western blot 的原理与操作方法详细Word格式.docx
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tu@v7?
0:
{F
4×
104-1×
10510-15
y<
qek)
105-5×
1055-10
V`>
wj"
>
5×
1052-5
LpS)D:
\xN
_#2
8fOo\
③分离胶:
N%<
k[4
电泳凝胶浓度
hR7z|dx*
试剂10%12%15%10%12%15%
G9@,r}$E
H2O(ml)4.03.32.35.94.93.4
zHVI2w
30%丙烯酰胺(T:
30%,C:
3%(ml)3.34.05.05.06.07.5
ngl88w
1.5mol/lTris.cl(PH8.8)(ml)2.52.52.53.83.83.8
Dj'
3*=5
10%SDS(ml)0.10.10.10.150.150.15
5HHU.kmp
10%AP(ml)0.10.10.10.150.150.15
{t'
9tNk@i
TEMED(μl)444666
TA.xIK9O*
总体积(ml)1015
%1KSKC
AGV
zr
④浓缩胶
[}<
Km\\N
试剂浓度(5%)
[8b$fnDT
H2O(ml)42
1O3*'
5:
z
3%(ml)10.5
a#[Jv$v
1.0mol/lTris.cl(PH8.8)(ml)10.5
z!
bT*`E<
10%SDS(μl)8040
+3L4#
10%AP(μl)6030
#\)_*{u!
|
TEMED(μl)84
pj>
Q.
总体积(ml)63
0d,F0,=v
#N*[R"
NP
蛋白质的样品制备:
FqeRI$P[
蛋白质的样品制备是WesternBlotting的第一步,样品制备是关键步骤,要求尽可能的获得所有蛋白质,应注意以下问题:
F^g8
q
1:
在合适的盐浓度下,应保持蛋白质的最大溶解性和可重复性。
5pQb8TH%
2:
选择合适的表面活性剂和还原剂,破坏所有非共价结合的蛋白质复合物和共价键二硫键,使其形成一个各自多肽的溶液。
tn<
ME{'
3:
尽量去除核酸,多糖,脂类等干扰分子。
r&
k'
8\
4:
防止蛋白质在样品处理过程中的人为的修饰,制备过程应在低温下进行,以避免细胞破碎释放出的各种酶类的修饰(建议加入合适的蛋白酶抑制剂)
SxPvLa
5:
样品建议分装成合适的量,然后冷冻干燥或直接以液体状态置-80℃中保存,但要注意不要反复冻融。
iZm.<
?
一:
准备工作:
#W$o~G?
一个水浴箱,一台超声装置,组织匀浆器
t>
X^QL
二:
需要的溶液:
]cGKLdZ
裂解液Laemmli样品缓冲液
0TGJD$5|O
三:
操作步骤:
u:
"
O|a7@
1)培养细胞蛋白质样品的制备:
Go-Wc2
胰酶酶解后裂解:
/%++r"
0uE
细胞培养至80%左右密度时,以含0.05%胰蛋白酶消化,细胞经预冷的PBS漂洗3次,离心收集在离心管中,加入450μl裂解液反复吹打。
i'
2g_4"
D
皿上直接裂解:
X(tt?
EiBW
细胞培养至80%左右密度时,细胞经预冷的PBS漂洗3次,加入450μl裂解液,细胞刮刀收集,用移液器转移至离心管中,反复吹打。
8U/$C{e2
以上所得的样品最终用超声细胞破碎仪超声处理,超声时为5S,间歇时间为10S,功率为100-120W至溶液清澈无粘稠为止,处理过程在水浴中进行,后4℃25000g离心1小时取上清或以最大强度超声4次,每次15-30S,在每次超声步骤之间将样品转置水浴中15S,加入Laemmli样品缓冲液(视蛋白样品浓度,以1:
1或1:
2的比例混合),强力混匀,样品置100℃水浴箱里水浴加热3-5分钟,10000g离心10分钟,取出清液,将其移入另一洁净试管中,至此,电泳样品已准备就绪。
(样品可立即使用也可以分装冻存,-20℃存放的样品可稳定保持数月)
Q~[Y[
2)组织样品的制备:
cer.$VW
手术切除的组织块迅速置于预冷的0.95生理盐水中,漂洗数次,以清洁表面的血迹,将组织称量后切成几个较小的组织块放入机戒组织匀浆器中,按组织净重,裂解液=1:
10的比例,加入相应体积的裂解液进行匀浆,离心收集上清(如有粘稠物可超声处理,具体方法见细胞培养的样品制备,也可以冷冻干燥降解核酸后,将冻干的蛋白质样品溶解在适当的上样buffer中,混匀后静置3小时使样品中的蛋白质充分的溶解,有5分钟即可,4度离心收集。
)加入Laemmli样品缓冲液(视蛋白样品浓度,以1:
2的比例混合)强力混匀,样品置100度的水浴箱水浴加热3-5分钟,10000g离心10分钟,取上清液,将其转入另一洁净的试管中,至此,电泳样品已准备就绪(样品即可立即使用也可也可以分装冻存,-20℃存放的样品可稳定保持数月。
)
=K]DbWt\
~Z(4UU[
k`DS1Gr*
p^.#w,0e&
K7sRYkB
YlQE~N43
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hT-3H
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IdH8
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hM1N-;
jkR!
