MS蛋白质序列分析方法概述.docx
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MS蛋白质序列分析方法概述
MS蛋白質序列分析方法概述
、
質譜儀(MS)如何運作
、
MALDI-TOFMS
三、
MALDI的優缺點
四、
ESItandemMS
五、
TandemMassAnalyzers
六、
Ion-TrapMassAnalyzers
質譜儀(MS)如何運作
目前有兩種設備用於蛋白質體學的質譜儀(MS)實驗,一種是MALDI-TOFMS(matrix-assistedlaserdesorptioninoization-timeofflightmassspectrometry),一種是ESI-tandemMS(electrosprayionization-tandemmassspectrometry),前者可獲得peptide質量的資訊,後者可獲得peptide片段詳細的資料。
雖然兩種操作的方式截然不同,但得到的結
果都具有高度準確性,專門研究蛋白質體學的實驗室,會將兩種皆列爲必要的設備。
MS本身有三個主要部份,如下圖所示:
sample
m/z
第一個部份是來源(source),由樣品產生離子;第二個部份是質析(massanalyzer),依離
子質量/價數【mass/charge(m/z)】的比例分開它們;第三個部份是偵測(detector),也就是massanalyzer的結果。
簡單說來,質譜儀就是將一群混合物轉爲離子,再依照m/z分析它們,
得到的結果由儀器自動記錄下來,交給電腦分析。
怎樣的MS適合?
有三個重點,第一是敏感度(sensitivity),多數的蛋白質體研究中,所能
得到的蛋白質量都有限,所以儀器最好能敏感到能偵測10-15莫耳的peptide;第二是解析能
力(resolution),從極小的m/z值分辨不同離子,最好能區別m/z值差別在0.001amu以下
的樣品,限於經費,這樣的儀器其實不普遍,常用的大概在1Da(一個氫原子的質量)左
右;第三是精密度(massaccuracy),測得的peptide離子或片段愈接近真實狀況愈好。
二、MALDI-TOFMS
MALDI(matrix-assistedlaserdesorptioninoization)代表來源(source),也就是離子化的部
份,TOF是timeofflight的縮寫,代表質析(massanalyzer),整個運作方式如下:
A:
將待測物peptides與一些化學物質(圖中的matrix)混合,matrix中的微小分子,會吸收特殊波長的光,成份包括2,5-dihydroxybenzoicacid、3,5-dimethoxy-4-hydroxycinnamicacid
(sinapinicacid),以及a-cyano-4-hydroxycinnamicacid。
混合物置於小玻片上,讓水份或其它溶劑揮發到空氣中,造成樣品內部晶格(crystallattice)的形成,再把樣品放到source的
部份,source這兒提供雷射光,matrix的化學物質吸收光子而激發電子,釋放的能量轉到樣品中的peptide上,離開matrix表面進入空氣中。
這樣的離子化過程,依樣品的性質,產生正離子或負離子,在蛋白質體學的研究中,通常正離子是我們所感興趣的部份,正離子的產
生是在脫離matrix的過程中,接受了質子所致。
每一個peptide分子會接受單一的質子,因
此,大部份的peptide離子都會帶一個正電,比如一個質量1032的peptide接受了一個質子
後,變成【M+H】+的狀態,m/z質成爲1033。
在MALDI形成這樣的離子後,再送入TOFmassanalyzer分析。
B:
TOF(timeofflight)正如其名,能測得離子由analyzer一端到另一端(detector)的時間,m/z值愈大,時間愈短。
MS的優劣是在於能區別離子間微小m/z的差異,但是這種測量直
線行進速度的TOF解析力不夠高(以人的眼睛狀況比喻,解析力差的MS就像近視),造成
直線型TOF低解析力的原因,在於相同m/z值的離子,直線行進速度也有快慢之別。
C:
改良式的TOF,以反射取代直線法。
它能使離子經反射而聚焦,擁有相同m/z值的離子
便會在同時抵達偵測器。
下面以分析胰島素的例子,說明反射式與直線式的MALDI-TOF得到的結果:
1213
A:
反射型的TOF,輕易區分出peptide中的C和帶有放射性的C。
