碱等物质得分离提纯。
凝胶对热原有较强得吸附力,可用来去除无离子水中得致热原制备注射用水。
⑶测定高分子物质得分子量:
用一系列已知分子量得标准品放入同一凝胶柱内,在同一条件下层析,记录每一分钟成分得洗脱体积,并以洗脱体积对分子量得对数作图,在一定分子量范围内可得一直线,即分子量得标准曲线。
测定未知物质得分子量时,可将此样品加在测定了标准曲线得凝胶柱内洗肿后,根据物质得洗脱体积,在标准曲线上查出它得分子量。
⑷高分子溶液得浓缩:
通常将SephadexG-25或50干胶投入到稀得高分子溶液中,这时水分与低分子量得物质就会进入凝胶粒子内部得孔隙中,而高分子物质则排阻在凝胶颗粒之外,再经离心或过滤,将溶胀得凝胶分离出去,就得到了浓缩得高分子溶液。
(二)离子交换层析法
离子交换层析法就是以具有离子交换性能得物质作固定相,利用它与流动相中得离子能进行可逆得交换性质来分离离子型化合物得一种方法。
⒈离子交换剂预处理与装柱对于离子交换纤维素要用流水洗去少量碎得不易沉淀得颗粒,以保证有较好得均匀度,对于已溶胀好得产品则不必经这一步骤。
溶胀得交换剂使用前要用稀酸或稀碱处理,使之成为带H+或OH-得交换剂型。
阴离子交换剂常用“碱-酸-碱”处理,使最终转为-OH-型或盐型交换剂;
对于阳离子交换剂则用“酸-碱-酸”处理,使最终转为-H-型交换剂。
洗涤好得纤维素使用前必须平衡至所需得pH与离子强度。
已平衡得交换剂在装柱前还要减压除气泡。
为了避免颗粒大小不等得交换剂在自然沉降时分层,要适当加压装柱,同时使柱床压紧,减少死体积,有利于分辨率得提高。
柱子装好后再用起始缓冲液淋洗,直至达到充分平衡方可使用。
⒉加样与洗脱加样:
层析所用得样品应与起始缓冲液有相同得pH与离子强度,所选定得pH值应落在交换剂与被结合物有相反电荷得范围,同时要注意离子强度应低,可用透析、凝胶过滤或稀释法达此目得。
样品中得不溶物应在透析后或凝胶过滤前,以离心法除去。
为了达到满意得分离效果,上样量要适当,不要超过柱得负荷能力。
柱得负荷能力可用交换容量来推算,通常上样量为交换剂交换总量得1%-5%。
洗脱:
已结合样品得离子交换前,可通过改变溶液得pH或改变离子强度得方法将结合物洗脱,也可同时改变pH与离子强度。
为了使复杂得组份分离完全,往往需要逐步改变pH或离子强度,其中最简单得方法就是阶段洗脱法,即分次将不同pH与离子强度得溶液加入,使不同成分逐步洗脱。
由于这种洗脱pH与离子强度得变化大,使许多洗脱体积相近得成分同时洗脱,纯度较差,不适宜精细得分离。
最好得洗脱方法就是连续梯度洗脱,洗脱装置见图16-6。
两个容器放于同一水平上,第一个容器盛有一定pH得缓冲液,第二个容器含有高盐浓度或不同pH得缓冲液,两容器连通,第一个容器与柱相连,当溶液由第一容器流入柱时,第二容器中得溶液就会自动来补充,经搅拌与第一容器得溶液相混合,这样流入柱中得缓冲液得洗脱能力即成梯度变化。
第一容器中任何时间得浓度都可用下式进行计算:
C=C2-(C2-C1)(1-V)A2/A1
式中A1、A2分别代表两容器得截面积:
C1、C2分别表示容器中溶液得浓度;
V为流出体积对总体积之比。
当A1=A2时为线性梯度,当A1>
A2时为凹形梯度,A1>
A2时为凸形梯度。
洗脱时应满足以下要求:
①洗脱液体积应足够大,一般要几十倍于床体积,从而使分离得各峰不致于太拥挤。
②梯度得上限要足够高,使紧密吸附得物质能被洗脱下来。
③梯度不要上升太快,要恰好使移动得区带在快到柱末端时达到解吸状态。
目得物得过早解吸,会引起区带扩散;
而目得物得过晚解吸会使峰形过宽。
图16-6 梯度洗脱示意图
⒊洗脱馏份得分析按一定体积(5-10ml/管)收集得洗脱液可逐管进行测定,得到层析图谱。
依实验目得得不同,可采用适宜得检测方法(生物活性测定、免疫学测定等)确定图谱中目得物得位置,并回收目得物。
⒋离子交换剂得再生与保存离子交换剂可在柱上再生。
如离子交换纤维素可用2mol/:
NaCl淋洗柱,若有强吸附物则可用0、1mol/lNaOH洗柱;
