心血管疾病标志物的新秀循环microRNAWord文档下载推荐.docx
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大约10年前,在哺乳动物体内发现了一组非编码的小RNA[5],在进化上相对保守。
miRNAs作用于mRNA的3'
非编码区在转录后水平调节基因表达。
通过影响蛋白质的翻译,miRNAs在生物合成过程中起重要的调节作用。
循环miRNA的意外发现开启了研究领域的新篇章,使得我们有机会深入了解这一极为活跃的生物标志物,miRNA及时将细胞内的信息传递给我们。
意识到miRNA重要的调节作用后,很快掀起了miRNA的研究热潮,在心血管领域的研究也是持续升温。
miRNA作为心血管疾病的标志物和治疗手段成为研究的热点[6]。
2循环MiRNA的稳定性
2008年,miRNA的研究取得重大突破,Lawrie等[7]于2008年首次在淋巴瘤患者的血清中发现了细胞外的miRNA。
同年,Mitchell等[8]在前列腺癌患者的血清及血浆中都发现了这种生物标志物。
随后,多项研究证实了miRNA可以由细胞输出至胞外,在体液中稳定存在,包括血浆、血清、唾液、尿液、泪液甚至乳汁[9-11]。
通过血浆、红细胞、血小板、及有核细胞的检测发现血浆miRNA能稳定存在,即使在各种严苛的条件下:
高温至沸腾,强酸强碱,室温下长期储存和反复冻融等[7,8,12]。
已知细胞外裸露的RNA极易被RNA酶降解,而miRNA却出奇的稳定,这说明内生的miRNA必然受到某种机制的保护而不被降解。
研究证实miRNAs在血浆中被有膜微颗粒包裹如胞外体、微囊泡和凋亡小体[13,14]或与RNA结合蛋白结合(如Argonaute2,Ago2蛋白)[15]或者结合于载脂蛋白复合体(如high-densitylipoprotein,HDL)[16]通过这些方式的结合阻止降解。
3循环miRNA的来源
El-Hefnawy等[17]首次提出血浆RNA通过包裹于蛋白或脂质囊泡中而逃过RNA酶的降解。
根据他们的体积及从细胞中释放的方式,这些颗粒被分别命名为胞外体,微囊泡或凋亡小体。
胞外体直径50~100nm,前体又称胞内体,胞内体内含有由细胞核释放的miRNA,多个胞内体在胞浆中形成多囊复合体,但各自有独立的包膜包裹,当多囊复合体的膜与细胞膜融合时,这些小泡释放至胞外形成了胞外体。
微囊泡或脱落的微囊泡是另一种形式的带膜微粒[18],是细胞质膜脱落的产物,和胞外体一样,微囊泡也可以来源于不同的细胞[19],直径0.1〜1卩m,大于胞外体。
两种带膜微粒的产生机制也不相同[20,21]。
胞外体的形成是细胞的内吞作用,并将内吞的囊泡融合成多囊泡(MVBs),而微囊泡的形成是细胞自身的出牙过程[22]。
Hunter等于2008年首次在微囊泡中发现了miRNA[23],携带有miRNA的微囊泡同样能作用于受体细胞起到信息传递的作用。
含有miRNA的微囊泡在细胞凋亡时即可形成凋亡小体,细胞坏死或凋亡时这种有膜结构的囊泡携带miRNA进入血循环[22]。
机体内富含各种形状,大小(1〜5卩m)的微粒[24]。
除了细胞起源的囊泡包裹有miRNA,还有很大一部分细
胞外的miRNA并不是存在有膜结构中,而是与蛋白结合,其中包括核仁磷酸蛋白(nucleophosmin,NPM1)[25],Ago蛋白家族的Ago2,还有Ago1,Ago3,Ago4。
最近有报道细胞外的miRNA还可以通过高密度脂蛋白转运[26,27],可见细胞内miRNA的载体非常丰富,通过结合载体miRNA能在血浆微粒中稳定存在,越来越多的证据显示这种血浆中的miRNA并不单纯是被动的释放,而是在细胞与细胞之间发挥重要的信息传递的功能,miRNA微粒通过血液循环作用于远处的靶细胞,并实现对靶细胞基因表达的调节[28,29]。
见图1。
图1循环miRNA的释放及细胞间的传递
