HPV的分子生物学特征及其致病机理资料下载.pdf
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体外研究提示E1为HPV的复制因子,E2提供辅助功能。
HPV211复制必需E2,而牛乳头瘤病毒21(BPV21)的E2则抑制非特异性复制。
E4与病毒成熟胞浆蛋白有关。
HPV的E5基因正好位于E2的下游,编码一种小蛋白,如HPV216的E5为84氨基酸(aa)长,而BPV21只有44aa。
又如HPV26的E5有两个ORF称E5b,E5蛋白的主要生物学功能是通过细胞生长因子受体激活上向调控。
来自人和动物的E5蛋白均可不同程度地转化哺乳类细胞。
在病毒生活周期中,E5与E6和E7蛋白一起发挥重要作用。
E6称多功能蛋白,至少能与两种细胞蛋白(即E6相关蛋白2E6AP和E6结合蛋白2E6BP)结合。
致癌病毒的E6蛋白可持久存在于人类乳房原始细胞中,与E7作用可持久存在于人类原始角质细胞中。
HPV216的E6为151aa长,在体外结合Zn2+,含2个Zn指(Znfingers)。
E6BP尚有Ca2+结合蛋白潜能。
体内细胞中E6蛋白产量极少,因检出困难而难以研究。
在原位癌中,病毒转录常限于E6和E7基因,造成其整合入宿主染色体。
HPVE6能结合p53,而E7能与成视网膜细胞瘤(Rb)肿瘤抑制蛋白结合。
HPV的持久存在于人类原始包皮角质细胞并发挥致癌潜能,与E7基因关系至为密切。
如E7可转化为啮齿类成纤维细胞,且是在人原始角质细胞中持久存在的基础。
HPV216的E7由98aa组成,其标志分子大小为11kda。
HPV26和211的E7分子量分别为14kda和17kda。
HPV216与HPV26相比,其N末端10aa中有一定数量的变异。
致癌性HPV216、218和231可持久存在于角质细胞中,而低危型病毒HPV26和211则否。
HPV216全长基因组持久存在于角质细胞中时,E7和E6基因一起可呈低水平(全长的10%)持续存在。
晚期转录即L区分L1和L2区,其功能是编码病毒的衣壳蛋白。
L1蛋白为病毒的主要衣壳蛋白,L2则为次要成分。
1.2HPV的复制4,51国外医学病毒学分册2004年2月第11卷第1期SectionVirologyForeignMedSci,February2004,Vol11,No.1HPV感染基底上皮细胞被认为是通过微创伤并在细胞中呈低水平复制。
如此类细胞移向分层上皮并分化,则始扩增性病毒DNA复制并完成全复制周期,称正常终末分化。
HPV必须细胞的复制机制,必须刺激细胞周期的S期以完成病毒复制,造成生产性感染。
此过程至少需3种蛋白即E5、E6和E7构成整个G1期到S期的刺激。
为利于病毒复制,E7蛋白在改变细胞环境方面担负关键作用,它刺激细胞通过G1/S界限,能与Rb肿瘤抑制蛋白相互作用,而Rb调控细胞G0通过G1到S期,使细胞近S期时增加磷酸化。
细胞周期中主要有G1/S、G2/M和M期(纺锤体)三个稽查点,每期都为后一期作准备,以获两个遗传物质相同的子细胞。
在进入下一期之前,需进行“检测”,这些检测点即称稽查点或对照点(check2point)。
细胞周期稽查点由细胞抑制基因产物p23、pRb及细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶家族(CDK)抑制蛋白(DKIs)、p21、p27、p16和p15等组成,主要检测细胞周期程序并对其周期中的紧急事件(如DNA损伤、不完全复制、染色体分配错误)做出应答,捕捉异常细胞,紧急刹车进行损伤修复。
这些稽查点对维持基因组的稳定性非常关键,其功能失灵会导致遗传损伤积累,使细胞周期不能及时刹车,就可能导致癌肿形成。
HPV的E7如结合并废除Rb的功能,结合并抑制周期性激酶抑制物p21,并与转录因子AP21家族相互作用,对G1期构成影响,有利于病毒本身的复制。
各型HPV之间的刺激性不同,造成细胞损伤各异。
如HPV26或211型在S期中诱导高增殖性损伤,而细胞仍保留分化能力;
恶变性HPV216或218型则生成S期细胞。
HPV复制过程大致分三期:
1.2.1建立期:
单个或少量病毒颗粒进入细胞,其基因组很快复制50100拷贝/细胞。
1.2.2持续期:
病毒的游离基因随分化基底细胞染色体同步复制,其复制拷贝数仍恒定在50100拷贝/细胞水平上。
1.2.3第三期:
感染细胞离开基底并分化,上皮细胞的最上层生产性复制病毒或扩增,造成每个细胞合成数千个病毒拷贝(见下图)。
病毒功能DNA合成晚期基因表达+-/+-+-上皮分化图目前对HPV复制的内在机制尚欠全面了解。
Ustav和Stenlund以临床转移试验首先描述了HPV的顺式和反式结构,用载体转染细胞表达病毒的复制蛋白与起始片段,于23天后即能分离低分子量DNA并以Southern法分析复制性病毒蛋白。
在此模式中,E1和E2基因为复制所必须,尤其是HPV211高度依赖于该两基因,E1为原始复制因子,E2则提供辅助功能。
2HPV的致病机制15HPV感染成层上皮细胞基底细胞的干细胞群,并建立低复制游离病毒基因组。
皮肤或粘膜的上皮细胞受轻微损伤后暴露基底细胞,使病毒进入机体后便建立起低复制游离病毒基因组,随细胞染色体共同复制。
在被感染的基底细胞中,病毒基因低水平转录,并在分化的子代细胞中大量复制。
赘生物基因组复制,晚期基因表达及毒粒的装配,只限于上2国外医学病毒学分册2004年2月第11卷第1期SectionVirologyForeignMedSci,February2004,Vol11,No.1层高度分化的上皮细胞核内。
病毒基因组稳定地贮存于基底层,并在感染子代细胞中继续生成,以合成子代毒粒。
乳头瘤病毒复制依赖于多聚酶和其它细胞蛋白,在正常上皮细胞中,基底层细胞退出细胞周期,能阻断HPV感染。
但当HPV感染细胞从基底层迁移出时,大多数分化层细胞关闭晚期G1/S期,并被诱导再进入S期,以使病毒DNA又能得以复制1。
2.1HPV感染者免疫功能低下目前的研究认为,HPV进入机体后之所以能长期隐匿并大量复制,与CA患者机体免疫系统普遍受抑,免疫功能低下,甚至免疫缺陷有关。
侵袭表皮细胞的HPV主要以T细胞介导的细胞免疫为主,静止T细胞活化为效应T细胞后方发挥作用。
T细胞活化是T细胞受体(TCR)与主要组织相容性(MHC)分子相关抗原间的反应。
CD4分子与MHC2分子,CD8分子与MHC2分子细胞间粘连,还需另外两个粘连/活化分子桥联作用,才能完成这一反应过程而活化T细胞,缺失此类协同刺激信号将导致T细胞无能,即T细胞增殖分化被阻滞。
HPV持续感染者不能建立有效的免疫反应,尤其是局部细胞免疫反应,是CA复发或宫颈发生肿瘤的重要原因。
当然,建立有效的细胞免疫机制,还涉及病毒抗原的提呈,免疫反应系统的激活乃至效应细胞清除病毒感染的靶细胞等多个环节,其中任何环节发生障碍均可导致细胞免疫功能缺陷。
HPV可通过直接或间接途径改变感染细胞的MHC表达水平以逃避免疫监视。
直接途径可能与HPV2E5基因表达有关。
间接途径与HPV抑制干扰素(IFN2、2)、粒2巨噬细胞集落刺激因子(GM2CSF)及白细胞介素21(IL21)等的合成有关。
这些细胞因子在介导免疫应答中发挥十分重要的作用。
CA患者免疫机能总体水平呈下降之势,且存在免疫调节紊乱,免疫平衡失调。
其中如IL26、IL210水平比正常人升高,而IL22、IL212、IL215等则降低。
近年有学者在许多肿瘤组织和病毒感染组织中均发现有表皮生长因子受体(EGFR)表达。
HPV216E6/E7能与肿瘤抑制蛋白p53及Rb结合成复合物,使细胞增殖与分化失衡,导致细胞过度增殖。
IFN2。
能调高MHC2分子表达,启动正常不表达MHC2分子细胞(如内皮、成纤维、肠道上皮、角质形成等细胞)的表达,而HPV感染者的IFN2水平低下。
外源IFN虽具抗病毒和抗肿瘤作用,而HPV的E7蛋白的1737位氨基酸参与p48结合,阻断IFN2介导的信号传导;
E6蛋白可与细胞内的信号转接蛋白TyK2作用,抑制JAK2STAT活性,阻断IFN合成信号传导通路及其转录活化作用,因此HPV对IFN有抵抗作用。
这也可能是临床应用IFN治疗HPV感染效果不佳的原因。
IL21。
与TCR结合,诱导T细胞表达IL22及IL22受体(IL22R),增强IL22和IFN2诱导激活天然杀伤(NK)细胞的细胞毒作用。
角质形成细胞可自发地产生IL21,并通过正常脱屑排除。
表皮损伤时,IL21可释放于细胞外液,参与皮肤局部及全身免疫反应。
IL22。
通过自泌作用刺激T细胞表达IL22R。
T细胞分化增殖以IL22与IL22R的结合为启动信号,使T细胞分化增殖为效应细胞。
