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生物化学实验讲义DOC
生化实验讲义
综合型实验
生物科学与工程学院
溶菌酶的提取和系列性质测定
在研究酶的性质、作用、反应动力学等问题时都需要使用高度纯化的酶制剂以避免干扰。
酶的提纯工作往往要求多种方法交替应用,才能得到较为满意的效果。
常用的提纯方法有盐析、有机溶剂沉淀、选择性变性、离子交换层析、凝胶过滤、亲和层析等。
酶蛋白在分离提纯过程中易变性失活,为能获得尽可能高的产率和纯度,在提纯操作中要始终注意保持酶的活性如在低温下操作等,这样才能收到较好的分离提纯效果。
溶菌酶又称胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶、球蛋白G,是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。
主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键,使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽,导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。
溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合,与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐,使病毒失活。
溶菌酶相对分子质量约为1.44×104,是一种强碱性蛋白质,等电点在10.0以上,并对温度和酸不敏感。
在自然界中,普遍存在于鸟类和家禽的蛋清中,哺乳动物的泪、唾液、血浆、尿液、淋巴液等细胞中,植物卷心菜、萝卜、木瓜等,以蛋清含量最丰富,约为0.3%。
本实验用鸡蛋为原理,通过阳离子交换层析,硫酸铵沉淀,分子筛层析等步骤提取溶菌酶。
实验安排
第一天实验理论
第二天配试剂、离子交换剂的再生、平衡
第三天蛋清样品上样、洗脱、硫酸铵沉淀
第四天分子筛层析
第五天酶活和蛋白浓度的测定
第六天酶促动力学
第七天SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
生化技术重要理论
蛋白质提取分离技术
以蛋白质和结构与功能为基础,从分子水平上认识生命现象,已经成为现代生物学发展的主要方向,研究蛋白质,首先要得到高度纯化并具有生物活性的目的物质。
蛋白质的制备工作涉及物理、化学和生物等各方面知识,但基本原理不外乎两方面。
一是得用混合物中几个组分分配率的差别,把它们分配到可用机械方法分离的两个或几个物相中,如盐析,有机溶剂提取,层析和结晶等;二是将混合物置于单一物相中,通过物理力场的作用使各组分分配于来同区域而达到分离目的,如电泳,超速离心,超滤等。
在所有这些方法的应用中必须注意保存生物大分子的完整性,防止酸、硷、高温,剧烈机械作用而导致所提物质生物活性的丧失。
蛋白质的制备一般分为以下四个阶段:
选择材料和预处理,细胞的破碎及细胞器的分离,提取和纯化,浓细、干燥和保存。
微生物、植物和动物都可做为制备蛋白质的原材料,所选用的材料主要依据实验目的来确定。
对于微生物,应注意它的生长期,在微生物的对数生长期,酶和核酸的含量较高,可以获得高产量,以微生物为材料时有两种情况:
(1)得用微生物菌体分泌到培养基中的代谢产物和胞外酶等;
(2)利用菌体含有的生化物质,如蛋白质、核酸和胞内酶等。
植物材料必须经过去壳,脱脂并注意植物品种和生长发育状况不同,其中所含生物大分子的量变化很大,另外与季节性关系密切。
对动物组织,必须选择有效成份含量丰富的脏器组织为原材料,先进行绞碎、脱脂等处理。
另外,对预处理好的材料,若不立即进行实验,应冷冻保存,对于易分解的生物大分子应选用新鲜材料制备。
1.蛋白质的分离纯化
1.1蛋白质(包括酶)的提取
大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液,少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中,因些,可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。
1.1.1水溶液提取法
稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂,通常用量是原材料体积的1-5倍,提取时需要均匀的搅拌,以利于蛋白质的溶解。
提取的温度要视有效成份性质而定。
一方面,多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大,因此,温度高利于溶解,缩短提取时间。
但另一方面,温度升高会使蛋白质变性失活,因此,基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采用低温(5度以下)操作。
为了避免蛋白质提以过程中的降解,可加入蛋白水解酶抑制剂(如二异丙基氟磷酸,碘乙酸等)。
下面着重讨论提取液的pH值和盐浓度的选择。
(1)pH值
蛋白质,酶是具有等电点的两性电解质,提取液的pH值应选择在偏离等电点两侧的pH范围内。
用稀酸或稀碱提取时,应防止过酸或过碱而引起蛋白质可解离基团发生变化,从而导致蛋白质构象的不可逆变化,一般来说,碱性蛋白质用偏酸性的提取液提取,而酸性蛋白质用偏碱性的提取液。
(2)盐浓度
稀浓度可促进蛋白质的溶,称为盐溶作用。