若有脂溶性物质则可用非离子型去污剂洗柱后再生,也可用乙醇洗涤,其顺序为:
0、5mol/lNaOH-水-乙醇-水-20%NaOH-水。
保存离子交换剂时要加防腐剂。
对阴离子交换剂宜用0、002%氯已定(洗必泰),阳离子交换剂可用乙基硫柳汞(0、005%)。
有些产品建立用0、02%叠氮钠。
⒌离子交换层析得应用离子交换层析技术已广泛用于各学科领域。
在生物化学及临床生化检验中主要用于分离氨基酸、多肽及蛋白质,也可用于分离核酸、核苷酸及其它带电荷得生物分子。
(三)高效液相层析法
高效液相层析法(HPLC)就是近二十年来发展起来得一项新颖快速得分离技术。
它就是在经典液相层析法基础上,引进了气相层析得理论具有气相层析得全部优点。
由于HPLC分离能力强、测定灵敏度高,可在室温下进行,应用范围极广,无论就是极性还就是非极性,小分子还就是大分子,热稳定还就是不稳定得化合物均可用此法测定。
对蛋白质、核酸、氨基酸、生物碱、类固醇与类脂等尤为有利。
高效液相层析法得基本概念与分离理论与经典得液相色谱法及气相色谱法一致,因而其塔板理论及动力学理论等都可用于高效液相层析。
⒈高效液相层析仪典型得高效液相层析仪包括输液系统、层析柱与检测系统三部分。
流动相用一高压泵输入。
这种高压泵应满足以下条件:
①流量恒定,无脉动,并有较大得调节范围。
②能抗溶剂腐蚀。
③有较高得输出压力,一般要达到15~300kg/c,也有得高达800kg/c。
④泵得死体积要小。
梯度洗脱装置必须具备两台高压泵,一台输送强溶剂,一台输送弱溶剂,两泵运转速度用电脑控制,并可按一定得要求改变流动相得组成,以改善分离效果。
一般用微量注射器直接进样,也可采用六通阀门进样。
HPLC中所用得检测器最多应用得就是紫外吸收检测,灵敏度可达ng水平。
此外,还有荧光检测器、示差析光检测器、电化学检测器等。
⒉HPLC得类型与应用
⑴液-固吸附层析:
固定相就是具有吸附活性得吸附剂,常用得有硅胶、氧化铝、高分子有机酸或聚酰胺凝胶等。
液-固吸附层析中得流动相依其所起得作用不同,分为“底剂”与洗脱剂两类,底剂起决定基本色谱得分离作用,洗脱剂起调节试样组份得滞留时间长短,并对试样中某几个组份具有选择性作用。
流动相中底剂与洗脱剂成分得组合与选择,直接影响色谱得分离情况,一般底剂为极性较低得溶剂,如正已烷、环已烷、戊烷、石油醚等,洗脱剂则根据试样性质选用针对性溶剂,如醚、酯、酮、醇与酸等。
本法可用于分离异构体、抗氧化剂与维生素等。
⑵液-液分配层析:
固定相为单体固定液构成。
将固定液得官能团结合在薄壳或多孔型硅胶上,经酸洗、中与、干燥活化、使表面保持一定得硅羟基。
这种以化学键合相为固定相得液-液层析称为化学键合相层析。
另一种利用离子对原理得液-液分配层析为离子对层析。
化学键合层析分:
①极性键合相层析:
固定相为极性基团,氰基、氨基及双羟基三种。
流动相为非极性或极性较小得溶剂。
极性小得组份先出峰,极性大得后出峰,这称为正相层析法,适用于分离极性化合物。
②非极性键合相层析:
固定相为非极性基团,如十八烷基(C18)、辛烷基(C8)、甲基与苯基等,流动相用强极性溶剂,如水、醇、乙腈或无机盐缓冲液。
最常用得就是不同比例得水与甲醇配制得混合溶剂,水不仅起洗脱作用还可掩盖载体表面得硅羟基,防止因吸附而至得拖尾现象。
极性大得组份先出峰,极性小得组份后出峰,恰好与正相法相反,故称反相层析。
本法适用于小分子物质得分离,如肽、核苷酸、糖类、氨基酸得衍生物等。
离子对分配层析分:
①正相离子对层析:
此法常以水吸附在硅胶上作为固定相,把与分离组份带相反电荷得配对离子以一定浓度溶于水或缓冲液涂渍在硅胶上。
流动相为极性较低得有机溶剂。
在层析过程中,待分离得离子与水相中配对离子形成中性离子对,在水相与有机相中进行分配,而达到分离。
本法优点就是流动相选择余地大,缺点就是固定相易流失。
②反向离子对层析:
固定相就是疏水性键合硅胶,如C18键合相,待分离离子与带相反电荷得配对离子同时存在于强极性得流动相中,生成得中性离子对在流动相与键合相之间进行分配,而得到分离。
