分子生物学课件6Word下载.docx
- 文档编号:5856078
- 上传时间:2023-05-05
- 格式:DOCX
- 页数:22
- 大小:52.32KB
分子生物学课件6Word下载.docx
《分子生物学课件6Word下载.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《分子生物学课件6Word下载.docx(22页珍藏版)》请在冰点文库上搜索。
★核心酶的组建因子α+α→2α+β+β’
★促使RNApol与DNA模板链上游转录因子结合
★位于前端的α因子使双链解链为单链
★位于尾端的α因子使单链新聚合为双链
★在启动子识别中起作用。
(3)β因子
★促进RNApol+NTPRNAelongation
★完成NMP之间的磷酸酯键的连接
★Editing功能(排斥与模板链不互补的碱基)
★与Rho(ρ)因子竞争RNA3’-end
★构成Holoenzyme后,β因子含有两个位点
Isite(initiationsite.Rifs):
该位点专一性地结合ATP或者GTP(需要高浓度的ATP或GTP)
Esite(elongationsiteRifR):
对NTP非专一性地结合(催化作用和Editing功能)
(4)β’因子
参与RNA非模板链(sensestrand)的结合充当SSB)
由于各亚基的功能,使全酶本身含有五个功能位点
有义DNA链结合位点(β’亚基提供)
DNA/RNA杂交链结合位点(β亚基提供)
双链DNA解链位点(前端α亚基提供)
单链DNA重旋位点(后端α亚基提供)
σ因子作用位点
Rifampin对RNApol的抑制表现
Rif紧密与β亚基结合
Rif与A/GTP对Isite的竞争→阻止ATP/GTP对Isite的填充
当I,Esite被pppXpY(2NMP)填充,Rif能阻止RNApol的前进
当I,Esite被pppXpYpZ(3NMP)填充,Rif失去抑制效应
Rifampin是RNA合成起始的抑制剂
二、Promoter的结构与功能(Prok.E.coli)——rrnBP1promoter
1.核心启动子
(1)Sextama框(SextamaBox)
§
-35序列,RNA聚合酶的松弛(初始)结合位点,§
RNA聚合酶依靠其σ亚基识别该位点—识别位点(R位点)§
大多数启动子中共有序列为T82T84G78A65C54A45§
重要性:
很大程度上决定了启动子的强度(RNApol的σ因子)§
位
2)Pribonow框(PribonowBox)
§
-10序列,RNA聚合酶的牢固结合位点结合位点(B位点)§
一致序列:
T80A95T45A60A50T96(TATPUAT)§
位置范围-4到-13
(3)起始位点;
+1RNAtranscriptionalstartpoint(Isite)A/G
4)-35和-10序列的间距
在90%的启动子中,-35区和-10区之间的分隔距离在16~18之间。
2、CAP-cAMP结合位点(也称CAP位点)
转录调控中,I→阻遏蛋白→负调控
lac操纵子模型
许多基因的表达还存在正调控机制
例如:
E.coli培养基中乳糖和葡萄糖共存时→只有葡萄糖被
利用
原因:
CAP位点的正调控
•葡萄糖缺少时,腺苷酸环化酶将ATP→cAMP,
cAMP与CAP位点结合,此时启动子的进入位点才能
与RNApol结合
•葡萄糖存在时,cAMP不能形成,没有CAP-cAMP
与CAP位点结合,启动子的RNApol进入位点不能结
合RNApol
(1)CAP位点的组成(-70~-40)
位点Ⅰ:
-70~-50包括一个IR序列
强结合位点
位点Ⅱ:
-50~-40弱结合位点
位点Ⅰ对位点Ⅱ具有协同效应(cooperativity)
(2)位点Ⅱ结合CAP-cAMP复合物后,促使RNApol进入
SextamaBox,最终与-10序列结合起始转录
CAP-cAMP复合物与位点Ⅱ结合→Sextama
Box富含G·
C区域(G·
C岛区)稳定性降低→
PribnowBox的溶解温度降低→促进开放型启
动子复合物的形成→促进转录
三、起始过程
封闭型启动子复合物----开放型启动子复合物----第一个磷酸二酯键----σ因子解离
4、大肠杆菌不同的σ因子对转录的调控
当37℃时;
大肠杆菌利用正常的σ70因子启动转录
当>37℃时;
RNA聚合酶利用σ32因子识别17种与热应激蛋白相关的基因启动子特异序列
每一套启动子的共有序列是不同的,无论是位于-35区和-10区的。
这就意味着一个聚合酶包含特定σ因子,仅识别它自身的一组启动子,因此不同类型的转录可分别进行。