同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合,具有保护蛋白质不易变性的优点,因此在提取液中加入少量NaCl等中性盐,一般以0.15摩尔。
升浓度为宜。
缓冲液常采用0.02-0.05M磷酸盐和碳酸盐等渗盐溶液。
1.1.2有机溶剂提取法
一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶,不溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中,可用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂,它们具的一定的亲水性,还有较强的亲脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。
但必须在低温下操作。
丁醇提取法对提取一些与脂质结合紧密的蛋白质和酶特别优越,一是因为丁醇亲脂性强,特别是溶解磷脂的能力强;二是丁醇兼具亲水性,在溶解度范围内不会引起酶的变性失活。
另外,丁醇提取法的pH及温度选择范围较广,也适用于动植物及微生物材料。
1.2蛋白质的分离纯化
蛋白质的分离纯化方法很多,主要有:
1.2.1.根据蛋白质溶解度不同的分离方法
1.2.1.1蛋白质的盐析
中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响,一般在低盐浓度下随着盐浓度升高,蛋白质的溶解度增加,此称盐溶;当盐浓度继续升高时,蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出,这种现象称盐析,将大量盐加到蛋白质溶液中,高浓度的盐离子(如硫酸铵的SO4和NH4)有很强的水化力,可夺取蛋白质分子的水化层,使之“失水”,于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。
盐析时若溶液pH在蛋白质等电点则效果更好。
由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同,故盐析所需的盐浓度也不一样,因此调节混合蛋白质溶液中的中性盐浓度可使各种蛋白质分段沉淀。
影响盐析的因素有:
(1)温度:
除对温度敏感的蛋白质在低温(4度)操作外,一般可在室温中进行。
一般温度低蛋白质溶介度降低。
但有的蛋白质(如血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白)在较高的温度(25度)比0度时溶解度低,更容易盐析。
(2)pH值:
大多数蛋白质在等电点时在浓盐溶液中的溶介度最低。
(3)蛋白质浓度:
蛋白质浓度高时,欲分离的蛋白质常常夹杂着其他蛋白质地一起沉淀出来(共沉现象)。
因此在盐析前血清要加等量生理盐水稀释,使蛋白质含量在2.5-3.0%。
蛋白质盐析常用的中性盐,主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。
其中应用最多的硫酸铵,它的优点是温度系数小而溶解度大(25度时饱和溶液为4.1M,即767克/升;0度时饱和溶解度为3.9M,即676克/升),在这一溶解度范围内,许多蛋白质和酶都可以盐析出来;另外硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好,不易引起蛋白质变性。
硫酸铵溶液的pH常在4.5-5.5之间,当用其他pH值进行盐析时,需用硫酸或氨水调节。
蛋白质在用盐析沉淀分离后,需要将蛋白质中的盐除去,常用的办法是透析,即把蛋白质溶液装入秀析袋内(常用的是玻璃纸),用缓冲液进行透析,并不断的更换缓冲液,因透析所需时间较长,所以最好在低温中进行。
此外也可用葡萄糖凝胶G-25或G-50过柱的办法除盐,所用的时间就比较短。
1.2.1.2等电点沉淀法
蛋白质在静电状态时颗粒之间的静电斥力最小,因而溶解度也最小,各种蛋白质的等电点有差别,可利用调节溶液的pH达到某一蛋白质的等电点使之沉淀,但此法很少单独使用,可与盐析法结合用。
1.2.1.3低温有机溶剂沉淀法
用与水可混溶的有机溶剂,甲醇,乙醇或丙酮,可使多数蛋白质溶解度降低并析出,此法分辨力比盐析高,但蛋白质较易变性,应在低温下进行。
1.2.2根据蛋白质分子大小的差别的分离方法
1.2.2.1透析与超滤
透析法是利用半透膜将分子大小不同的蛋白质分开。
超滤法是利用高压力或离心力,强使水和其他小的溶质分子通过半透膜,而蛋白质留在膜上,可选择不同孔径的膜截留不同分子量的蛋白质。
1.2.2.2凝胶过滤法
也称分子排阻层析或分子筛层析,这是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一。
柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝胶(Sephadexgel)和琼脂糖凝胶(agarosegel)。
1.2.3根据蛋白质带电性质进行分离
蛋白质在不同pH环境中带电性质和电荷数量不同,可将其分开。
1.2.3.1电泳法
各种蛋白质在同一pH条件下,因分子量和电荷数量不同而在电场中的迁移率不同而得以分开。
值得重视的是等电聚焦电泳,这是利用一种两性电解质作为载体,电泳时两性电解质形成一个由正极到负极逐渐增加的pH梯度,当带一定电荷的蛋白质在其中泳动时,到达各自等电点的pH位置就停止,此法可用于分析和制备各种蛋白质。
1.2.3.2离子交换层析法
离子交换剂有阳离子交换剂(如:
羧甲基纤维素;CM-纤维素)和阴离子交换剂(二乙氨基乙基纤维素;DEAE?
