高级生化历年考试题Word文档格式.docx
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对角线电泳:
用于分析混合物中某一组分对某些化学处理或光处理后变化的双向电泳技术。
样品加样后先从一个方向进行电泳分离,经化学或光处理后,再以与第一次电泳垂直方向进行第二次电泳分离,则经过处理未被修饰的组分皆位于电泳图谱的对角线上。
化学酶工程:
也称初级酶工程是指天然酶、化学修饰酶、固定化酶及人工模拟酶的研究和应用。
生物酶工程:
是用生物学方法,特别是基因工程、蛋白质工程和组合库筛选法改造天然酶,创造性能优异的新酶;
它是酶学和以DNA重组技术为主的现代分子生物学技术相结合的产物。
酶提取的回收率:
每次提纯后酶制剂总活力与提取液的总活力的百分比。
1,miRNA和siRNA,及其功能(网上搜索所得)
SiRNA的主要特征:
长约21到23nt
;
双链的3’端各有2个或3个突出的核苷酸;
5’端磷酸化,3’端为自由的-OH基团。
siRNA可作为一种特殊引物,在RNA指导的RNA聚合酶作用下,以靶mRNA为模板合成dsRNA,后者可被降解形成新的siRNA,新生成的siRNA又可进入上述循环。
这种过程称为随机降解性多聚酶链反应。
MicroRNA
(miRNA):
是含有茎环结构的miRNA前体,经过Dicer加工之后的一类非编码的小RNA分子(~21-23个核苷酸)。
MiRNA,以及
miRISCs(RNA-蛋白质复合物)在动物和植物中广泛表达。
因之具有破坏目标特异性基因的转录产物或者诱导翻译抑制的功能,miRNA被认为在调控
发育过程中有重要作用。
miRNA的特点:
广泛存在于真核生物中,
是一组不编码蛋白质的短序列RNA
它本身不具有开放阅读框架(ORF)
通常的长度为20~24
nt
但在3′端可以有1~2
个碱基的长度变化;
成熟的miRNA
5′端有一磷酸基团,
3′端为羟基,
这一特点使它与大多数寡核苷酸和功能RNA
的降解片段区别开来;
多数miRNA
还具有高度保守性、时序性和组织特异性。
2,核酸结构与功能的关系。
3,什么是southern杂交,怎样控制其严紧程度。
(不准确)
southern印记法是将凝胶上分离的DNA片段,转移到硝酸纤维素膜上后,再通过同位素标记的单链DNA或RNA探针的杂交作用检测这些被转移的DNA片段的方法。
分子杂交的严紧程度主要取决于复性温度及溶液中盐与甲酰胺的浓度。
强的碱基对能忍受高的温度。
高的盐浓度能使弱的碱基对间的配对变得稳定。
所以高温,低盐浓度,高浓度的甲酰胺形成高严紧行杂交分子。
4,磺酸型阳离子交换树脂层析原理:
离子交换树脂是人工合成的,具有酸性基团和碱性基团,并具有网状结构的高聚物。
①用pH3.25柠檬酸钠缓冲液平衡树脂,将其处理为钠型。
②把氨基酸混合液调pH至2.2(pH<pI)
,小于等电点,在低PH离子强度下,由于缓冲液氢离子浓度大,氢离子解离被抑制,使氨基酸带正电荷。
③灌注
:
由于静电引力,带正电荷的氨基酸被树脂吸附,与树脂上的钠离子发生交换,将钠离子交换下来。
④洗脱
用pH逐渐增高的缓冲液洗脱,当洗脱液相继流经树脂时,由于PH不断升高,蛋白质逐渐失去电荷,因而与树脂的结合能力下降,最后从树脂上冲洗下来。
不同的氨基酸与树脂的结合能力不同,被洗脱的顺序也不同,可逐一得到不同的氨基酸。
5,蛋白质中二硫键的定位(见黄刚的)
一般用蛋白酶水解带有二硫键的蛋白质,从部分水解产物中分离出含二硫键的肽段,再拆开二硫键,将两个肽段分别测序,再与整个多肽链比较,即可确定二硫键的位置。
常用胃蛋白酶,因其专一性低,生成的肽段小,容易分离和鉴定,而且可在酸性条件下作用(pH2),此时二硫键稳定。
肽段的分离可用对角线电泳,将混合物点到滤纸的中央,在pH6.5进行第一次电泳,然后用过甲酸蒸汽断裂二硫键,使含二硫键的肽段变成一对含半胱氨磺酸的肽段。