第三节真核生物RNA转录的起始
RNATranscriptionpromotioninEukaryots
一、真核生物的RNApol
1、三种RNApol:
根据对α-鹅膏蕈碱的敏感性不同而分类
RNApolⅠ最不敏感(动、植、昆)
RNApolⅡ最敏感
RNApolⅢ不同种类的敏感性不同
2、位置和转录产物
RNApolⅠ核仁活性所占比例最大
转录rRNA(5.8S、18S、28S)
RNApolⅡ核质主要负责hnRNA、snRNA的转录
hnRNA(mRNA前体,核不均一RNA
heterogeneousnuclearRNA)
snRNA(核内小分子RNAsmallnulear
RNA)
RNApolⅢ核质负责tRNA、5SrRNA、Alu序列和
部分snRNA
•目前在线粒体和叶绿体内发现少数RNApol(活性较低)
3、聚合酶亚基组成:
分子量500KDa
包括:
2个大亚基L,L’
7~12个小亚基
RNApolⅡ:
•大亚基中有C末端结构域
(carboxyterminaldomainCTD)
•CTD中含一保守氨基酸序列的多个重复
Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser
C端重复七肽
•不同生物中重复数目不一样(酶活性)
(酵母重复26次,鼠重复52次)
•CTD中的Ser和Thr可被高度磷酸化
磷酸化的RNApolⅡ被称为Ⅱo
非磷酸化的RNApolⅡ称为Ⅱa
•CTD参与转录→Ⅱa→Ⅱo→使RNApol易于离开
启动子进入延伸过程(10倍)
二、真核生物的启动子
三种RNApol→三种转录方式
三种启动子→三类基因,Ⅰ类Ⅱ类Ⅲ类
1、RNApolⅡ的启动子
•结构最复杂
•位于转录起始点的上游,有多个短序列元件组成
•
(1)帽子位点(capsite):
转录起始位点
与Prok.的“CAT模式”相似
(2)TATA框(Hogness框或Goldberg-Hogness框)
•位于-30(-25~-35bp)处
•一致序列为T82A97T93A85A63(T37)A83A50(T37)
•定位转录起始点的功能(类似原核的Pribnow框)
•TATA是绝大多数真核基因的正确表达所必需的通用型启动子(无组织特异性)
(3)CAAT框(CAATbox)
•位于-75bp(-70~-80)处
•一致序列为GGC/TCAATCT
•前两个G的作用十分重要(转录效率)
•增强启动子的效率、频率,不影响启动子的特异性
(距转录起始点的距离,正反方向)
☻以上三个保守序列在绝大多数启动子中都存在
(4)增强子(enhancer)
(又称远上游序列farupstreamsequence)
该增强子的特点如下:
♪增强子是通过启动子来增加转录的
对依赖于TATA框的转录的增强效应高于不依赖
的情况
♪距离效应:
离72bp越近的容易起始转录
♪无位置和方向性
♪细胞类型的选择:
不同类型中作用有差异
表明其作用具有细胞或组织特异性(调节蛋白)
♪基本的核心顺序(coresequence):
AAAGGTGTGGGTTTGG
(6)其他元件(不讲)
•八聚核苷酸元件(octamerelementOCT元件)
一致序列为ATTTGCAT
•KB元件一致序列为GGGACTTTCC
•ATF元件一致序列为GTGACGT
•还有一些位于起始点下游的相关元件
(7)不同元件的组合情况
不同元件的数目、位置、和排列方向均有差异
例如:
SV40的早期启动子中有6个GC框
小结:
★不同启动子中每种元件与转录起始点的距离不同
★不同启动子中的相应元件互相交换,形成的杂交
启动子功能没有变化
★各种元件将相应的蛋白因子结合到启动子上,
组成起始复合物,蛋白因子间的相互作用决定
了转录的起始
3、真核生物转录的起始
♫三种RNApol均没有对启动子特异序列的识别能力
♫转录起始过程需要很多的辅助因子(转录因子)参与,并且按一定顺序与DNA形成复合物,协助RNApol定位于转录起始点
TFIIA;
结合TFIID
促进TFIID结合到TATAbox
稳定DNA-TFIID复合体
TFIIB;
一旦TFIID结合到DNA
TFIIB结合到TFIID的TBP和RNApol.II
TFIIB充当桥梁因子,使RNApolII与TFIIF的
RAP30亚基一起组装TIC
TFIIF;
包括RAP30,RAP74两个亚基
结合RNApolII组装成TIC
通过其螺旋酶性质(ATPase)促进RNA延伸
第4节转录延伸TranscriptionElongation
一、起始到延伸的转变
★始于第一个磷酸二酯键的形成
★伴随着DNA分子和酶分子构象的变化
1、Prok.