FONTFACE="宋体"LANG="ZH-CN">纤维素),当被分离的蛋白质溶液流经离子交换层析柱时,带有与离子交换剂相反电荷的蛋白质被吸附在离子交换剂上,随后用改变pH或离子强度办法将吸附的蛋白质洗脱下来。
1.2.4根据配体特异性的分离方法-亲和色谱法
亲和层析法(aflinitychromatography)是分离蛋白质的一种极为有效的方法,它经常只需经过一步处理即可使某种待提纯的蛋白质从很复杂的蛋白质混合物中分离出来,而且纯度很高。
这种方法是根据某些蛋白质与另一种称为配体(Ligand)的分子能特异而非共价地结合。
其基本原理:
蛋白质在组织或细胞中是以复杂的混合物形式存在,每种类型的细胞都含有上千种不同的蛋白质,因此蛋白质的分离(Separation),提纯(Purification)和鉴定(Characterization)是生物化学中的重要的一部分,至今还没的单独或一套现成的方法能移把任何一种蛋白质从复杂的混合蛋白质中提取出来,因此往往采取几种方法联合使用。
1.3细胞的破碎
1.3.1高速组织捣碎:
将材料配成稀糊状液,放置于筒内约1/3体积,盖紧筒盖,将调速器先拨至最慢处,开动开关后,逐步加速至所需速度。
此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。
1.3.2玻璃匀浆器匀浆:
先将剪碎的组织置于管中,再套入研杆来回研磨,上下移动,即可将细胞研碎,此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高,适用于量少和动物脏器组织。
1.3.3超声波处理法:
用一定功率的超声波处理细胞悬液,使细胞急剧震荡破裂,此法多适用于微生物材料,用大肠杆菌制备各种酶,常选用50-100毫克菌体/毫升浓度,在1KG至10KG频率下处理10-15分钟,此法的缺点是在处理过程会产生大量的热,应采取相应降温措施。
对超声波敏感和核酸应慎用。
1.3.4反复冻融法:
将细胞在-20度以下冰冻,室温融解,反复几次,由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀,使细胞结构破碎。
1.3.5化学处理法:
有些动物细胞,例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠(SDS)、去氧胆酸钠等细胞膜破坏,细菌细胞壁较厚,可采用溶菌酶处理效果更好。
无论用哪一种方法破碎组织细胞,都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中,使大分子生物降解,导致天然物质量的减少,加入二异丙基氟磷酸(DFP)可以抑制或减慢自溶作用;加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性,加入苯甲磺酰氟化物(PMSF)也能清除蛋白水解酥活力,但不是全部,还可通过选择pH、温度或离子强度等,使这些条件都要适合于目的物质的提取。
1.4浓缩、干燥及保存
1.4.1样品的浓缩
生物大分子在制备过程中由于过柱纯化而样品变得很稀,为了保存和鉴定的目的,往往需要进行浓缩。
常用的浓缩方法的:
1.4.1.1减压加温蒸发浓缩
通过降低液面压力使液体沸点降低,减压的真空度愈高,液体沸点降得愈低,蒸发愈快,此法适用于一些不耐热的生物大分子的浓缩。
1.4.1.2空气流动蒸发浓缩
空气的流动可使液体加速蒸发,铺成薄层的溶液,表面不断通过空气流;或将生物大分子溶液装入透析袋内置于冷室,用电扇对准吹风,使透过膜外的溶剂不沁蒸发,而达到浓缩目的,此法浓缩速度慢,不适于大量溶液的浓缩。
1.4.1.3.冰冻法