:
R;
\
1]Y5C>
t
ng-"
`;
iC
YV,QiTZ
#mLqr5
附:
SKe2x0
裂解液的制备:
vV|Yw1
组织裂解液(全细胞蛋提取):
Tris-HCL50mmoL/LPH7.4
!
1<
u|
2:
Nacl150mmoL/L
;
ON8.jRRK
3:
去氧胆酸钠0.25%
Xu$RR@)B
NP-40或Triton-x-1001%
I:
3OLs9N$
5:
EDTA1mmoL/L
>
@fL5
6:
PMSF1mmoL/L
goG:
W
7:
Aprotinin1μg/ml
yCxV6
8:
leupeptin1μg/ml
zkCJTa[#pt
9:
pepstain1μg/ml
79^f|k=
7,8,9作用不持久,要使用前加入。
#G[{l@6
}d"
]ajd\<
E
细胞裂解液:
NP-40裂解体系:
150mmoL/LNacl
aUI;
V1hs^
1.0%NP-40或Triton-x-100
fF@VF>
j
50mmoL/LTris(PH8.0)
IJq}uXhc
RIPA裂解体系:
150mmoL/LNacl
IOosZZ+5
fh?
]{6+`
0.5%脱氧胆酸钠
(ca1&
B9V
0.1%SDS
_&
)}YBBP
50mmoL/LTris(ph8.0)
rxb@\L
4z!
%Pfo@ep
Laemmli样品缓冲液配置(1*SDS样品缓冲液)
bohC"
EK`
50mmoL/LTris-HCL(PH8.0)
^WTw8`F
100mmoL/LDTT
BGDu~.]K
2%SDS
nh?
6
0.1%溴酚蓝
9v,hI?
G0
10%甘油
qB}q!
oV
此液可以配置成不同的储存液,根据蛋白浓度而定,40C长期保存,用时临时与蛋白液按比例混合,其中DTT应临时加入,以防降解。
N
Bf8
蛋白质定量
Vj/76Ab=
?
W]A.@{D
1)Bradford法:
e0z.9SB
检测原理:
Bradford与蛋白质四级结构,特殊氨基酸结合,由棕色变成蓝色,595nm检测.该方法用于大多数蛋白质的定量是比较精确的,但不使用于小分子碱性多肽的定量,如核糖核酸酶或溶菌酶,去污剂的浓度超过0.2%影响测定结果,如TritonX-100,SDS,NP-40等.
nI$k5G
①Bradford法浓染液的配制:
将100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml95%乙醇,加入100ml浓磷酸;
然后,用蒸馏水补充至200ml;
此染液放4℃至少6个月保持稳定.
};
_,(h5
②标准曲线蛋白质样本的制备:
尽量使用与待测样本性质相近的蛋白质作为标准品,例如测定抗体,可用纯化的抗体作为标准,如果待测样品是未知的,也可用抗体作为标准蛋白,通常在20μg-150μg/100μl之间绘制标准曲线.
e&
6+r&
③将待测样本溶于100μl缓冲溶液中,该缓冲溶液相同(最好用PBS)
[\Xxn:
nB
④按照1:
5用水稀释浓燃料结合溶液,如果出现沉淀,过滤除去.
([`&
%+qa
⑤每个样品家5ml稀释的燃料结合溶液,作用5-30分钟,燃料与蛋白结合,将由红色变为兰色,在595nm波长下测定其吸光度,注意显色反应不超过30分钟.
c)[H(<
?
