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3、染色鲜明适度
染色体过染,染料堆积,使染色体模糊成一块,难以辨别细节,缺乏质感;
染色体着色过浅,使影象不鲜明,辨认不清,反差不大。
染色体染色以蓝紫为佳,色彩鲜明,胶片易感受,拍摄效果好。
一般多用铁矾苏木精染色制片。
当然,醋酸洋红和孚尔根反应也可以。
细胞质染色应浅淡,以辨清细胞质的完整轮廓为准。
常用铁矾苏木精过染,再用45%醋酸软化和分色,结果染色体着色蓝黑而鲜明,细胞质浅淡而不明显,增大了色彩的对比,扩大了影象的明暗反差。
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4、清洁无尘,消除气泡
制片中的灰尘异物和气泡,有损影象的质量,防碍观察。
气泡为临时制片的常见弊病,小的气泡有碍观瞻;
大的气泡连片,推挤染色体,堆积集中,损坏了好的影象。
要随时滴加所用的临时封固液,消除气泡。
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二、选用优质物镜和接目镜_A,Om_TI0<
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显微摄影是以接物镜和接目镜作为摄影镜头,其中接物镜尤为重要,物镜的分辨率就是显微镜的分辨率。
目镜与显微镜的分辨率无关,它只有把物镜已放大的影象进一步放大,既使是最好的目镜,也无法观察到未被物镜分辨的细节。
所以摄影时,物镜要严格选择,不可任意滥用。
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1、物镜
接物镜种类繁多,光学性能相差悬殊。
摄影时必须选用得当,绝非任一物镜皆可产生最佳影象。
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物镜由透镜组成。
单片透镜具有多种象差,一个完善的物镜,是由一组复杂的透镜组成。
按象差矫正程度,物镜可分消色差物镜,复消色差物镜,萤石物镜和平象物镜等类别。
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消色差物镜,因制造容易,是最常见的物镜。
金属外壳上不刻代表(图3-4左)。
该物镜将光谱中红光和蓝光聚焦于一点,黄绿光则聚焦于另一点。
其最佳清晰范围是在510μm(毫微米)绿光区至630μm橙光区间(图3-2Ach红)。
消色差物镜性能较差,不适于显微摄影。
因未经矫正的蓝光对感光胶片的乳剂膜非常敏感,全色胶片对未经矫正的红光也能感应。
如果必须使用时,加用黄绿色滤色片,也可获得清晰的影象。
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复消色差物镜的性能很高,能将可见光谱中的红、蓝和黄光聚焦于一点,改正了红、蓝色光的球差和其他象差。
最佳清晰范围从波长400nm至720nm(图3-2Apo线),容纳了全部可见光谱。
适于任何色光下或加用各色滤色镜摄影,更适于彩色摄影。
但是,复消色差物镜残留有象场弯曲,使平面物体形成类似球形弯曲的影象。
结果使视野中心和边缘的影象不能同时准焦,给摄影带来不便。
拍出的底片中心清晰边缘模糊或相反。
象场弯曲可以通过选用特殊的目镜加以克服矫正。
复消色差物镜的金属外壳,刻有“Apo”字样,供作识别(图3-3)。
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萤石物镜,色差校正介于消色差物镜与复消色差物镜之间,故又可称半复消色差物镜。
最佳清晰范围在波长430nm至680nm(图3-2l线),包括了绝大部分可见光谱。
适于黑白和彩色摄影,可加用各色滤色镜,物镜外壳刻有“F1”字样(图3-4右)。
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鉴于倍数愈高物镜的象场弯曲愈显著,歪曲影象,降低摄影质量,难以获得完美的底片。
现今,已研制出清除象场弯曲的一系列平象物镜。
平象物镜,校正了象正场弯曲,不存在视野中心与边缘不同时准焦的现象。
由于将影象展平,在同样倍数下,有效影象要比一般物镜的影象稍大。
为当今理想的摄影物镜,应积极选用。
平象物镜有多种类别,外壳上刻有不同的字样,以资识别。
如“Plan”(平象),“Pl”(广视野平象)、“NPl”(正常视野平象),“Planachromate”(平象消色差)、“PlApo”(平象昨消色差)等(图3-5)。
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物镜在使用时,按其前透镜与标本间介质的不同,分为干燥系和浸没系物镜。
浸没系物镜外壳前端,常刻一黑环,以便识别。
油浸物镜外壳刻有“Oel”、“Oil”、“Hl”字样;
水浸系物镜刻有“W”、“Water”;
甘油浸没系物镜刻有“Glyc”、“Glyz”,通常油浸物镜只有90×
和100×
(图3-6)高倍物镜。
个别显微镜配有63×
或40×
的中倍油浸物镜,其中尤以63×
的油浸物镜,质量最佳,非常适于显微摄影。
在焦距和数值孔径相同时,浸没物镜的象差校正比干燥物镜完善,成象质量好。