•起始时,σ因子有利于β和β’亚基具有与DNA专一
性结合所要求的构象
•起始后,σ因子解离,β和β’亚基构象发生变化
2、Euk.
•多种辅助因子的共同作用来保证这一转变
二、延伸过程(Prok)
★酶与产物RNA不解离
★底物NTP不断加到RNA链的3’-OH端
★形成一个磷酸二酯键后,核心酶向前滑动
★延伸位点不断地接受新的NTP,RNA链不断延伸
☻始终保持三元复合物的结构
1、转录泡
★RNApol结合和转录的DNA模板区域,有17bp左右
DNA形成解链区
★转录泡处杂交双链很短
•胰脏RNAase______其长度10bp(不准确)
•推测也就两个核苷酸左右
2、拓扑学问题
ΦRNA合成过程中,转录泡两端要发生拓扑转变
•RNApol的前沿…..解螺旋作用
•RNApol后端…..DNA的螺旋化
(保持解链区长度约17核苷酸左右)
Φ超缠问题的解决靠DNA旋转酶
ΦRNA-DNA杂交链也要求作旋转运动
3、转录过程中的延宕
(1)RNA的合成速度大约30~50个核苷酸/
秒,与蛋白质的合成速度相近(15个AA/sec)
(2)模板DNA中G/C的存在
(G/C后的8~10个核苷酸)
延宕作用在RNA链的终止和释放中起重要作用
思考:
延宕发生的原因?
第五节转录的终止
Transcriptiontermination
☆终止过程:
酶停止添加底物→→释放RNA链→→酶解离
终止反应…杂合双链的氢键断裂,
…重新形成双螺旋,酶的解离。
☆终止子(terminator):
在转录的过程中,提供转录终止
信号的RNA序列
真正起终止作用的是RNA序列---与启动子不同
☆Prok.和Euk.都具有----一种基因表达调控的手段
一、原核生物的终止子
1、终止子的种类
(1)内在终止子(不依赖ρ因子的终止子)
体外实验中,只有核心酶和终止子就足以使转录终止
(2)依赖ρ因子的终止子
蛋白质辅助因子--ρ因子存在时,核心酶终止转录
两者有共同的结构特征(序列差异)
终3、依赖ρ因子的终止子(Rho-dependentterminator)止效率与二重对称序列和寡聚U的长短有关,长度效率
a)
Structure
回文序列
G/C含量少,形成松散的RNA发夹结构
DNA水平上,回文序列之后是一串的A/T结构
转录终止需ρ因子
二、原核生物转录的终止
1、不依赖ρ因子的终止子终止转录
(1)新生RNA链发夹结构形成----与RNApol发生作用----阻止RNA链的释放
---造成高度延宕(典型的有60秒左右)
(2)RNApol暂停为终止提供了机会,6~8个连续的U
串可能为RNApol与模板的解离提供了信号
RNA-DNA之间的rU-dA结合力较弱
于是:
RNA-DNA解离三元复合体解体
RNApol解离转录终止
(3)真正的终止点不固定,在U串中的任何一处
(4)IR序列和U串同等重要
IR中的G/C对含量的减少
U串的缩短或缺失
(5)DNA上与U串对应的为富含A/T的区域
说明:
AT富含区在转录的终止和起始中均起重要的作用
2、依赖ρ因子的终止子终止转录
(1)终止子上游有一个RNA富含C残基而G残基很少的区域
(2)ρ因子
a、活性形式为六聚体
含有RNA-bindingdomain和ATPhydrolysisdomain
b、RNA长度大于50nt时,依赖RNA的ATPase活性最大
说明:
ρ因子识别和结合的是RNA
(3)ρ因子对终止子的作用
(4)终止反应还需要RNA与DNA的相互作用
即:
需要一定的RNA序列
因为:
其与模板的结合力必须弱到一定数值,才能配合
ρ因子与RNApol的作用
(发夹结构下游的AU序列)
序列不同的终止子→→不同的终止程度→→基因表达
调控的途径之一
(5)Prok.依赖ρ因子的终止子为基因表达调控
提供了一种方式
Prok.中转录与翻译偶联
?