B:
直線型的TOF,只能測出peptide的平均m/z值。
另一種改善直線型TOF缺點的方法是,使用間歇性雷射光讓樣品離子化,如此一來會延遲它們進入TOF的時間,使所有離子的起跑點一致,相同m/z值的就會在相同時間到達偵測
器了。
改良後的MALDI-TOF能區別m/z值只差0.001amu的樣品。
在分析的時候,調整反射處(reflectron)的電壓,使peptideion的加速度和電離(ionization)過程適時緩和下來,穿越TOF的時間不會太快也不會太慢,這種方法稱爲PSD(post-source
decay),雖然PSD不是分析peptide序列最好方法,但是它可以測得完整的質量,尤其是H2N+=CHR的R(氨基酸支鍊sidechain)部份。
三、MALDI的優缺點
世上並沒有完美的MS機種,但是MALDI-TOFMS有四大優勢:
第一,操作簡便,它的操作介面人性化,使用者較易上手,是所有MS中最容易學會的一種,在資源共享的實驗團隊裡,它可以在一天之內分析上百件樣品。
第二,需要大量製備蛋白質樣品的地方,目前從2D電泳膠體的製作、蛋白質點(proteinspots)的取出及酵素水解,都採用自動化的設備,MALDI-TOP也能以這樣的形式存在,減少人力、提高效率。
第三,隨著TOF分析方式的
改良,得到的蛋白質體數據也愈正確。
第四,MALDI-TOFMS的靈敏度高,可以偵測到少
量的(可到10-18mole)蛋白質。
雖然MALDI-TOFMS有這麼多好處,有時我們仍會使用其它種類的MS,這是因爲
MALDI-TOFMS可以提供正確的「質量(mass)」資訊,卻不能獲得詳細的「序列(sequeneedata)J結果,PSD的改良固然使MALDI-TOFMS能看到序列,詳盡與正確度仍不及ESI
tandemMS(electrosprayionization-tandemmassspectrometry)。
除此之外,分析的成敗,幾乎取決於樣品當初製備的品質如何,如果樣品在水解過程被金屬、鹽類、尿素、丙醇污染,或是界面活性劑(detergen)沒有去除乾淨,都會使樣品在MALDIsource的電離(ionization)受到極大的影響。
當然,樣品的污染會影響所有的MS分析,不過MALDI-TOFMS對此特
別敏感,因爲它沒有再經HPLC系統去除雜質的步驟。
四、ESItandemMS
ESI-tandemMS(electrosprayionization-tandemmassspectrometry)又稱爲ESI-MS-MS,ESI是離子產生的過程,tandemmassspectrometry是分析離子質量的地方,分爲兩個或更多個步
驟。
和MALDI中晶格化的樣品不同,ESI的樣品是放在溶液中的,溶液pH值的高低,控
制了樣品的官能基(functionalgroup)離子化的狀況,pH值約高於5,C-terminal的部份才會離子化,pH值低於7的時候,N-terminal及氨基酸hitidine的氮才會游離,lysine和arginine的N端通常要低於pH8.5才會離子化,這表示在酸性溶液中(如pH3.5或更低)會使蛋白
質帶正電,在鹼性環境中則讓蛋白質帶負電,ESI一般都在酸性環境下分析帶正電的peptide
ion。
在分析前,使用胰蛋白酶(trypsin)水解蛋白質的結果,因爲酵素切點的位置,使作用完的peptides裸露出lysine、arginine部份,加上低pH值的環境,這些peptides變成帶有多個正電的狀態。
舉例來說,帶有一個質子的20kDa(m/z=20,001)蛋白質,其實在溶液中可以
接受10~30個質子,因此這些蛋白質分子有的含有20個質子,m/z值爲20,020/20=1001;
有的含有21個質子,m/z值是20,021/2仁953;有的含19個質子,m/z值是20,019/19=1053。
ESImassspecgrum之所以被稱爲「多價圭寸套(multichargeenvelope)J,正是因爲它能捕捉到不同價數的蛋白質狀態,下圖是以此法分析牛的apomyoglobin結果:
■i»iiibmrt
再透過軟體,將這些訊息顯示為真正的蛋白質質量:
較小的蛋白質(250~2500Da)依其大小及鹼性氨基酸多寡,通常以一至三價混合離子的形
式存在,拿胰蛋白酶切完產生的peptide「DAFLGSFLYEYSR」爲例,ES-MS分析的結果
如下:
1567»#ihs.jititt!