图1在细胞核内,在RNA聚合酶H(polymeraseH,Pol
H)的作用下生成具有茎环结构的miRNA的前体(primary
miRNA,Pri-miRNA)。
Pri-miRNA输出至胞浆中,被Dicer核酸酶切割成双链miRNA。
miRNA双链解离形成成熟的miRNA,其中一条链与Ago蛋白结合形成RNA介导的沉默复合体(RNA-inducedsilencingcomplexRISC),另一条降解。
RISC可在胞浆内结合靶mRNA,抑制靶基因的翻译或诱导降解。
另外,miRNA可以输出至细胞外,输出的载体包括胞外体、微囊泡、RNA结合蛋白(miRNA-bindingproteincomplexes,RBP)或高密度脂蛋白(highdensitylipoproteins,HDL)。
输出至胞外的miRNA可以作用于受体细胞调节受体细胞基因的表达。
实现细胞之间信息的传递及调控。
4循环miRNA作为标志物
一直以来,人类理想的生物标志物应符合以下条件:
①可以通过非侵入性操作获得,②具有高度的敏感性及特异性,③在疾病的早期阶段即能诊断。
④随着疾病的转归,呈现相应的指标改变。
⑤在样本中的半衰期长,⑥检测方法简便,便于快速检测[30]。
循环miRNA在血浆中存在的稳定性及可以定量检测的的特性引起了科研工作者的极大兴趣。
由于循环miRNA满足了人类对循环标志物的全部幻想,应用前景十分广阔,自2009年开始相继有10多项研究先后报道了循环miRNA作为心血管系统的血浆标志物,用于诊断及预后评价。
其中包括心肌梗死、心力衰竭、动脉粥样硬化和高血压等。
尽管以上的结果还需要大规模多中心的研究进一步验证,但以上的研究至少证实了部分血浆miRNA的心血管特异性。
不但能用于心血管疾病的诊断及疗效观察,而且为临床研究提出了新的治疗终点。
关于心血管疾病中的
miRNA标志物的研究汇总见表1
5急性心肌梗死与循环miRNA曾经设想存在一种心肌细胞特异性的miRNA,在心肌损伤时快速释放入循环血液中,可以通过这种特异的miRNA准确的诊断心肌损伤。
这一设想正在逐步实现。
目前已经发现在急性心肌梗死时有4种miRNA特异性升高。
分别是miR-208a,miR-499,miR-1,和miR-133[1,31-38]。
其中miRNA-208a编码a-MHC基因内含子,是目前发现的最为特异性的心肌来源的miRNA[39],在心肌以外的组织没有发现。
而其他3种miRNA(miR-499,miR-1,miR-133)除了存在于心肌细胞,在骨骼肌中也发现一定水平的表达[40,41]。
一项研究[1]纳入了66例胸痛患者,均进行了心肌酶、心电图检查,并进行了冠脉造影,同时纳入了30例健康对
照。
66例胸痛患者均完成了上述检查确诊心肌梗死患者为33例,另外33例为非心梗的胸痛患者。
时时荧光定量PCR显示miR-1,miR-133a和miR-499血浆水平在心梗组显著升高,对比非心梗胸痛组和健康对照组均有统计学差异。
miR-208a目前发现的唯一的心脏特异性的miRNA,在非心
肌组织中未发现表达,因此是诊断急性心肌梗死最为理想的生物标志物。
另有几项研究显示miR-499在急性心肌梗死中的诊断价值[1,31,33,36]。
与miR-208a相比,miR-499的优势在于检测的稳定性,miR-499的释放晚于miR-208a和cTnI,因此在诊断晚期心梗更有价值。
miR-1和miR-133a由于在骨骼肌高表达,血浆水平受到骨骼肌和其他组织病理变化的影响,作为心肌梗死血浆标志物仍有争议[1,33,37,38]。
综合以上研究结果,联合应用miR-208a和miR-499水平诊断急性心肌梗死是非常可行的,miR-208a可用于早期的诊断,而miR-499用于追踪晚期的心梗。
6心力衰竭和循环miRNA