由于浸没液折射率大于空气的折射率,从而提高了物镜的分辨率。
同时,这层介质可使入射物镜的光线提高,提高视野亮度。
采用浸没物镜,可消除物镜前端透镜表面的杂乱反射光,减少有害的反射光量,使物体影象反差增加。
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2、目镜
目镜亦参与造象,把物镜映来的影象进一步扩大,并校正物镜余下的象差和色差。
目镜作为投影器,把放大的影象投射在暗箱的焦平面上。
目镜种类多,光学性能差异较大,一定类型的物镜必须选用一定类型的目镜相互组合。
绝非只要有好的物镜,随便一种目镜都可用来摄影。
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附有摄影装置的显微镜,备有摄影目镜,专用摄影,不宜作为观察用。
这种目镜能较好的校正象场弯曲,提高成象质量。
摄影目镜上刻有“Photo”、“FK”等字样。
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平象目镜也是一种适于摄影的目镜。
有专用摄影目镜,选用平象目镜配合平象物镜一起使用,可以获得很好的摄影效果。
目镜刻有“Plan”、“Periplan”、“GF”、“GW”和“Kpl”等字样。
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3、物镜与目镜组合
为提高影象质量,消除象差和色差,在选配物镜和目镜组合时,从类别上进行选择,如用平象复消色差物镜和摄影目镜或平象目镜组合使用。
此外,物镜的数值孔径和放大倍数,以及目镜的放大倍数,更要考虑这涉及有效放大率、分辨率、焦点深度和视野宽度等几个与摄影质量相关的问题。
所以,选用物镜和目镜时,要考虑下述几个问题:
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(1)有效放大率:
显微镜辨别微小物体和细节的能力,取决于分辨率,不在于放大倍数。
分辨率决定于物镜,而与目镜无关。
显微镜的有效放大率,为所用物镜数值孔径的500-1,000倍。
数值孔径常简写为N.A.,其数值刻在物镜上。
例如,使用数值孔径为0.65的40×
物镜,其有效的放大倍数为325-650倍。
为达此倍数,要选用8-16倍的目镜。
高于16×
目镜所得放大倍数叫做“空的放大”,对影象细节的分辨,没有丝毫提高。
目镜倍数太低,总放大倍数太小,物镜分辨率不能充分发挥,本来可以辨认的细节,由于总倍数太小,挤在一起难以分辨。
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(2)分辨率:
显微镜的分辨力决定于物镜数值孔径,孔径愈大,分辨率愈高。
数值孔径与物镜倍数有关,请看下列数字:
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物镜倍数
4×
10×
20×
40×
100×
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数值孔径
0.1
0.25
0.40
0.65
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上列数字表明,随着放大倍数的加大,数值孔径相应提高,分辨力随之增大,欲提高对物象细节的分辨能力和清晰度,必须使用高数值孔径的物镜。
例如,拍摄染色体减数分裂前期Ⅰ的几个影象,非用高分辨率的油镜不可,摄影目镜应视物象的大小和视野宽度,选用低倍的目镜为宜。
在这里要考虑物镜的数值孔径,不是总放大率,单纯考虑放大倍数,不顾及分辨率,就会出现摄影质量相差悬殊的结果。
例如,用100/1.25物镜与4×
目镜组合,总放大倍数为400倍,分辨距离为0.27微米;
使用40/0.65的物镜与10×
目镜组合,总放大倍数也是400倍,分辨距离下降到0.5微米。
尽管总放大倍数相同,物象微细结构的分辨力几乎相差一倍。
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(3)焦点深度和视野宽度:
焦点深度是指物象的某一点被准焦时,其清晰部分的上下距离(厚度)。
焦深大,清晰的深度大,焦深小,清晰的深度小。
染色体数目较多的植物,例如八倍体小黑麦2n=56,制片时难以把所有染色体平展一薄层,56条染色体纵横交错,散在不同的水平层次上。
因此,若缺少足够的焦点深度,难把众多的染色体清晰地反映在同一张底片上。
焦点深度与物镜的数值孔径和总放大倍数成反比。
数值孔径小,放大倍数低的物镜和目镜,焦深长,只有选用数值孔径小和放大倍数低的物镜和目镜,加长焦点深度,才能把处于不同水平层次的染色体,清晰地摄入同一张底片内。
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视野宽度与显微镜的总放大率成反比,使用高倍物镜和目镜,视野缩小,难在同一视野内容纳一个细胞的全部染色体。
改用低倍的物镜或目镜,降低总放大率,放大视野,以至能包括一个细胞的所有染色体止。