将滤纸旋转90度后在相同条件下进行第二次电泳,多数肽段迁移率不变,处于对角线上,而含半胱氨磺酸的肽段因负电荷增加而偏离对角线。
用茚三酮显色,分离,测序,与多肽链比较,即可确定二硫键位置。
6,温度影响酶活性的机理:
1)、温度影响反应体系中的活化分子数,:
温度增加,活化分子数增加,反应速度增加。
化学反应中温度每增加10度反应速度增加的倍数称为温度系数Q10
。
酶促反应的Q10为1~2
2)、温度影响酶的活性:
过高的温度使酶变性失活,反应速率下降。
PH影响酶活力机理:
1)、PH影响酶和底物的解离。
2)、PH影响酶分子的构象。
过酸或过碱环境可以使酶的空间结构破坏,引起酶构象的改变,酶活性丧失;
当PH值变化不是太剧烈时,酶虽未变性,但活力受到影响;
Ph影响维持酶分子空间结构的有关基团解离,从而影响了酶活性部位的构象,进而影响酶的活性。
7,酵母双杂交系统的原理:
该系统的建立是基于对真核生物调控转录起始过程的认识。
真核生物基因转录需要反式转录激活因子的参与,真核生长转录因子含有两个不同的结构域:
DNA结合结构域(BD),转录激活结构域(AD)。
这两个结构域各具功能,互不影响,
单独存在时没有转录激活的功能,只有两者通过共价或非共价键连接建立起来的空间结构方可表现出一个完整的激活特定基因表达的激活因子的功能。
理论上,任何一个AD都可以与任何一个DNA-BD结合并转录激活,即杂合的DNA-BD和AD可以组成一个具有功能的转录激活蛋白,不仅如此,只要DNA-BD和AD能够通过一定的方式在空间上足够靠近,将相互分开的DNA-BD和AD在空间上彼此靠近,并重建一个具有功能的转录激活蛋白。
单独的DB虽然能和启动子结合,但不能激活转录。
而不同转录激活因子的DB和AD形成的杂合蛋白仍然有正常的激活转录的功能。
将编码已知蛋白质(诱饵蛋白)的基因与编码BD的序列融合并在酵母中表达产生融合蛋白BD-Bait,同时将编码未知蛋白(猎物Prey或靶蛋白)的基因与编码AD的序列融合并在酵母中表达产生另一种融合蛋白AD-Prey。
借助Bait和Prey的作用使BD和AD相互结合并产生具有功能的转录激活蛋白,从而激活报道基因。
如果Bait和Prey不能相互作用,则BD和AD不能结合,报道基因的转录不能被激活,因此,可以通过检测报道基因是否被转录来研究蛋白质之间的相互作用。
通过对报道基因表达产物的检测,反过来可判别作为诱饵和猎物的两个蛋白质之间是否存在相互作用。
8细胞内酶活性调节方式:
1)、变构调节:
酶分子的非催化部位与某些化合物可逆地非共价结合后,发生构象的改变,进而改变酶的活性状态。
2)、共价修饰调节:
通过其他酶对其多肽链上的某些基团进行了可逆的共价修饰,使其处于活性与非活性的互变状态,从而调节酶活性。
3)、酶原激活:
体内合成的蛋白质有时不具有生物活性,经过蛋白质水解专一作用后,构象发生变化,形成酶的活性部位,变成活性蛋白,该活化过程是生物体的一种调节机制。
2008年高级生化考试答案
一、
名词解释
1、
由细胞全部mRNA反转录生成的cDNA克隆的总和。
2、
DNA指纹:
在人类中VNTRs位点是1.5kb,但人的总DNA提取后用限制线内切酶切成不同的片段,然后以ANTRs中的特异序列为探针进行southern杂交,可发现阳性片段的大小各不相同,由于不同个体的这种串联重复的数目和位置各不相同,所以VNTRs的southern杂交带谱就具有高度的个体特异性,称其为DNA指纹,可作亲子鉴定。
3、
指不处于DNA自身的核苷酸序列中的可影响DNA活性的任何可遗传的物质。
4、
穿梭载体:
通常指那些既能在真核细胞中繁殖又能在原核细胞中繁殖的载体。
5、
亲和层析:
蛋白质分子能对配基专一性地结合成复合物,改变条件,又能分离,利用这种特性而设计的一种层析技术。
6、
减数Edman蛋白质测序法(DNS-Cl-Edman法):
将高灵敏度的DNS技术与能连续降解的Edman反应有机结合起来的一种测定氨基酸排列顺序的方法。
7、
二面角:
由C2-N1单键旋转和C2ɑ-C2单键旋转角度决定的相邻二个肽平面在空间上的相对位置的夹角。
8、
蛋白质完全水解:
即将所有的肽键都打断,使蛋白质完全裂解为氨基酸。
蛋白质部分水解:
即将蛋白质的部分肽键打开,进而部分地分离出所需氨基酸。
9、
酶的化学修饰:
在不引起酶蛋白变性的条件下,某些试剂能与氨基酸残基的侧链基团反应,引起共价结合、氧化、还原等修饰反应,使基团的结构和性质发生改变,称为化学试剂修饰。
具有这种性质的酶称为化学修饰酶。
10、邻近效应:
E与S形成中间复合物后,S与S(双分子),酶催化基团与S之间结合于同一分子,使有效浓度大大提高,使反应速度大大增加。
定位效应:
反应物的反应基团之间和催化基团与S的反应基团的正确取位产生的效应。
11、酶催化的过渡态理论:
酶促反应中,酶与底物的过渡态形成复合物,再转化为酶和产物。
在这个过程中,酶与底物的过渡态互补,亲和力最强,释放出结合能使ES的过渡态能级降低,有利于底物分子跨越能垒,使酶促反应大大加速。
12、酶比活力:
每毫克酶蛋白中所含有的酶活力单位。
二、1、简述核酸结构与遗传信息的关系。
(1)DNA的一级结构:
核苷酸序列、基因组、稀有碱基
细菌:
基因连续,无内含子,有操纵子,单顺反子。
真核:
基因断裂,有内含子,有调控基因,多顺反子,重复序列。
(2)DNA二级结构:
双螺旋、回文结构、三链DNA、H-DNA
DNA三级结构:
超螺旋、负超螺旋
DNA四级结构:
DNA与蛋白质多复合结构
(3)RNA一级结构:
稀有碱基、保守序列、甲基化
RNA高级结构RNA与蛋白质形成复合物,以RNA-蛋白质复合物执行功能,有时蛋白质起支持作用,而真正起作用的是RNA.
2、试述miRNA和siRNA的研究进展。
miRNA:
一个不断增长的非编码小分子RNA家族,以序列特异性方式(在翻译水平)调控基因的表达。
(个人翻译,附英文原文:
microRNAs
are
a
growing
family
of
small
noncoding
RNAs
that
downregulate
gene
expression
in
sequencespecific
manner.)
siRNA:
RNA干涉现象中,介入细胞中特定双链RNA加工裂解成的21-23nt的正义和反义链组成等干扰基因表达的小分子RNA,其引发的RNAi是转录后基因沉默现象的机制之一。
3、如何控制核算分子杂交的严谨性。
影响核酸分子杂交严谨性的因素有:
复性温度、盐浓度、甲酰胺的浓度等,高温、低盐、高浓度甲酰胺有利于高严密性杂交分子的形成。
4、确定蛋白质纯化的方法,简述其原理。
(1)依据分子大小不同的纯化方法
①透析和超滤
透析——只用于除盐类和小分子杂质,利用蛋白质等大分子不能通过半透膜的性质,使蛋白质和其它小分子物质如无机盐单糖等分开。
超滤(ultrafiltration)
——除小分子杂质,分离、浓缩蛋白质,利用压力、抽滤(A)或离心力(B)等多种形式,强行使水和其它小分子溶质通过半透膜,而蛋白质被截留在膜上,以达到浓缩和脱盐目的。
②密度梯度离心
生物大分子及颗粒的沉降不仅决定于它的大小,而且也取决于它的密度。
颗粒在具有密度梯度的介质中离心时,质量和密度大的颗粒沉降的快,并且每种蛋白质颗粒沉降到与自身密度相等的介质密度梯度时,即停止不前,最后各自在离心管中被分离成独立的区带。
分成区带的样品可以在管底刺一个小孔逐滴放出,分步收集。
常用的介质有蔗糖、氯化铯等。
③凝胶层析(分子筛层析)
利用凝胶把物质按分子大小不同进行分离的一种方法。
由于被分离物质的分子大小(直径)和形状不同,洗脱时,大分子物质由于直径大于凝胶网孔不能进入凝胶内部,只能沿着凝胶颗粒间的孔隙,随溶剂向下移动,因此流程短,首先流出层析柱,而小分子物质,由于直径小于凝胶网孔,能自由进出胶粒网孔,使之洗脱时流程增长,移动速度慢而后流出层析柱。
(2)依据电荷不同的纯化方法
电泳分离蛋白质是根据蛋白质在电场中的迁移的差别达到分离目的的。