有几项研究进行了心力衰竭中相关的的循环miRNA标志物的探索,其中一项研究纳入了12例心衰患者和12例健康对照进行了基因芯片的研究[2]。
排除近期的心肌缺血和心梗,为的是结果不受心肌细胞坏死的影响,确实在研究中未发现梗死相关的miR-1,miR-208a,miR-208b或miR-499的升高。
通过基因芯片初步锁定了16个候选基因,为了进一步的确认继续进行了下面的实验,纳入50例主诉为呼吸困难的患者,其中30例确诊为心力衰竭,另外20例非心源性呼吸困难作为对照组。
7种miRNA被证实与心衰相关包括miR-423-5p,miR-18b*,miR-129-5p,miR-1254,miR-675,HS_202.1,和miR-622。
其中miR-423-5p与心力衰竭诊断的相关性最好,ROC曲线分析显AUC为0.91(95%CI0.84~0.98)。
本研究的对照组不是选择健康对照组是选择非心源性呼吸困难的患者,筛选出来的miRNA在呼吸困难的鉴别诊断方面非常有意义。
例如miR-675,与健康对照组相比在心
衰患者中显著升高,相关性良好,但在本研究中发现miR-675
在非心源性呼吸困难的患者中也出现升高,因此以miR-675作为心衰的标志物并不是特异性的。
研究显示还有一部分miRNA与疾病的严重程度相关,如循环miR-423-5p和miR-18b*与射血分数和纽约心功能分级呈负相关。
基于这一特性,作为心衰的标志物循环miR-423-5p和miR-18b*是非常有吸引力的,但还有一些重要的问题尚未解决。
首先,还不清楚哪种细胞释放miR-423-5p。
有报道指出在心衰患者的顿抑心肌miR-423-5p呈高表达,提示循环中的miR-423-5p来源于顿抑心肌细胞的释放[2]。
Fukushima等[43]纳入10例心衰患者和17例无症状的对照组,共分析了3种miRNA,发现内皮细胞来源的miR-126与年龄(相关系数0.52,P=0.0006)、脑钠肽(相关系数0.25,P=0.0003)、纽约心功能分级呈负相关,提示miRNA作为心
衰标志物的可能性。
在冠心病患者[3]和2型糖尿病患者[46]中也发现了miRNA-126的低表达。
更多的关于心衰的循环miRNA还有待进一步的研究。
7冠状动脉粥样硬化相关与miRNA动脉粥样硬化是心血管疾病的主要病因,被认为是血管壁的慢性炎症改变,目前的影像学检查技术仅能辨认较晚期的不稳定斑块。
因此临床迫切需要有更可靠地血浆标志物能对早期的不稳定斑块做出诊断,并对预后提供指导。
为此,科研工作者进行了大量的研究,以下将介绍几个相关的研究。
Fichtlscherer[3]首先对稳定性心绞痛患者相关的miRNA进行了研究。
该研究纳入了经冠脉造影确诊的冠心病患者,通过对8例冠心病和8例健康对照的基因芯片研究显示其中46种miRNA下调,20种miRNA上调。
在接下来的实验中纳入36例冠脉造影确诊的冠心病患者和17例对照,通过Real-timePCR对所有差异表达的miRNA进行定量。
发现大多数表达下调的miRNA均来自血管壁,特别是内皮细胞。
包括已知的内皮细胞来源的miR-126,miR-92a,和miR-17.另外血管平滑肌来源的miR-145和炎症细胞相关的miR-155在冠心病患者中表达也出现下调。
对稳定性冠心病患者的研究中发现内皮细胞相关的miRNA表达减低绝对是惊人的发现,因为动脉粥样硬化病变时内皮细胞会激活,激活的内皮细胞会诱导细胞内含miRNA
的颗粒的释放,但研究的结果却显示内皮细胞相关的miRNA
在稳定性冠心病患者中表达减低[47]。
分析原因之一是这种内皮细胞miRNA的减少间接反应了冠心病患者循环内皮祖细胞的减少[48]。
另一个解释是miR-126是与年龄呈负相关的miRNA[43],而该研究两组人群未进行年龄的匹配,冠心病组年龄大,且年龄差差在30岁左右,也是造成冠心病组miR-126低表达的原因。