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综上所述,物镜数值孔径大,分辨率高,物象清晰,焦点深度和视野宽度降低,选用物镜和目镜主要着眼于提高物体影象的分辨率和清晰度,即选高数值孔径的平象复消色差中、高倍油浸物镜,兼顾焦点深度和视野宽度,并选用相宜的低倍摄影目镜或平象目镜。
焦深和视野不足时,适当调换物镜,降低数值孔径或放大倍数。
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三、光路合轴和光阑调整ODo__.#yB
显微摄影采用中心亮视野透射照明法,照明光束中轴与显微镜的光轴在一直线上。
光路系统始于光源,经视野光阑、孔径光阑、聚光镜、透明制片标本、物镜和目镜,将物体影象投射在暗箱的焦平面上。
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摄影前,光路要合轴调整,光束与显微镜的光轴,位于同一轴线上。
光路系统中的目镜、物镜和孔径光阑,于固定位置,勿需调整,仅聚光器可变。
因此,光路的合轴,实为聚光器的调中。
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摄影要求视野亮度非常均匀,调整光源灯位置,使之照明于视野中央。
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当前,摄影和观察普遍采用科勒(Koehler)照明法,这是一种最佳的中心亮视野照明。
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1、聚光器和光源灯的调中
摄影前,要把聚光器和光源灯调中,使聚光器中心与视野光阑的中心处于同一光轴上。
光源灯的灯丝,照明于视野中心。
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聚光器的调中步骤:
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(1)转动聚光器升降旋钮,把聚光器升至最高位置;
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(2)接通光源灯的电源开关;
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(3)将被摄的制片标本,放在载物台上,用4×
或6.3×
低倍物镜聚焦在样品上;
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(4)缩小镜座上的视野光阑,在视野中可见边缘模糊的视野光阑图象(3-7);
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(5)微降聚光器,至视野光阑的图象清晰聚焦止(图3-8);
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(6)用聚光器两个调中螺杆推动聚光器,使缩小的视野光阑图象,调至视野中心(图3-9);
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(7)开放视野光阑,使多角形周边与视野边缘相接(图9-11);
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(8)反复缩放视野光阑数次,确认光阑中心和边缘与视野完全重合;
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(9)使聚光器回复顶点位置。
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要通过视野光阑,保证视野的照明强度和均一,必须进行灯丝的调中,使投射的光束和光轴合一,其调整方法如下:
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光源灯泡拧紧在灯座上,固紧于灯室或镜座中,转动灯座或灯室上的垂直、水平调节螺丝,使灯丝调中,位于视野中心(图3-11)。
灯丝的图象,可于两处观察:
一是在视野光阑上面的滤色镜座上,放一毛玻璃或乳白滤色镜,用以观察灯丝象的位置,至调中止;
二是在物镜的后焦面上,聚焦后,从镜筒中取下目镜,在物镜的后焦面上,可见到灯丝的清晰图象。
两法当中,前法可取,简便易行。
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灯丝的调中,可结合科勒照明法一并进行。
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2、科勒照明法
科勒照明法是当今显微摄影的最佳照明法,视野照光均匀,被摄物体不受热,影象清晰。
新近的显微镜,照明系统已按科勒法设计装置,使用时稍加调整即达到最佳照明状态。
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科勒照明法是光源的灯丝在聚光器的孔径光阑上成象。
因此,也就在物镜后焦面上成象。
这样视野内照光均匀,不会烤焦被摄材料,极为有效的控制被照明的视场及其照明孔径。