本法优点就是固定相不存在流失问题、流动相含水或缓冲液更适用于电离性化合物得分离。
⑶离子交换层析:
原理与普通离子交换相同。
在离子交换HPLC中,固定相多用离子性键合相,故本法又称离子性键合相层析。
流动相主要就是水溶液,pH值最好在被分离酸、碱得pK值附近。
(四)亲与层析法
亲与层析就是利用待分离物质与它得特异性配体间具有特异得亲与力,从而达到分离目得得一类特殊层析技术。
具有专一亲与力得生物分子对主要有:
抗原与抗体、DNA与互补DNA或RNA、酶与它得底物或竞争性抑制剂、激素(或药物)与它们得受体、维生素与它得特异结合蛋白、糖蛋白与它相应得植物凝集素等。
可亲与得一对分子中得一方以共价键形式与不溶性载体相连作为固定相吸附剂,当含有混合组份得样品通过此固定相时,只有与固定相分子有特异亲与力得物质,才能被固定相吸附结合,其它没有亲与力得无关组份就随流动相流出,然后改变流动组成份,将结合得亲与物洗脱下来。
亲与层析中所用得载体称为基质,与基质共价连接得化合物称配基。
亲与层析纯化过程简单、迅速,且分离效率高。
对分离含量极少又不稳定得活性物质尤为有效。
但本法必须针对某一分离对象,制备专一得配基与寻求层析得稳定条件,因此亲与层析得应用范围受到了一定得限制。
亲与层析可用于纯化生物大分子:
稀溶液得浓缩;
不稳定蛋白质得贮藏;
从纯化得分子中除去残余得污染物;
用免疫吸附剂吸附纯化对此尚无互补配体得生物大分子;
分离核酸就是亲与层析应用得一个重要方面。
应用实例:
2-胰凝乳蛋白酶得提纯
⒈亲与吸附剂(Σ-氨基-N-乙酰-D-色氨酸)得制备取一定体积得Sepharose4B加100mgCNBr。
搅拌混合物,滴加2-8mol/lNaOH,使溶液pH维持在11、0。
20℃左右,8-12分钟完成反应。
在布氏漏斗中抽滤活化得琼脂糖,然后用20倍体积冷得0、1mol/lNaHCO3(pH9、0)溶液洗涤。
将上述活化得Sepharose4B与等体积0、1mol/lNaHCO3(pH9、0并在冰箱中预冷)溶液混合,接着迅速加入α-胰蛋白酶抑制剂(Σ-氨基-N-乙酰-色氨酸甲酯)。
抑制剂得最大用量为每毫升Sepharose4B65μmol/L。
4℃缓慢搅拌约24小时,而后再用水与缓冲液反复地洗至没有游离得抑制剂为止。
制得得亲与吸附剂在50mmol/lTris-HCl缓冲液(pH8、0)中保存备用。
⒉分离亲与吸附剂装柱后用50mmol/L Tris-HCl(pH8、0)缓冲液平衡(室温)。
样品溶于同样缓冲液中并上柱,再应用同样缓冲液淋洗柱子。
流速为30-60ml/小时,直至280nm无光吸收时停止洗涤,然后改用0、2mol/L醋酸缓冲液(pH3、0)洗脱。
(五)聚焦层析法
聚焦层析就是一种操作简单、廉价得层析技术。
它得原理就是根据各种蛋白质得等电点不同进行分离得过程,因此本方法具有高分辨、高度浓缩与高度专一等特点。
聚焦层析所用得凝胶首先用高pH溶液平衡,然后用多元缓冲液进行洗脱,多元缓冲液pH呈梯度下降。
聚焦层析所用凝胶主要有两种:
MONOP与多元缓冲液交换剂(PBE)。
其中MONOP就是带孔小珠,孔中被带正电荷得胺基填充,适用于高效聚焦层析。
多元缓冲液交换剂就是一种交换凝胶,适用作普通聚焦层析得介质。
各种凝胶性质见表16-8。
表16-8聚焦层析技术数据
凝胶名称
pH范围
洗脱
MONOP
11-8
Pharmalyte8-10、5
PBE
Pharmalyte8-10、5
MONOP
9-6
多元缓冲液96
PBE94
7-4
多元缓冲液74
PBE94
7-4
多元缓冲液74
NONOP可制成两种高效液相柱:
MONOpHR5/5(1ml),与MONOpHR5/20(5ml)。
使用时根据样品复杂性选择相应得柱。
HR5/5分辨率为pI>0、2,HR5/20pI>
0、02。
多元缓冲液交换剂PBE,属珠状交换剂凝胶,有PBe118(pH11-8)与PBE(pH9-4)。
在聚焦层析时,通过使用不同得洗脱液,可使交换容量发生改变,并且使pH达到更广得范围。
聚焦层析原理可以从PH梯度溶液得形成、蛋白质得行为与聚焦效应三方面来阐述。