⑥根据标准曲线计算待测样品的浓度.
_r-)jYu_
*dq!
5ad
2)Lowry法:
+ED1[lS
是Cu2+与蛋白作用生成的Cu+与双缩脲试剂形成兰色络合物,菲林试剂增强兰色形成,750nm检测.
v%>
$?
+>
①首先,将20g碳酸钠溶于500ml水中;
再将1gCuSO4.5H2O和2g酒石酸钠溶于500ml蒸馏水中;
将铜/酒石酸钠溶液放在磁力搅拌器上搅拌缓缓加碳酸钠溶液,储存于冰箱中,可稳定保存1年以上.
j[KN5}K9
②Folin-ciocalteu酚试剂
u5dyr
③按体积比1:
1将铜/酒石酸/碳酸钠,5%SDS和0.8mmol/lNaOH溶液混合,室温下储藏,可稳定保存2周,标明为试剂A
]e{9P#r
④按体积比1:
5将Folin-ciocalteu酚试剂和H2O混合,室温下储存于琥珀色试剂瓶中,可稳定保存1个月,表明为时机B
-hF
Wb~%
⑤用蒸馏水将样本(5-100μg)稀释为1ml,并准备100,50,25,12.5μg/ml,4个浓度的BSA作为标准蛋白.
2dp}8UP
⑥每个蛋白样品家1.0ml试剂A,混合均匀,在室温下孵育10分钟.
4~2w[wNS
⑦加入0.5ml试剂B并立即混合,在室温下孵育30分钟.
0X'
+<
BV-
⑧在750nm光波长下测定吸光度;
根据标准曲线计算样本蛋白质的浓度.
Jcg~c:
7
`#J}w2
3)紫外分光光度法:
M~H43Rw~4
是因蛋白质样品在280nm波长下有最大吸光率,最大吸光率主要取决于酪氨酸和色氨酸的存在.
zfUbI\jjSZ
①纯化蛋白质浓度的测定:
在280nm波长下读取与适当对照相比较的吸光值.
tN)(pmRb
②对于抗体和BSA,可按照下述标准计算其浓度,对其他蛋白质粗略地估计:
1单位吸光值相当于1mg/ml
LvrW%(zc
蛋白质A280(1mg/ml)
y]M|]Qc
IgG1.35
}<
bc|z
IgM1.2
Cwz0cBwX
BSA0.7
t+GBz%6f6
③含有核苷酸的蛋白质溶液浓度的测定:
_32@VM
蛋白质浓度(mg/ml)=(1.55*A280)-(0.76*A260)
NA3,`V
7s
蛋白质浓度(mg/ml)=A205(27+120A280/A205)
Q8BU*k,
GB;
x_0td8
1)SDS-PAGE设备和材料
pZ.\>
=tdj
①电泳装置(垂直板电泳槽)为北京六一仪器厂生产的DYCZ-24D型电泳装置。
fYv5RT\~
②电泳仪(电源)为北京六一仪器厂生产的DYY-8B型。
]){#AbT
③振荡器
7fvkKL
-I-Oac$
2)试剂
l/,M\J(
①丙烯酰胺(电泳级)
@Y)w'
_|
②N,N′-甲叉双丙烯酰胺(bis)
c'
}Di<
d;
[
③SDS
^9w*]pK
④TEMED
-,?
N=XZ]
⑤Tris
vJfH9j
⑥过硫酸铵
8k4Ket)
⑦α-巯基乙醇或DTT
1"
T/f6$YNc
⑧甘油
moDVP7x
⑨甘氨酸
K]Wg
7#a
⑩溴酚蓝
rb&
p^*b
(11)盐酸
R]@x6C^
H5@:
gk\Gr
3)聚胶前准备:
k&
s%?