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视野的照明强度,用升降电压调节。
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3、正确的使用光阑
显微镜有两种可变光阑,孔径光阑和视野光阑。
正确的调整和使用光阑是保证摄影质量的重要环节。
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(1)孔径光阑的调节使用:
孔径光阑与聚光镜是构成聚光器的两个重要部分。
显微镜的性能主要决定于物镜的性能,而物镜的性能又决定于数值孔径。
物镜的数值孔径与聚光镜的数值孔径相关,两者孔径相等时,物镜分辨力最高。
聚光镜的数值孔径受孔径光阑控制,用孔径光阑的开放与收缩,调节聚光镜数值孔径的大小。
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显微摄影不同于一般摄影,其最大的区别是影象反差小,焦深浅。
这两点可随孔径光阑缩小而提高。
孔径光阑小于物镜的数值孔径时,物象的分辨力和亮度降低,但影象反差和焦点深度提高,便影象更加清晰。
所以,在不过多地降低分辨力的前提下,把孔径光阑调到所用物镜数值孔径的60-70%大小是比较合适的。
例如,物镜的数值孔径为1.0,孔径光阑的数值调到0.6-0.7,所以,显微摄影时,缩小孔径光阑,尽管丧失少许的分辨力,却提高了影象反差、焦点深度和影象的清晰度。
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孔径光阑的调节方法:
当聚光器标有孔径的数字时,对准所需的值即妥,如果不具孔径光阑数值,在显微镜向标本聚焦后,从镜筒中取下目镜,在物镜的后透镜中可见孔径光阑影象。
光阑缩小时,仅一见一亮点,逐渐开大光阑,亮孔扩大,直至需要的程度。
当光阑缩小,视野亮度降低时,可适当提高电压增加照明强度。
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(2)视野光阑的调节:
视野光阑位于镜座之中,用以控制照明光束的直径,缩小视野光阑,光束直径小于孔径光阑,视野亮度不足,影象不清晰;
视野光阑开大,光束直径超出孔径光阑,因光线过多,造成光线的乱反射,影响影象的清晰度。
视野光阑的适宜大小,以光阑的边缘外切孔径或孔径光阑内接视野光阑为度(图3-13)。
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总之,孔径光阑的调节,取决于所用物镜数值孔径。
当两者相等,分辨力最高;
孔径光阑小于物镜的数值孔径,影象反差和焦点深度增大。
视野光阑随孔径光阑而变,总是外切孔径光阑。
更换物镜,数值孔径改变,孔径光阑重新调整,视野光阑亦随之改变。
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四、选用适宜的感光胶片_b!
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感光胶片类别多,性能相差甚大,不是每种胶片都适于显微摄影。
了解胶片的各种性能试拍后择优选用。
一经选定,不要轻易改换,以保持拍摄质量的稳定。
胶片的性能是胶片中直接决定和影拍摄质量的因素,如感色性,感光度和反差系数等,要从这些质量因素中选用适宜的胶片。
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1、感色性
是指胶片对不同色光的敏感程度,这是胶片最主要的性能。
根据感色性,可把黑白胶片分为色盲片、分色片和全色片等不同的片种。
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色盲片:
乳剂中除卤化银外未加入化学增感剂,只能感受可见光谱中的蓝紫两色,对其他各种色光不感受。
感色范围为330nm-480nm的波长区(图3-14)。
为一种低速感光片,银粒细,反差大,解象力高。
适于黑白、蓝紫等色光影象的显微摄影,不能用以拍摄红、绿和黄等色的影象。
胶片对这些色光不感受,在照片上呈黑灰一片,不能分辨。
所以,用醋酸洋红和孚尔根反应的染色体标本,不能使用色盲片摄影,铁矾苏木精制片的标本可以使用色盲片。
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分色片:
感光乳剂中加入了黄绿增感色素,除感受蓝紫色外,对黄绿二色也能感受,对红橙色光仍不能感受,感受范围为波长300μm-600μm区段(图3-15乙),除红橙色标本外,可广泛用于显微摄影,是一理想的显微摄影胶片,它不仅反差强,颗料细,并能记录出较多的亮度等级和较宽的感受范围。
用醋酸洋红染色和孚尔根反应的标本,仍不能使用分色片拍摄。
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全色片:
乳剂中添加了公演增感色素,对可见光谱的各波段色光能全部感受,故称全色片,感色范围为330-700μm(图3-15丙),共中对绿色光感应稍弱。
胶片的银粒粗、感光速度快、反差小、黑白等级多。