CA患者的IL22和血清白介素22受体(sIL22R)水平明显低于正常人,其病程6个月者则明显低于病程6个月者。
笔者以IL22(剂量3040万单位/d)于CA疣体基底局部注射和静脉输液间隔序贯给药联合更昔洛韦(250mg/d)治疗生殖系HPV感染,降低了CA的复发率,明显提高了治愈率。
2.2HPV的多态性造成其致病的多样性如前所述,近20年已鉴定出120余种HPV,其致病范围从机体表皮、泌尿生殖系已扩展到头颈部癌组织。
洪少林等6对HPV26L1序列研究表明,从8例L1基因序列中检出变异位点达26处,其碱基替换数为311个,其中6598、7081和7099位发生碱基替换者占一半以上,但均为同义突变,发生错义突变的10个位点均为单个分离株。
少数碱基替换导致错义突变,进而导致蛋白质一级结构中的03个氨基酸发生变异。
许多研究者认为HPV感染是宫颈癌的罪魁。
在90%以上的浸润型宫颈癌中可检出各类HPV的亚型,包括16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68和70等型。
Nakagawa等6以RT2PCR法检查了宫颈癌和宫颈上皮细胞瘤(CIN)病例的HPV,分别在30/31例(97%)和31/31例(100%)HPV阳性宫颈组织中检出JE6和E7转录物。
HPV258型是从中国和日本浸润型宫颈癌组织中分离出的,其与HPV233型同源性最高(77%),与HPV216型次之(64%)。
由于地区和检测方法之差异,HPV2163国外医学病毒学分册2004年2月第11卷第1期SectionVirologyForeignMedSci,February2004,Vol11,No.1的检出率在3119%60%之间。
从宫颈上皮细胞瘤样病变发展到宫颈癌约需1012年。
HPV的品系多,各种型的基因序列又易变异,这更增加了其致病的复杂性。
Choo等8在17例台北宫颈癌病例中分离出HPV216新变异,其15/17例(8812%)在核苷酸178位(T178G/D15E)发现E6变异,11/17例(6417%)发现核苷酸A442C/E113D为第二个E6变异,此类双变异的流行率为63%。
另还发现6个其它E6核苷酸变异,均造成氨基酸改变。
有8例发现E7基因变异,其核苷酸A647G和T846C变异的发生率各为8812%。
A657G变异携带N29S氨基酸替代物,而T846C多态位点呈不活动态。
Luxton等9提出,HPV216E6变异与高分化CIN高度相关,尽管CIN损伤很可能发展为宫颈癌,他们认为E6变异在HPV216相关宫颈癌患者中不担负主要作用。
根据HPV对人类的危害,学者们将其分为高、低危型两大类。
2.2.1高危型(恶突性)HPV2.2.1.1疣状表皮发育不良与皮肤癌。
成年疣状表皮发育不良患者易发生皮肤癌,其癌变率高达30%50%。
好发部位多在日照前额,但此类病例较少见。
2.2.1.2宫颈、肛门、生殖器癌。
约85%的宫颈癌组织中含HPVDNA片段。
致癌型包括HPV211、16、18、31、33、35、39、45、51、52、55、56、58、59、68、70、73、82、83等亚型,其中HPV216、18和39高度致癌,可演变为鳞状上皮细胞癌。
宫颈癌病例中,尤其是侵袭性癌组织中,90%以上可检出上述HPV亚型,而HPV216和18型的检出率可达50%70%。
2.2.1.3HPV与头颈部癌。
近年研究发现,像宫颈癌一样,在口腔、咽喉和扁桃体癌组织中亦发现HPV的踪迹。
口咽和扁桃体组织中HPV216的检出率达57%。
体外研究发现,宫颈癌SiHa细胞中可检出HPV216型DNA1拷贝/细胞;
Hela细胞中可检出HPV218型DNA20拷贝/细胞。
2.2.2低危型(非恶变性)HPV2.2.2.1非恶变性HPV。
儿童和青少年手足摩擦部位的皮肤疣,如掌跖疣,主要由HPV21、2、3、4、10型引起,疣体生长缓慢,可长达数年之久,亦可突然消失。
2.2.2.2尖锐湿疣(CA)。
以外生性疣为特征,起初呈丘疹状,后生长成乳头状、菜花状,多位于阴茎、外阴、阴道、冠状沟和肛门周围,少见于宫颈。
90%皮损检查为低危型HPV26和11所致。
笔者以荧光聚合酶链反应对部分CA病例HPV26、211型的检测结果为:
HPVDNA载量中位数4127105拷贝/ml,范围41621035135108拷贝/ml,阳性检出率为4712%。
CA可持续数年,少数人可自行消退,发展为侵袭性癌变者为数虽少,但预后不良。
文献记载从初发到侵袭性癌变一般需2050年时间。
2.2.2.3良性CA。
对各种治疗均不敏感,复发率高达30%90%,2/3的性伙伴在18个月内发生CA,平均潜伏期34个月。
国外文献报告HPV26、11、40、42、53、54、57、66和84型属低危型病毒。
台湾发现HPV26b、11、MM7、61、62型在台湾人群中属低危型,而HPV216、18、MM4、31、33、39、52、53、56、58、66、68、70型等13个品系属高危型病毒。
香港学者按其危害提出了高(包括HPV216、18、45、56)、中(HPV231、33、35、51、52、58)、低(HPV26、11、42、43、44)三个危害型的分类法10,11。
北京医科大学等单位12以PCR和原位杂交法对河南省安阳的138例食道癌病例进行了HPV检查,发现高发村HPV216E6和E7基因的流行率(72%)为低发村(37%)的119倍,而两村的HPV218的检出率分别为17%和15%,因此提出HPV216在食道癌发病中亦可能担负一定作用。
3结语HPV广泛存在于自然界,对人粘膜上皮细胞具特异嗜性,早就怀疑其与泌尿生殖系尖锐湿疣有关,并具有传染性,直到1954年才证实其为STD的病原之一。
近年从皮肤粘膜、泌尿生殖系和头颈部肿瘤,如咽喉、扁桃体及食道癌组织中大量检出HPVDNA及其E6和E7基因序列,表明其组织流行病学的关系。
为了解相关疾病的分子生物学致病基础,尚待深入研究其生物特性和病理特征,方能逐步解决临床简便易行的实验诊断方法和抗HPV感染的治疗问题。
美国学者13正在研究HPV216型的疫苗,若能取得突破,就有希望预防HPV216型的感染和宫颈癌的发生。
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2004201209修回)HIV中和抗体的免疫机制、诱导和检测黑发欣综述邵一鸣审校【摘要】HIV中和抗体的研究在各方面都取得令人鼓舞的进展,为中和抗体机制疫苗的研究注入新的活力。
本文综述了中和抗体的作用机制,讨论了疫苗构建时如何广泛而有效地诱导中和抗体,并介绍了中和抗体检测技术方面的进展。
100050北京,中国疾病预防控制中心性病艾滋病中心病毒免疫室HIV的流行已成为人类健康和社会稳定的大敌,我国已进入了艾滋病快速增长期,因此迫切需要一种有效的疫苗来阻止艾滋病的流行。
但由于病毒本身高度的变异性,给疫苗设计带来层层阻力。
早期候选疫苗在激发抗体反应方面的失败,曾使科学家对中和抗体的热情大大降低;
最新研究进展表明,单克隆中和抗体及其组合使用在动物实验及I期临床试验中都取得了令人注目的突破,为中和抗体机制的艾滋病疫苗发展提供了合理基础。
现在,已经设计出很多能诱导广泛有效中和抗体的候选疫苗。
单克隆中和抗体和疫苗研究的进展要求在体外准确计量中和抗体的中和水平,以评价抗体和疫苗在实验动物及人体内的保护效果,所以,传统的中和实验技术必须进行改进,以满足理论研究进展的需要。
本文对中和抗体从产生机制、有效诱导、到准确检测进行了比较充分而新颖的论述。
1中和抗体的免疫学机制HIV进入靶细胞是由包膜糖蛋白(env)介导的。
糖蛋白最初是以多蛋白前体的形式在细胞内合成,经过翻译后修饰(例如糖基化,寡聚化,gpl202gp41亚单位蛋白水解解离等),成熟的包膜糖蛋白转运到细胞表面,gpl20和gp41以非共价键结合在一起形成二聚体结构,有功能的包膜糖蛋白可能是3个gpl202gp41二聚体形成的复合体。
Gpl20能特异结合高亲和力的细胞受体CD4,经初接触后,gpl20发生了结构改变,辅助受体的结合位点得以暴露,受体和辅助受体都结合后,包膜糖蛋白进一步发生结构变化,暴露gp41,允许gp41N2末端融合肽插入宿主细胞膜,形成gp41前发夹中间态,由于两个5国外医学病毒学分册2004年2月第11卷第1期SectionVirologyForeignMedSci,February2004,Vol11,No.1
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