蛋白质样品加到一块预先制好的凝胶介质上,只要在凝胶的两端加上电场,就可以达到分离蛋白质的目的,这样的电泳称之凝胶电泳(gel
electrophoresis)。
凝胶可以是淀粉凝胶(starch
gel)、琼脂糖凝胶(agarose
gel)和聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide
gel)。
一般凝胶介质中的pH被维持在碱性区,目的是使大多数蛋白质都带有负电荷,这样它们可以向阳极迁移。
蛋白质的迁移与蛋白质的质量和带电荷的多少有关。
有:
聚丙烯酰胺凝胶电泳、毛细管电泳、等电聚焦、层析聚焦、离子交换层析
(3)依据溶解度差异分离纯化蛋白质
盐溶:
低浓度的中性盐可以增加球状蛋白质的溶解度。
主要由于蛋白质分子吸附某种盐离子后,带电层使蛋白质分子彼此排斥,而蛋白质分子与与水分子之间的相互作用却加强,因而溶解度增高。
盐析:
当盐浓度增高时,蛋白质溶解度降低,从水溶中沉淀出来的现象。
主要由于大量中性盐的加入,盐离子与水这种偶极分子作用,使水分子的活度降低,原来溶液中的大部分甚至全部的自由水转变为盐离子的水化物,导致蛋白质的水合程度减少,从而驱使蛋白质的溶解度降低。
蛋白质沉淀剂法:
向无细胞抽提液加入沉淀剂,如醋酸铝,丹宁酸或离子型表面活性剂等,可以使一些杂蛋白或粘多糖发生沉淀,沉淀物可以用离心分离除去。
5、简述球状蛋白质的三维结构特征。
(1)含有多种二元结构原件
(2)具有明显的折叠层次
(3)在蛋白质分子中,大多数非极性侧链总是埋藏在分子内部,形成疏水区域;
大多数极性侧链总是暴露在分子表面,形成亲水区域。
(4)大分子蛋白质常含有几个结构域,结构域划分往往与功能相关。
(5)蛋白质分子表面往往有一个内陷的空穴,空穴往往是疏水区,能容纳一个或两个大分子配体的一部分。
6、Ks与Kcat的特点?
如何应用?
但这类抑制剂还有一种潜伏性的反应基团,这种基团可因酶的催化而暴露或活化,作用于酶活性中心或辅基,使酶共价修饰而失活。
应用:
对于Ks型不可逆抑制剂,其与底物的结合有专一性,但没有反应的专一性。
如果抑制剂与活性中心结合的亲和力大,与活性中心外结合的亲和力小,解离常数相差三个数量级以上,此时可忽略对活性中心外基团的修饰,有较大的应用价值。
如亲和标记试剂。
(胰凝乳蛋白酶的Ks型不可逆抑制剂:
对一甲苯磺酰-L-苯丙氨酰氯甲烷(TPCK)与该酶的最佳底物对-甲苯磺酰-L-苯丙氨酸甲酯的结构相似,都含有对-甲苯磺酰-L-苯丙氨酰基,酶通过对这个基团的强亲和力,把TPCK误认为底物而与之结合,形成Ks很小的非共价络合物。
)
Kcat型专一性不可逆抑制剂的专一性很强,近来已设计出多种酶的Kcat逆制剂,在医疗方面起到很大作用。
如迫降灵是一种单胺氧化酶的自杀性底物,是治疗高血压的良药,单胺氧化酶能氧化某些血管舒张剂(如组胺),由于迫降灵能抑制单胺氧化酶,也就能抑制一些血管舒张剂(如组胺)的氧化,因而有降血压的作用。
此外对治疗癫痫、肿瘤、震颠麻痹、痛风症等也有很大作用。
7、何为蛋白质变性作用?
有哪些影响因素?
变性后发生的现象?
(1)由于外界因素的作用,使天然蛋白质分子的构象发生变化,导致生物活性丧失及物理化学性质的异常变化,这一过程称为变性。
(2)①温度:
温度升高,使分子内振动增强,破坏维系空间结构的次级键的作用(主要是氢键),使蛋白质变性。
②酸、碱:
主要是由于解离基团质子得失后,生成过多正或负电荷,使肽链间静电斥力增加的结果
③有机溶剂
A.
由于有较低的介电常数,常使肽链内静电斥力增加,造成蛋白质分子膨化或松散;
B.
在极性较低的有机溶剂环境中,疏水基团易于从内部向外部转移,使疏水作用力削弱,促进蛋白质的变性。
④重金属盐
在溶液中加入重金属盐类也会影响蛋白质构象的稳定性。
重金属盐有可能和蛋白质的极性基团直接作用,使稳定性发生变化,也可能通过改变溶剂的结构间接影响蛋白质的结构。
(3)
①生物活性的丧失
②侧链基团的暴露
③物理化学性质的改变:
溶解度.分子形状.