H?
4
levinciksmjob
一價的m/z爲1567.9,二價的離子m/z爲784.7。
ESIsource的構造較簡單,樣品通常由HPLC純化出來後,流入source的地方,經過高電壓
的不繡鋼管或針頭,以滴狀物的形式噴出,每一滴都含有胜肽離子(peptideions)和HPLC
的移動相物質,如水、acetonitrile、aceticacid等。
接著,source以加熱或給予氮氣的方式,
分開peptideions與其它物質,將peptideions送入analyzer分析,其他物質以抽真空的方式排出。
整個流程如下圖所示:
highvoltageneedle
solvatedIon
五、TandemMassAnalyzers
在蛋白質體學研究中,目前有三種分析儀(analyzer)搭配ESIsource使用,分別是triple
quadrupole(又稱爲triplequad)、iontrap和quadrupole-timeofflight(Q-TOF)。
三種的運作方式雖有差別,共同點是會選擇source送來的peptideion其中一種m/z值,以撞擊引發解
離作用(collision-induceddissociation,CID),peptideion片段化且變成電中性,分析m/z
值後產生離子光譜(ionspectrum),由tandem或MS-MS光譜的資訊,可以推知peptide的
序列,由MS-MSspectrum還可以知道序列的何處經過修飾。
Triplequad是首用於蛋白質體學研究的tandemMS,含有4個平行排列的金屬柱:
/on
金屬柱的電流和電壓方向,使離子以螺旋狀軌道行進,唯有具備特定的m/z值的離子能穿越,大於或小於此m/z值的離子無法順利穿越:
由source來的離子會先經過第一個quadrupole(Q1)作快速掃瞄(rapidscanning),記錄下
所有時間通過的所有離子m/z值,這種模式爲「full-scanmode」:
(massfilter),只能讓特定的m/z
後,經argon原子的碰撞而裂解化
Q1電壓的設定、q2中Ar氣壓的大小、CID(collision-induced有很大的關聯性。
它的流程如下:
我們也可以調整Q1電壓,讓它成爲一個「質量過濾器」值離子通過,這些離子進入第二個quadrupole(q2)
(fragmentation),在第三個quadrupole(Q3)分析m/z值,這種模式稱爲「MS-MSmode」,MS-MS分析的效果,和dissociation)的能量給予,
Q-TOF和triplequad大致相似,唯它的Q3部份是TOFmassanalyzer。
六、Ion-TrapMassAnalyzers
Ion-trapmassanalyzer的作用原理和triplequadrupoles有很大的不同,後者是在離子飛行穿
越管子的時候分析它們,前者則是收集並儲存離子後再分析之。
由source來的離子會直接
進入iontrap,trap的兩端有電極,中間是環狀的電極,構造如下圖:
trappedIons
top
/on*out
Trap的大小和葡萄差不多,它將收集到的離子保存在軌道上,以氦氣作冷卻劑,使離子的能量散佈均勻,並循序析出離子,:
Ion
爲了呈現所有在trap中離子的質譜,它會不斷進行「讓trap充滿離子」、「依m/z值掃瞄出離子」的循環,和前面提過的triplequadrupole不同,triplequadurpole是作出連續性的分析,iontrap則是作有規律性的間歇式分析。
當目標離子進入,trap的電壓會加高,使離子受到
衝擊產生fragmentation:
^cttvatk>n(frugm^nt^tion)
產生的fragments被trap「捕捉」,依m/z值分析:
•scanoutto
*productf加対商
ton*
Ion-trap的解析力很高,如果將掃描的速度調慢,它能分辨0.05unit的m/z值差異,在自動
化操作的過程中,若再搭配限制質量,甚至能在MS-MS分析前就得知離子的價數狀況
(chargestate),這對peptide的定序相當有利。
%參考資料:
DanielC.LieblerIntroductiontoProteomics-ToolsfortheNew
BioloogyP55~76
HumanaPressInc.(2002)
整理:
施純如
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- MS 蛋白质 序列 分析 方法 概述