ﻫ 1、PH梯度溶液得形成
在离子交换层析中,PH梯度溶液得形成就是靠梯度混合仪实现得。
例如,当使用阴离子剂进行层析时,制备PH由高到低呈线性变化得梯度溶液得方法就是,在梯度仪得混合室(这层析柱者)中装高PH溶液,而在另一室装低PH极限溶液,然后打开层析柱得下端出口,让洗脱液连续不断地流过柱体。
这时从柱得上部到下部溶液得PH值就是由高到低变化得。
而在聚焦层析中,当洗脱液流进多缓冲交换剂时,由于交换剂带具有缓冲能力得电荷基团,故PH梯度溶液可以自动形成。
例如,当柱中装阴离子交换剂PBE94(作固定相)时,先用起始缓冲液(配方见表了一2)平衡到PHg,再用含PH6得多缓冲剂物质(作流动相)得淋洗液通过柱体,这时多缓冲剂中酸性最强得组分与碱性阴离子交换对结合发生中与作用。
随着淋洗液得不断加人,住内每点得PH值从高到低逐渐下降。
照此处理J段时间,从层析柱顶部到底部就形成了PH6~9得梯度。
聚焦层析柱中得PH梯度溶液就是在淋洗过程中自动形成得,但就是随着淋洗得进行,PH梯度会逐渐向下迁移,从底部流出液得PH却由9逐渐降至6,并最后恒定于此值,这时层析柱得PH梯度也就消失了。
2.蛋白质得行为
蛋白质所带电荷取决于它得等电点(PI)与层析柱中得PH值。
当柱中得PH低于蛋白质得PI时,蛋白质带正电荷,且不与阴离于交换剂结合。
而随着洗脱剂向前移动,固定相中得PH值就是随着淋洗时间延长而变化得。
当蛋白质移动至环境PH高于其PI时,蛋白质由带正电行变为带负电荷,并与阴离子交换剂结合。
由于洗脱剂得通过,蛋白质周围得环境PH 再次低于PI时,它又带正电荷,并从交换剂解吸下来。
随着洗脱液向柱底得迁移,上述过程将反复进行,于就是各种蛋白质就在各自得等电点被洗下来,从而达到了分离得目得。
不同蛋白质具有不同得等电点,它们在被离子交换剂结合以前,移动之距离就是不同得,洗脱出来得先后次序就是按等电点排列得
离子交换层析法(Ionexchange chromatography)
这个部份,我们分成四个项目说明离子交换层析法。
1.1、
基本原理:
包括离子交换法得原理与步骤。
2.2、
树脂材质:
介绍常用得阴阳离子交换树脂成份。
3.3、
离子交换剂得选择:
如何选用适当得阴(阳)离子交换剂与缓冲液。
4.4、
离子交换树脂得前处理:
使用树脂前得注意事项与处理方法。
一、基本原理
离子交换层析法 (ionexchangechromatography,简称IEC)就是从复杂得混合物中,分离性质相似大分子得方法之一,依据得原理就是物质得酸碱性、极性,也就就是所带阴阳离子得不同。
电荷不同得物质,对管柱上得离子交换剂有不同得亲与力,改变冲洗液得离子强度与pH值,物质就能依次从层析柱中分离出来。
离子交换层析法大致分为5个步骤:
1.1、
离子扩散到树脂表面。
离子通过树脂扩散到交换位置。
3.3、
在交换位置进行离子交换;
被交换得分子所带电荷愈多,它与树脂得结合愈紧密,也就愈不容易被其它离子取代。
4.4、
被交换得离子扩散到树脂表面。
5.5、
冲洗液通过,被交换得离子扩散到外部溶液中。
离子交换树脂得交换反应就是可逆得,遵循化学平衡得规律,定量得混合物通过管柱时,离子不断被交换,浓度逐渐降低,几乎全部都能被吸附在树脂上;
在冲洗得过程中,由于连续添加新得交换溶液,所以会朝正反应方向移动,因而可以把树脂上得离子冲洗下来。
如果被纯化得物质就是氨基酸类得分子,则分子上得净电荷取决于氨基酸得等电点与溶液得pH值,所以当溶液得pH 值较低,氨基酸分子带正电荷,它将结合到强酸性得阳离子交换树脂上;
随着通过得缓冲液pH逐渐增加,氨基酸将逐渐失去正电荷,结合力减弱,最后被洗下来。
由于不同得氨基酸等电点不同,这些氨基酸将依次被洗出,最先被洗出得就是酸性氨基酸,如aparticacid与glutamicacid(在约pH3~4时),随后就是中性氨基酸,如glycine与alanine。
碱性氨
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