生物大分子在低温结成冰,盐类及生物大分子不进入冰内而留在液相中,操作时先将待浓缩的溶液冷却使之变成固体,然后缓慢地融解,利用溶剂与溶质融点介点的差别而达到除去大部分溶剂的目的。
如蛋白质和酶的盐溶液用此法浓缩时,不含蛋白质和酶的纯冰结晶浮于液面,蛋白质和酶则集中于下层溶液中,移去上层冰块,可得蛋白质和酶的浓缩液。
1.4.1.4.吸收法
通过吸收剂直接收除去溶液中溶液分子使之浓缩。
所用的吸收剂必需与溶液不起化学反应,对生物大分子不吸附,易与溶液分开。
常用的吸收剂有聚乙二醇,聚乙稀吡咯酮、蔗糖和凝胶等,使用聚乙二醇吸收剂时,先将生物大分子溶液装入半透膜的袋里,外加聚乙二醇复盖置于4度下,袋内溶剂渗出即被聚乙二醇迅速吸去,聚乙二醇被水饱和后要更换新的直至达到所需要的体积。
1.4.1.5.超滤法
超滤法是使用一种特别的薄膜对溶液中各种溶质分子进行选择性过滤的方法,不液体在一定压力下(氮气压或真空泵压)通过膜时,溶剂和小分子透过,大分子受阻保留,这是近年来发展起来的新方法,最适于生物大分子尤其是蛋白质和酶的浓缩或脱盐,并具有成本低,操作方便,条件温和,能较好地保持生物大分子的活性,回收率高等优点。
应用超滤法关键在于膜的选择,不同类型和规格的膜,水的流速,分子量截止值(即大体上能被膜保留分子最小分子量值)等参数均不同,必须根据工作需要来选用。
另外,超滤装置形式,溶质成份及性质、溶液浓度等都对超滤效果的一定影响。
Diaflo超滤膜的分子量截留值:
膜名称
分子量截留值
孔的大的平均直径
XM-300
300,000
140
XM-200
100,000
55
XM-50
50,000
30
PM-30
30,000
22
UM-20
20,000
18
PM-10
10,000
15
UM-2
1,000
12
UM05
500
10
用上面的超滤膜制成空心的纤维管,将很多根这样的管拢成一束,管的两端与低离子强度的缓冲液相连,使缓冲液不断地在管中流动。
然后将纤维管浸入待透析的蛋白质溶液中。
当缓冲液流过纤维管时,则小分子很易透过膜而扩散,大分子则不能。
这就是纤维过滤秀析法,由于透析面积增大,因而使透析时间缩短10倍。
1.4.2干燥
生物大分子制备得到产品,为防止变质,易于保存,常需要干燥处理,最常用的方法是冷冻干燥和真空干燥。
真空干燥适用于不耐高温,易于氧化物质的干燥和保存,整个装置包括干燥器、冷凝器及真空干燥原理外,同时增加了温度因素。
在相同压力下,水蒸汽压随温度下降而下降,故在低温低压下,冰很易升华为气体。
操作时一般先将待干燥的液体冷冻到冰点以下使之变成固体,然后在低温低压下将溶剂变成气体而除去。
此法干后的产品具有疏松、溶解度好、保持天然结构等优点,适用于各类生物大分子的干燥保存。
1.4.3贮存
生物大分子的稳定性与保存方法的很大关系。
干燥的制品一般比较稳定,在低温情况下其活性可在数日甚至数年无明显变化,贮藏要求简单,只要将干燥的样品置于干燥器内(内装有干燥剂)密封,保持0-4度冰箱即可,液态贮藏时应注意以下几点:
1.4.3.1.样品不能太稀,必须浓缩到一定浓度才能封装贮藏,样品太稀易使生物大分子变性。
1.4.3.2.一般需加入防腐剂和稳定剂,常用的防腐剂有甲苯、苯甲酸、氯仿、百里酚等。
蛋白质和酶常用的稳定剂有硫酸铵糊、蔗糖、甘油等,如酶也可加入底物和辅酶以提高其稳定性。
此外,钙、锌、硼酸等溶液对某些酶也有一定保护作用。
核酸大分子一般保存在氯化钠或柠檬酸钠的标准缓冲液中。
1.4.3.3.贮藏温度要求低,大多数在0度左右冰箱保存,有的则要求更低,应视不同物质而定。
2.柱层析技术
2.1概述
柱层析技术也称柱色谱技术。
一根柱子里先填充不溶性基质形成固定相,将蛋白质混合样品加到柱子上后用特别的溶剂洗脱,溶剂组成流动相。