miRNA-126在高龄组表达减低的另一原因是冠心病患者灌注的衰退及缺少新的内皮细胞的补充,另外细胞老化也造成miRNA的释放减少[43]。
miR-155在冠心病组表达下调也是没有预料到的,已知miR-155是炎症相关的miRNA,主要来源于炎症细胞[3],而动脉粥样硬化这种管壁的炎症改变却未见到miR-155的升高,反而出现表达下调。
可能的解释包括年龄及性别因素,miR-155表达水平与年龄呈负相关,而且在男性表达低于女性[3]。
Taurino等[44]进行了一项全血的基因芯片研究,对其中纳入的10例冠心病患者进行了冠状动脉旁路移植手术,并进行了康复治疗。
miR-92在心脏康复治疗后表达呈现上调。
这一结论与Fichtlscherer[3]的研究相吻合,该研究曾报道在冠心病组miR-92血浆水平下调。
Hoekstra等[45]也进行了冠心病患者miRNA的研究,不同的是该研究应用的是外周血管单核细胞(PBMC)。
显示在2个冠心病组miR-135a增加5倍,miR-147增加4倍。
其中miR-147曾被报道与免疫细胞向炎细胞转型并发挥发挥抗炎作用有关,能促进肿瘤坏死因子a和白介素-6的释放[49]。
这项研究提示外周血单核细胞miRNA在动脉粥样硬化时会倾向于转换为炎症表型。
不稳定心绞痛和稳定性心绞痛患者的miRNA也发现存在差异表达,有3种循环miRNA(miR-134,miR-198和miR-370)在不稳定心绞痛患者中表达升高,这种升高是否揭示了斑块存的不稳定[50]。
还有待进一步验证。
总之,以上的研究结果提示循环miRNA作为生物标志物有望对冠心病的诊断及预测提供帮助,但所报道的研究均是人群的小样本研究,研究的结论仍需要大规模的临床研究进一步证实。
8循环miRNA与高血压
在对高血压患者miRNA谱的研究中同样发现存在特异的高血压相关的miRNA[4]。
其中,最有意义的发现是编码人类巨细胞病毒的miRNAhcmv-miR-UL112特异性的升高。
提示原发性高血压可能与巨细胞病毒感染有关。
该研究[4]显示高血压患者HCMV病毒滴度高于对照组(1870:
54)。
而且在高血压患者中发现HCMV病毒滴度与人巨细胞病毒-miR-UL112水平相关。
(p=0.003)这一结论在动物实验中得到了进一步的验证[51],研究发现鼠巨细胞病毒感染小鼠后会导致小鼠的高血压。
这一研究结果为原发性高血压的病因提供了新的理论研究,也为治疗提供了新的靶点。
但由于hcmv-miR-UL112在人群中变异较大,尚不能用于高血压诊断及预测的生物标志物。
9循环MiRNA作为生物标志物的前景展望目前,心血管疾病循环生物标志物局限于特异的蛋白,如肌钙蛋白,B型尿钠肽等。
发展新的蛋白标志物已经遭遇瓶颈,原因是蛋白在血循环中多以复合物形式存在,成分复杂,不易分离,而且蛋白合成后要经过转录后加工,这种加工造成了蛋白的多样性,检测易出现误差。
再者,在血浆中丰度低,也很难开发相应的检测试剂盒,不能满足临床快速检验的需求[30]。
而循环miRNA拥有优秀的生物标志物的特性。
如:
稳定性,因为RNA序列在进化上相对保守;
具有组织细胞特性性,而且在病理状态呈差异表达;
可以通过real-timePCR定量检测,有高度的敏感性和特异性。
然而,循环miRNA作为生物标志物同样存在挑战:
首先,血液中总RNA含量低,不能直接从循环中检测miRNA的含量。
因此,不同实验室不同的检测方法造成的结果不同,缺乏横向的可比性,因此检测需要标准化。
目前还在研究当中,相信随着miRNA更多的生物学功能的揭示,结合基因组学、蛋白质组学、代谢组学和系统生物学研究的结果,多种疾病产生和发展的机制将会被阐明,疾病检测、预测的准确性及灵敏度将会大大提高,疾病治疗的手段将会更加丰富和有效。
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