这些特点,会使显微摄影本来影象反差就小,黑白对比不鲜明的缺点更加突出。
照片中的染色体不黑,背景不白,呈灰暗状态,使用感光底低(ASA50以下)的全色胶片,可获良好的效果。
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2、感光度
指胶片对光线作用的敏感程度,即感光速度。
显微摄影对胶片的感光速度没有特写的要求,选用胶片时,考虑的不是速度本身,而是与感光速度相关的质量因素,凡属感光度高的胶片,乳剂的银粒粗、反差小、灰雾大、保存性差;
感光速度低的胶片、银粒细、反差大、灰雾小,保存性好。
所以,显微摄影力求使用低感光度的胶片,以便获得反差高、银粒细腻、清晰度高的摄影效果。
目前,市场供应的GB21°
(ASA50)全色胶片,不是理想的显微摄影用胶片,感光度在ASA100以下适于显微摄影。
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3、反差和反差系数
反差是指被摄物体景象中明亮部分与阴暗部分亮度差别的程度。
胶片的反差,用反差系数表示。
它是指胶片影象反差与被摄物体影象反差的比值。
即:
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若胶片上影象反差大于物体影象反差,则胶片的反差系数大于1;
胶片影象反差小于物体影象反差时,胶片的反差系数小于1。
同一视野的相同影象,用不同反差系数的胶片拍摄,能拍出不同反差效果的底片。
反差系数愈大,底片的影象反差愈强,黑白对比愈分明;
反差系数愈小,底片反差愈弱,色调灰暗,影象黑白对比不鲜明。
显微摄影选用高反差系数,对控制影象的质量是十分重要的。
应作为选用胶片的重要质量指标。
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除上所述,胶片的有效期限、乳剂号、胶片牌号和制造厂家,也是选用胶片时,加以考虑的因素。
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五、滤色镜的选用__x70+*a@
滤色镜是显微摄影必备的光学滤光元件,利用滤色镜对色光选择吸收的原理,通过控制色光,突出或抑制影象在胶片上的感应,以期获得理想的照相底片。
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黑白胶片的显微摄影,是把视野中的彩色影象,以黑白两色及其不同程度的灰色中间层次,将影象录在负片上。
利用滤色镜控制照明光束的不同色光,调整影色的色调和反差,可拍出各种不同效果的底片,甚至拍出在反差和清晰度上优于原物体影象的底片。
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一束白光,色散后形成红、橙、黄、绿、青、蓝和紫七种单色光。
这段可见光谱的波长为400-700μm,为实际应用的方便,通常将该七种色光概括为红、绿和蓝三段。
白光就是由这三种色光等量混合组成。
而红、绿和蓝色光的不等量混合,会形成各种不同的色光。
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在摄影中,通常把红色光、绿色光和蓝色光称作三原色光。
把蓝光与黄光、绿光与品红光、红光与青光称作三对互补色光,这三对互补色光分别相加皆可得到白光、黄、品红和青三色,就称为红,绿和蓝三原色的补色。
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滤色镜对各种色光有选择吸收的特性,凡与滤色镜颜色相同的色光则能透过,而与滤色镜颜色互补的色光则被吸收。
例如,绿滤色镜,在白光下把光谱中的蓝色光区段和红色光区段全部吸收,只让绿色光段的色光透过,滤色镜显示绿色。
黄滤色镜吸收蓝色光,透过红光和绿色光。
红滤色镜,把光谱中由绿到红段的光波全部吸收,只让红色的一段光透射。
蓝滤色镜吸收了由红到绿段的色光,仅让红色的一段光透射,蓝色滤色镜吸收了由红到绿段的色光,仅使蓝色光通过(图3-15)。
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在显微镜的光路上,加用滤色镜,从白光中减去与滤色镜颜色互补的色光,使改变的色光透射物体,造成影象色调和反差的改变。
显微摄影利用滤色镜提高影象的反差和清晰度,以获得理想的底片,被摄物体反射出来的色光,如果被滤色镜透过,在黑白底片上产生相应的密度,印放出照片,这部分影调,比较明亮,假若该色光被滤色镜吸收,底片上的密度就薄,制出的照片影调就暗。
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为提高影象反差,选用滤色镜的原则:
选用与被摄物体吸收的色光同一颜色的滤色镜,即选用被摄物体的补色滤色镜,则可达到理想的最佳影象对比。
因为视野中的物体影象的色调和反差,可被补色的滤色镜加强,而被同色的滤色镜所削弱。
举例说明如下:
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染色体用铁矾苏木精染色
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