在样品从柱子上洗脱下来的过程中,根据蛋白质混合物中各组分在固定向和流动相中的分配系数不同经过多次反复分配,将不同蛋白组分逐一分离。
根据填充基质和样品分配交换原理不同,离子交换层析,凝胶过滤层析和亲和层析是三种分离蛋白质的经典层析技术。
在利用柱层析技术分离提取蛋白质的过程中,主要有以下几个方面的流程。
2.1.1柱层析操作方法的选择
目前,柱色谱分离的操作方式,主要包括常压分离、减压分离和加压分离3种模式。
常压分离是最简单的分离模式方便、简单,但是洗脱时间长。
减压分离尽管能节省填料的使用量,但是由于大量的空气通过填料会使溶剂挥发,并且有时在柱子外面会有水汽凝结,以及有些易分解的化合物也难以得到,而且还必须同时使用水泵或真空泵抽气。
加压分离可以加快淋洗剂的流动速度,缩短样品的洗脱时间,是一种比较好的方法,与常压柱类似,只不过外加压力使淋洗液更快洗脱。
压力的提供可以是压缩空气,双连球或者小气泵等。
2.1.2柱子规格的选择
市场上有各种规格的柱层析分离柱。
柱子长了,相应的塔板数就高,分离就好。
目前市场上的柱子,其径高比一般在1:
5~10范围,在实际使用时,填料量一般是样品量的30~40倍,具体的选择要根据样品的性质和含量进行具体分析。
如果所需组分和杂质的分离度较大,就可以减少填料量,使用内径相对较小的柱子(如2cm×20cm的柱子);如果Rf相差不到0.1,就要加大柱子,增加填料量,比如用3cm内径的柱子。
2.1.3装柱
柱层析色谱柱的填装主要有湿法和干法两种,湿法省事,一般用淋洗剂溶解样品,也可以用二氯甲烷、乙酸乙酯等,但溶剂越少越好,不然溶剂就成了淋洗剂了。
柱子底端的活塞一定不要涂润滑剂,否则会被淋洗剂带到淋洗液中,可以采用聚四氟乙烯材料的阀门。
干法和湿法装柱没什么实质性差别,只要能把柱子装实就行。
装完的柱子应该有适度的紧密(太密了淋洗剂流速太慢),并且一定要均匀,不然样品就会从一侧斜着流动。
同时柱中不能有大气泡,大多数情况下有些小气泡没太大的影响,因为只要加压气泡就可消失。
但是柱子更忌讳的是开裂,开裂会影响分离效果,甚至报废。
2.1.4溶剂的选择
选择一个合适的溶剂系统是柱层析分离的关键。
在选用柱层析洗脱剂时首先要考虑三个方面的因素:
溶解性(Solubil2ity)、亲合性(Affinity)和分离度(Resolution)。
溶剂应选择价廉、安全、环保的,可以考虑石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、乙醚、甲醇和正己烷等等。
但正己烷价格较高,乙醚很易挥发,二氯甲烷和甲醇与硅胶的吸附是一个放热过程,易使柱子产生气泡。
其他的溶剂用的相对较少,要依不同需要选择。
另外值得一提的是,由于我们进行的是痕量分析,淋洗剂的纯度必须关注,一般使用农药残留级或HPLC级的,如果是分析纯的必须进行精制。
同时溶剂在过柱后最好回收使用,一方面环保,另一方面也能节省部分经费。
2.1.5上样
用少量的溶剂溶解样品加样,加完后将底端的活塞打开,待溶剂层下降至石英砂面时,再加少量的低极性溶剂,然后再打开活塞,如此两三次,一般石英砂就基本是白色的了。
加入淋洗剂,一开始不要加压,等溶解样品的溶剂和样品层有一段距离(2~4cm),再加压,这样避免了溶剂(如二氯甲烷等)夹带样品快速下行。
很多样品在上柱前粘性较大,上样后在柱上又会析出,这一般都是比较大量的样品才会出现,是因为填料对样品的吸附饱和所致。
有些样品溶解性差,能溶解的溶剂(比如DMF,DMSO等)又不能上柱,这样就必须用干法上柱了。
2.1.6淋洗液的收集和浓缩
用硅胶作固定相过柱子的原理是一个吸附与解吸的平衡。
如果样品与硅胶的吸附比较强的话,就不容易流出,这时可以采用氧化铝作固定相。
