索拉非尼对人肺腺癌细胞株A549抑制作用的研究讲解Word文档格式.docx
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To
was
Objective
M"ITmethodofA549
investigateusedto
thedepressanteffectsofSorafenib
ratioof
onhuman
pulmonary
adenocarcinomacell
cytometrywere
A549讯
to
ana-
detecttheanti.proliferativeThedepressanteffects
72
of
SorafenibonA549cells.flow
used
cells.ResultsSorafenib
humanpulmonaryAden.carcinomacellline
A549were
Wag1.
determinedbyMTr∞say
afterat
24h,48h.andhaftertheadditionofSorafenibA549cells.11leconcentrationofSorafenib
5mo]/L,3.Oumol/L,6.0umol/L.12.0umoI/L.SorafenibCOUldobviouslyinhibitpmliferationofA549cells。
theeffectWagatime.do∞.de.pendent
manner(P<0.05).DifierentdoseofSorafenibWastreatedA549eelIsfor72houm.apoptotie
concentration
in
ratioofAS49cells
increasod
significantly。
theeffectWagincreagedwiththedeveloped(P<0.05).Conclusions
effect
humanpulmonaryadeno.carcinomacelllineA549
vitro,the
A549/n
Wagatime-dose-dependent
increases
Sorafenib啪inhibitproliferationofmanner,andSorafenib伽promotea附
tesisofhumanpulmonaryadeno.carcinomacellline
v/tro.theeffect
withthe
developed.
【Keywords】sorafenib;
humanpulmonaryadenoearcinomacelllineA549;
proliferation;
apoptesis.
肺癌是世界上发病率最高的恶性肿瘤之一…,肺癌的75%一80%是非小细胞肺癌(NSCLC)。
NSCLC虽对放化疗敏感,但化疗药物毒副作用较大,且易产生耐药和出现复发、转移。
近年来,靶向药物治疗日益受到关注,索拉非尼(Sot-afenib)是2005年美国FDA批准上市的一种口服多激酶抑制剂,能抑制丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(RAF)、血管内皮生长因子受体-2(VEGFR-2)、血管内皮生长因子受体_3(VEGFR-3)、血小板衍生生长因子受体-p(PDGFR-p)等激酶或受体活性,具有同时抑制肿瘤细胞增殖和血管生成的双重作用,对肾癌、肝癌、NSCLC等有一定治疗作用。
本研究观察Sorafenib对人肺腺癌细胞株A549(NSCLC其中的一种病理类型)增殖的影响,为临床应用提供新的治疗思路和实验依据。
材料与方法
一、细胞株及试剂肺腺癌细胞株A549,河北医科大学第四医院;
Sorafenib,拜耳公司,用100%二甲基巫砜(DMSO)溶解,一20℃保存。
实验时稀释,DMSO终浓度<0.5%;
MTY,华美生物技术有限公司,用磷酸盐缓冲液(PBS)配制成浓度为5ms/nll,一20。
C保存;
DMSO,成都天泰公司;
碘化丙锭(PI)试剂盒,Sigma公司;
AnnexinV.EGFP试剂盒,南京凯基生物科技发展有限公司。
二、细胞培养
A549细胞培养在37℃、饱和湿度5%
CO:
的培养箱中,培养基为含10%新生牛血清、1%双抗(青霉素、链霉紊)的RPMI.1640,2—3d传代一次,取对数生长期细胞用于实验。
作者单位:
067000河北承德,承德医学院附属医院放化疗科通讯作者:
吕喜荚,E-mail:
xiyinglv@sina.com
12.0
三、MTT法测细胞增殖率的变化取对数生长期A549细胞,以2×
103/孔的密度接种于96孔板,培养24h后加入药物Sorafenib。
Sorafenib药物浓度分别为1.5、3.0、6.0、12.0pLmol/L,每组设6个复孔,加药后分别培养24、48、72h后,每孔加MTT(5mg/m1)20m,37℃继续培养4h,吸净原培养液,加入DMSO150山/孔,振荡10
min,用酶标仪(波长490啪)
测定每孔的OD值,计算抑制率。
以空白细胞组为对照,其细胞存活率为100%。
抑制率计算公式:
抑制率(%)=(对照组0D值-实验组OD值)/对照组OD值×
100%。
四、流式细胞仪检测细胞凋亡率
取对数生长期A549
细胞,培养24h后加入药物,药物浓度分别为1.5、3.0、6.0、
p,mol/L,加药后培养72h收集各组细胞上流式细胞仪
x
检测凋亡率:
调整细胞浓度为5105/ml,分别加入Annexin
V
3一、PI5一,室温避光反应10min,上机枪测细胞凋亡率。
五、统计学分析所有数据资料以均数4-标准差鼻±
s表示。
采用SPSS11.5统计软件进行分析,采用单因素方差分析,P<O.05为差异有显著性。
结
果
MrI-I.结果
一、¥orafenib对A549细胞增殖的抑制作用
显示Sorafenib在1.5~12ⅣnoL/L浓度范围内能明显抑制A549细胞的生长,呈时间-剂量依赖性。