?
为什么同一个转录元里近基因的一个无义
突变能阻止远基因的表达这一极性现象
3、真核生物的终止子及转录终止
了解很少(3’末端)
1、RNApolⅡ的终止子类似Prok.不依赖ρ因子终止子,
终止可能靠RNApolⅡ本身完成
•SV40的终止子:
发夹结构U串
2、RNApolⅢ的终止子类似原核生物(发夹结构U串)
•U串位于发夹结构的顶端
•且保守性很强(酵母→人)
•环和柄对转录的终止同等重要
第二节DNA的结构
一、DNA的一级结构
所谓DNA的一级结构,就是指4种核苷酸的连接及其排列顺序,表示了该DNA分子的化学构成。
基本特点
①DNA分子是由两条互相平行的脱氧核苷酸长链盘绕而成的。
②DNA分子中的脱氧核糖和磷酸交替连接,排在外侧,构成基本骨架,碱基排列在内侧。
③两条链上的碱基通过氢键相结合,形成碱基对,它的组成有一定的规律。
这就是嘌呤与嘧啶配对,而且腺嘌呤(A)只能与胸腺嘧啶(T)配对,鸟嘌呤(G)只能与胞嘧啶(C)配对。
2、DNA的二级结构
DNA的二级结构是指两条多核苷酸链反向平行盘绕所生成的双螺旋结构。
通常情况下,DNA的二级结构分两大类:
一类是右手螺旋,如A-DNA和B-DNA;
另一类是左手螺旋,即Z-DNA。
3、DNA的高级结构
DNA的高级结构是指DNA双螺旋进一步扭曲盘绕所形成的特定空间结构。
超螺旋结构是DNA高级结构的主要形式,可分为正超螺旋与负超螺旋两大类。
DNA分子的超螺旋化可以用一个数学公式来表示:
L=T+W其中L为连接数(linkingnumber),是指环形DNA分子两条链间交叉的次数。
只要不发生链的断裂,L是个常量。
T为双螺旋的盘绕数(twistingnumber),W为超螺旋数(writhingnumber),它们是变量。
2.3DNA的复制
2.3.1DNA的半保留复制机理
2.3.2复制的起点、方向和速度
2.3.3复制的几种主要方式
一、DNA的复制
1、DNA的半保留复制
每个子代分子的一条链来自亲代DNA,另一条链则是新合成的,所以这种复制方式被称为DNA的半保留复制(semiconservativereplication)。
DNA的这种半保留复制保证了DNA在代谢上的稳定性。
2、复制的起点与方向
一般把生物体的复制单位称为复制子(replicon)。
一个复制子只含一个复制起点。
多复制子:
DNA复制时,原核生物一般只有一个起始位点,而真核生物则有多个起始位点,因而在复制时呈现多复制泡,也称为多复制子。
DNA的复制主要是从固定的起始点以双向等速复制方式进行的(图2-18)。
复制叉以DNA分子上某一特定顺序为起点,向两个方向等速生长前进。
拓扑异构酶I
拓扑异构酶I解开负超螺旋,并与解链酶共同作用,在复制起点处解开双链。
参与解链的除一组解链酶外,还有Dna蛋白等。
DNA解链酶(DNAhelicase)
DNA解链酶能通过水解ATP获得能量来解开双链DNA。
单链结合蛋白(SSB蛋白)
SSB蛋白的作用是保证被解链酶解开的单链在复制完成前能保持单链结构,它以四聚体形式存在于复制叉处,待单链复制后才掉下,重新循环。
所以,SSB蛋白只保持单链的存在,并不能起解链的作用。
3、DNA的半不连续复制与冈崎片段