柱层析后的淋洗液,由于使用了较多的溶剂,必须进行浓缩,如果待测物具有一定的挥发性,最好使用常压挥发溶剂,否则易导致检测结果偏低。
2.2离子交换层析
离子交换层析(IonExchangeChromatography简称为IEC)是以离子交换剂为固定相,依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。
1848年,Thompson等人在研究土壤碱性物质交换过程中发现离子交换现象。
本世纪40年代,出现了具有稳定交换特性的聚苯乙烯离子交换树脂。
50年代,离子交换层析进入生物化学领域,应用于氨基酸的分析。
目前离子交换层析仍是生物化学领域中常用的一种层析方法,广泛的应用于各种生化物质如氨基酸、蛋白、糖类、核苷酸等的分离纯化。
常用的离子交换剂有:
离子交换纤维素、离子交换葡聚糖和离子交换树脂。
离子交换层析中,基质是由带有电荷的树脂或纤维素组成。
带有正电荷的称之阴离子交换树脂;而带有负电荷的称之阳离子树脂。
离子交换层析同样可以用于蛋白质的分离纯化。
由于蛋白质也有等电点,当蛋白质处于不同的pH条件下,其带电状况也不同。
阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质,所以这类蛋白质被留在柱子上,然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施,将吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来。
结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。
反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质,结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来。
2.2.1.预处理及装柱:
对于离子交换纤维素要用流水洗去少量碎的不易沉淀的颗粒,以保证有较好的均匀度,对于已溶胀好的产品则不必经这一步骤。
溶胀的交换剂使用前要用稀酸或稀碱处理,使之成为带H+或OH-的交换剂型。
阴离子交换剂常用“碱-酸-碱”处理,使最终转为-OH-型或盐型交换剂;对于阳离子交换剂则用“酸-碱-酸”处理,使最终转为-H-型交换剂。
洗涤好的纤维素使用前必须平衡至所需的pH和离子强度。
已平衡的交换剂在装柱前还要减压除气泡。
为了避免颗粒大小不等的交换剂在自然沉降时分层,要适当加压装柱,同时使柱床压紧,减少死体积,有利于分辨率的提高。
柱子装好后再用起始缓冲液淋洗,直至达到充分平衡方可使用。
2.2.2.加样与洗脱加样:
层析所用的样品应与起始缓冲液有相同的pH和离子强度,所选定的pH值应落在交换剂与被结合物有相反电荷的范围,同时要注意离子强度应低,可用透析、凝胶过滤或稀释法达此目的。
样品中的不溶物应在透析后或凝胶过滤前,以离心法除去。
为了达到满意的分离效果,上样量要适当,不要超过柱的负荷能力。
柱的负荷能力可用交换容量来推算,通常上样量为交换剂交换总量的1%-5%。
洗脱:
已结合样品的离子交换前,可通过改变溶液的pH或改变离子强度的方法将结合物洗脱,也可同时改变pH与离子强度。
为了使复杂的组份分离完全,往往需要逐步改变pH或离子强度,其中最简单的方法是阶段洗脱法,即分次将不同pH与离子强度的溶液加入,使不同成分逐步洗脱。
由于这种洗脱pH与离子强度的变化大,使许多洗脱体积相近的成分同时洗脱,纯度较差,不适宜精细的分离。
最好的洗脱方法是连续梯度洗脱,两个容器放于同一水平上,第一个
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