随着用药时间延长,抑制率明显上升(P<0.05)。
相同时间点,随着药物浓度的增加,抑制率也明显上升(P<0.05)。
结果见表l一3,图1。
二、流式细胞仪检测细胞凋亡率
流式细胞仪检测细胞
凋亡结果表明,Sorafenib在1.5—12.0tLmol/L浓度范围内,分别作用于人肺腺癌细胞株A549细胞72h后,凋亡率为5.1%一23.34%。
实验组A549细胞的凋亡率较空白对照组
万方数据
729
的凋亡率显著提高,随着药物浓度的升高。
凋亡率明显上升,呈剂最依赖效应(P<0.05)。
表明Sorafenib有促进或诱导A549细胞凋亡的作用。
结果见表4。
襄l不同浓度Sorsfenib作用24h后A549细胞抑制率(;
±
1)组别
OD值
抑制率(%)
正常对照组0.568±
0.005
1001.5
p血ol/L
0.486±
0.00414.4±
1.303pmol/L0.4064.0.00128.5±
O.6“6iLmoL/L
0.346±
0.00339.2±
0.9“
12
p.mol/L
0.303±
46.6±
1.OIb
与正常对照组比较,‘P<O.05。
组见比较“P<0.05
表2不同浓度Sorafenib作用鹌h后A549细胞抑制率(x±
s)组别
正常对照组0.694±
0.002
100
1.5i^mol/l0.559±
0.00219.5
4-0.20
3pmol/l0.435±
0.0237.3士0.4“6斗moVl0.356±
0.00248.6±
0.3.b12“moVl
0.312±
0.001
55.0±
0.40
与正常对照组比较,4P<O.05。
表3不同浓度Sorafenib作用72h后A549细胞抑制率(z士s)组别
正常对照组0.852±
1.5岬ol/L
0.604±
0.00229.2±
0.1“
3IxmoVL0.477±
0.00943.4±
0.2,b
6DmoVL
0.366士0.001
57.I±
0.1“12
p,mol/L
0.324±
0.00l
62.0±
与正常对照组比较,1P<0.05。
图1
不同时间不同浓度Sorafenib对脚细胞的抑制作用
裹4不同浓度Sorafemb作用72h后A549细胞的凋亡率(;
j,%)组别
凋亡率(%)
正常对照组
2.20
4.0.46
1.5斗moVL5.10±
0.473“raol/L
7.97±
1.266i上nwl/L16.21±
0.7112
23.34●__‘_一1____●_---___o__-__●_________________●‘______■■●■■■■■■__________■__●_____________________-_______●________●_●_____■_________一
tLmol/1。
4-0.88
与对照组比较:
P<0.05
讨论
Sorafenib作为一种多靶点分子靶向药物,对肿瘤的作用是通过多靶点实现的。
其通过抑制RAF的活性从而抑制RAS/RAF/MEK/ERK信号传导通路,直接抑制肿瘤细胞生长;
通过抑制血管内皮生长因子(VEGF)和血小板衍生生长因子(PDGF)活性,从而抑制肿瘤新血管生成。
间接地抑制肿瘤细胞的生长。
另外Sorafenib还可抑制细胞周期蛋白及细胞周期相关蛋白(如CyelinDl、cdk4、cdk6)旧。
o的表达,阻断
细胞周期的进展,从而诱导肿瘤细胞凋亡瞪J。
美国FDA已于2005年12月20日批准Sorafenib用于治疗晚期肾细胞癌。
同年批准其为治疗肝癌的孤儿药。
大量临床研究的初步结果表明,Sorafenib对肝癌、黑色素瘤、NSCLC和卵巢癌等实体瘤均有一定的抗肿瘤作用。
Gatzemeier等哺】开展的一项多中心Ⅱ期临床试验,以研究Sorafenib单药治疗54例复发或难治性NSCLC。
其中29%为MR,59%病例达SD;
51例中位无进展生存期与总生存期分别为11.9周与29.3周。
很多临床研究进一步证明Sorafenib对NSCLC有一定疗效,可单独或联合用于治疗中晚期肺癌。
目前Sorafenib治疗NSCLC的Ⅲ期I临床试验正在进行中。
本实验就是旨在研究Sorafenib在体外对人肺腺癌细胞株A549增殖以及凋亡的影响,为Sorafenib临床应用十肺癌提供新的实验依据。
我们参考文加斌¨
1和崔彦芝【8j等的实验结果设计了本研究药物剂量和药物作用时间,以终浓度分别为1.5、3.0、
6.0、12.0斗咖L/L,作用于A549细胞,通过Mrll’法和流式细
胞仪检测增殖抑制率和细胞凋亡率,以研究Sorafenib对人肺腺癌细胞株AS49的抑制作用。
本研究结果表明,Sorafenib能明显抑制A549细胞增殖,呈时间-剂量依赖性,随着用药时间延长,抑制率明显上升。
相同时间点,随着药物浓度的增加,抑制率也明屁上升。
Sorafenib也能诱导A549细胞凋亡,随着药物浓度的升高,凋亡率明显上升,呈剂量依赖效应。
总之,本研究结果表明:
Sorafenib对人肺腺癌细胞株A549具有明显的抑制其增殖和促进其凋亡作用,进而抑制A549细胞的生长。
这为Sorafenib临床用于治疗NSCLC提供了实验依据。
Sorafenib作为第一个批准上市的口服酪氨酸激酶抑制剂,必将在肺癌靶向治疗中有广阔的应用前景。
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[收稿日期:
2010—12—13】
索拉非尼对人肺腺癌细胞株A549抑制作用的研究
作者:
刊名:
英文刊名:
年,卷(期):
张媛媛,吕喜英,ZHANGYuan-yuan,L(U)Xi-ying承德,承德医学院附属医院放化疗科,河北,067000临床肺科杂志JOURNALOFCLINICALPULMONARYMEDICINE2011,16(5)
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