粘度等.
④化学性质的改变
变性后的蛋白质肽链松散,内部侧链基团暴露,易于与有关显色试剂接触,使颜色反应增强。
⑤生物化学性质的改变:
易被蛋白酶水解.
8、Km的意义和作用。
是说明两种确定Km的方法并讨论优缺点。
(1)物理意义:
Km等于酶反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度。
(2)Km值愈大,酶与底物的亲和力越小;
Km值越小,酶与底物亲和力越大。
(3)Km值是酶的特征常数,只与酶的性质,酶所催化的底物和酶促反应条件有关,与酶的浓度无关。
Km的作用(应用):
1)、利用已知Km和【S】,可根据米氏方程,计算V相对Vmax的%,反之,利用已知Km和V相对Vmax的%,可以根据米氏方程计算【S】。
2)、判断酶的最佳底物:
如果一种酶可作用于多个底物,就有几个Km值,其中Km最小对应的底物就是酶的天然底物。
3)、判断在细胞内是否受【S】的调控:
【S】远远大于Km,10倍以上,V=Vmax(Km忽略),为零级反应,不受【S】调节;
反之,远远小于时,为一级反应,V受【S】调节。
4)、判断在细胞中酶催化反应的主要方向:
催化正逆反应的酶,其正逆两向的反应的Km不同,如果正逆反应的底物浓度相当,则反应趋向于Km小对应底物的反应方向。
5)、推测限速步骤:
6)、了解酶的底物在体内具有的浓度水平。
求法:
(1)Lineweaver-Burk
(Double-reciprocal)法特点:
最常用,
点大多集中在左下方。
低[S]的点,倒数后误差大,偏离
(2)Hanes-Woolf作图法
(3)Eddie-Hofstee作图法
(4)Eisenthal和Cornish-Bowden法
(5)Scatchard作图法
各种方法比较:
方法
(1)和(4)常用,方法
(1)肉眼判断最不可靠。
方法
(2)和(3)的优点是数点在坐标图中的分布较均匀,v
不取倒数,对
v
误差较大的合适;
缺点是X,Y轴包含两个变量。
2007年高级生化考试答案
一、名词解释
1、突变酶:
用基因定位突变技术修饰天然酶基因,然后用基因工程技术生产该突变基因的酶,被称为突变酶。
2、活性中心:
酶分子中能够直接与底物分子结合,并催化底物化学反应的部位,这一部位就成为酶的活性中心。
活性中心必需的基团有:
组氨酸的咪唑基、谷氨酸天冬氨酸的侧链羧基和丝氨酸的羟基。
3、自杀性底物:
自杀性底物,是指那些底物类似物能为酶所催化,其形成产物与酶的活性中心共价结合,不可逆地抑制酶的活性的物质
4、蛋白质组学:
以蛋白质组为研究对象,分析细胞内动态变化的蛋白质组成成分、表达水平和修饰状态,了解蛋白质间的相互作用与联系,在整体水平上研究蛋白质的组成与调控的活动规律。
5、两可肽:
一些肽段形成α-螺旋和β-折叠两种构象的可能性都比较大,而且很接近,对这些既可能形成α-螺旋也可能形成β-折叠的肽段被称为两可肽。
6、表观Km值:
(没找到)
7、SiRNA:
小干涉RNA,可作为一种特殊的引物,在RNA指导的RNA聚合酶的作用下,以靶标mRNA为模板合成;
后者降解成新的SiRNA,新生成的SiRNA又可进入上述循环。
(PCR)
8、RNAi:
RNA干涉,是由于向细胞内介入特定的双链RNA而引发的一种转录后基因沉默现象
9、外遗传:
不处于DNA自身核苷酸序列中的,可影响DNA活性的可遗传的性质(影响器官表观型)。
10、原位杂交:
原位杂交是指将特定标记的已知顺序核酸为探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交,从而对特定核酸顺序进行精确定量定位的过程。
原位杂交可以在细胞标本或组织标本上进行
11、基因芯片:
固定有寡核苷酸、基因组DNA或互补DNA等的生物芯片。
利用这类芯片与标记的生物样品进行杂交,可对样品的基因表达谱生物信息进行快速定性和定量分析。
二、简答题
1、酶、蛋白质分离纯化的原则、方法和原理
蛋白质原则:
利用蛋白质之间各种特性的差异,包括分子的大小和形状,电离性质,溶解度。
吸附性以及生物学功能的专一性等
(1)
根据分子大小
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- 高级 生化 历年 考试题