DNA复制时,短时间内合成的约1000个核苷酸左右的小片段,称之为冈崎片段(Okazakifragment)
DNA复制过程中至少有一条链首先合成较短的片段,然后再由连接酶连成大分子DNA。
现在已知一般原核生物的冈崎片段要长些,真核生物中的要短些。
进一步研究还证明,这种前导链的连续复制和滞后链的不连续复制在生物界是有普遍性的,因而称之为双螺旋的半不连续复制。
DNA链的延伸:
DNA复制体(replisome):
在复制叉附近,形成了以两套DNA聚合酶Ⅲ全酶分子、引发体和解链酶构成的类似核糖体大小的复合体,称为DNA复制体。
4、滞后链的引发
DNA复制时,往往先由RNA聚合酶在DNA模板上合成一段RNA引物,再由DNA聚合酶从RNA引物3'
端开始合成新的DNA链。
滞后链的引发过程往往由引发体(primosome)来完成。
引发体由6种蛋白质n、n'
、n'
'
、DnaB、C和I共同组成,只有当引发前体(preprimosome)把这6种蛋白质合在一起并与引发酶(primase)进一步组装后形成引发体,才能发挥其功效。
5、链的终止
当复制叉前移,遇到20bp重复性终止子序列(Ter)时,Ter-Tus复合物能阻挡复制叉的继续前移,等到相反方向的复制叉到达后在DNA拓扑异构酶IV的作用下使复制叉解体,释放子链DNA。
6、复制的几种方式
(1)环状DNA双链的复制
环状双链DNA的复制可分为θ型、滚环型和D-环型几种类型。
(a)θ型
复制的起始点涉及到DNA双链的解旋和松开,形成两个方向相反的复制叉。
前导链DNA开始复制前,复制原点的核酸序列被转录生成短RNA链,作为起始DNA复制的引物。
(b)滚环型(rollingcircle)
这是单向复制的特殊方式。
如ΦX174的双链环状DNA复制型(RF)就是以这种方式复制的。
DNA的合成由对正链原点的专一性切割开始,所形成的自由5‘端被从双链环中置换出来并为单链DNA结合蛋白所覆盖,使其3’—OH端在DNA聚合酶的作用下不断延伸。
在这个过程中,单链尾巴的延伸与双链DNA的绕轴旋转同步。
(c)D-环型(D-loop)
这也是一种单向复制的特殊方式。
这种方式首先在动物线粒体DNA的复制中被发现。
双链环在固定点解开进行复制。
但两条链的合成是高度不对称的,一条链上迅速合成出互补链,另一条链则成为游离的单链环(即D-环)。
(2)线性DNA双链的复制
线性DNA复制中RNA引物被切除后,留下5'
端部分单链DNA,不能为DNA聚合酶所作用,使子链短于母链。
T4和T7噬菌体DNA通过其末端的简并性使不同链的3'
端因互补而结合,其缺口被聚合酶作用填满,再经DNA连接酶作用生成二联体。
这个过程可重复进行直到生成原长20多倍的多联体,并由噬菌体DNA编码的核酸酶特异切割形成单位长度的DNA分子。
二、原核和真核生物DNA的复制特点
1、原核生物DNA的复制特点
大肠杆菌DNA聚合酶I、II和III的性质比较
原核生物的DNA聚合酶
DN
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 分子生物学 课件
![提示](https://static.bingdoc.com/images/bang_tan.gif)