①配制凝胶储液:
T%=30%C%=1%arc:
bis=29:
1 过滤后4℃避光保存。
B:
4bl@-
②配制浓缩胶缓冲液:
1.0mol/LTrisHClPh6.8, 过滤后4℃避光保存。
8'
8SAt
③配制分离胶缓冲液:
1.5mol/LTrisHClPh8.8, 过滤后4℃避光保存。
B*jM.U<
④配制10%SDS
Da[/ewvo
⑤配制10%过硫酸铵(AP)
DXNgAx~
⑥TEMED原溶液
0,FQ**}
⑦电泳缓冲液(5×
):
Tris15g+甘氨酸72g+SDS5g+H2O至1L,临用时稀释5倍至1×
SDS电泳缓冲液加入电泳槽中。
oAsf^~
(<
5Sat9W
4)制胶:
制胶关键是聚合时间,最好是分离胶聚合控制在分离胶从加入10%AP和TEMED起至开始出现凝胶的时间为15-20分钟(并不是此时已凝聚完全)。
对浓缩胶最佳聚合速度为8-10min开始可见聚合,可以通过调节AP和TEMED的加入量来控制,因液体中含有分子氧可抑制凝胶的聚合,故用时可在真空中抽气以排除液体中的分子氧,灌完分离胶后加水以封闭分离胶与外界氧气的结合,总之,要掌握一个原则:
即用尽量少的催化剂在最佳时间聚合。
j-Pwjw[0
①按比例配制分离胶,轻缓地摇动溶液(8-10下),使激活剂混合均匀,将凝胶溶液平缓地注入两层玻璃极中,再在液面上小心注入一层水或正丁醇,以阻止氧气进入凝胶溶液中,然后静置90min。
V
H15-m
②同前按比例配制浓缩胶,但摇动溶液时不要过于剧烈以免引入过多地氧气。
吸去不连续系统中下层分离胶上的水分,以连续平稳的液流注入凝胶溶液,然后小心插入梳子并注意不得在齿尖留有气泡,静制90min以上以保证完全聚合。
oKtoS,c
[E_w[s
5)预电泳:
将聚合好的凝胶安置于电泳槽中,小心拔去梳子,加入上下槽电泳缓冲液后低电压短时间的预电泳(恒压10-20V,20-30min),清除凝胶内的杂质,疏通凝胶孔径以保证电泳过程中电泳的畅通。
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aLE!
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iaix4Zx
6)加样:
预电泳后依次加入标准品和待分析样品,注意加样时间要尽量短,以免样品扩散,为避免边缘效应,可在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液。
TorooK{Q
tqO:
-#Ox
7)电泳:
加样完毕,盖好电泳槽的盖子并选择适当的电压进行电泳,通常在连续系统中,上层浓缩胶的电泳电压要低于分离胶的电泳电压,使样品更好的进入凝胶,电泳时,应采用恒压的模式,这样蛋白质才可以保证恒定的电泳迁移率。
一般采用恒压浓缩胶80V,分离胶120V,电泳直至溴酚染料前沿下至凝胶末端处,即停止电泳。
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.
8)染色和脱色
f`=~tdsY
电泳完毕需通过染色和脱色评定其结果的优劣.对凝胶中分离成不同条带的蛋白进行检测.此外,根据不同的研究目的,也可将凝胶电印迹
f:
p:
sj2TT
①考马斯亮蓝染色:
."
s/
将凝胶取出放入培养皿中到如少量的染色液,以浸没凝胶为宜,在摇床上震荡,直到凝胶上出现明显的条带为止,一般5-6小时或者4℃过夜;
然后倾去染色液,用脱色液洗涤震荡,其间要不断换脱色液,直至脱色液颜色稍清亮.,凝胶背景清楚为止.
+kE3+
②染色液配制:
YV](Z`Cm/
90ml甲醇和H20混合溶液(甲醇:
水=1:
1,V/V)和10ml冰乙酸的混合溶液中溶解0.25g考马斯亮蓝R250用滤纸过滤染液以除去颗粒不溶性物质.
Y8L"
G
Y
③脱色液的配制:
}[j/q(8}?
90mL(甲醇):
H20(1:
1V/V)和10ml冰乙酸溶液.
p>
kP,E?
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yF4qnDX
一、蛋白标准品的选择
zvacL
凝胶电泳中一个关键的指示系统,即蛋白标准品(MolecularWeightMarker),电泳的分离效率,转膜效率以及电泳泳动情况等,皆需通过蛋白标准品来显示,目前普遍采用的几种蛋白标准品有:
p5Mte9
/(Cg'
5*y
①BlueRangerTMprestainedproteinMolecularWeightMarkerMix
o=K|ju
②TrichromRangerTMprestainedproteinMolecularWeightMarker
#vCBWR
Mix
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