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用NaOH调PH值至8.0,定容到100ml,高压灭菌,室温放置备用
▲10XMOPS(3-(N-吗啉代)丙磺酸):
MOPS41.86g
NaAC·
3H2O4.10g
0.5MEDTA(PH8.0)20ml
用NaOH调PH值6.5,DEPC水定容到1L,室温避光放置备用。
▲1xMOPS:
10xMOPS30ml
加DEPC水270ml,用时现配。
▲4xRNALoadingbuffer:
10xMOPS400ul
甘油(高压过)200UL
溴酚兰10ul
甲醛(37%)72ul
去离子甲酰氨310ul
EDTA(0.5MPH8.0)8ul
ErBr(10mg/mlinDEPCH2O)70ul
在4℃可保持3个月
▲10xPBS
pH=7.4
NaCl80g
KCl2g
Na2HPO414.4g
KH2PO42.4g
定容至1000ml
▲变性电泳胶:
称取0.5g琼脂糖,加入47.5ml1xMOPs,加热至琼脂糖熔化后,冷却至50℃左右,加入2.5ml甲醛,轻轻混匀后倒入电泳托上。
▲变性电泳缓冲液:
在250ml容量瓶内加入5ml甲醛,用1xMOPS定容至250ml
2.动物组织totalRNA的提取
1.根据表1选择适当的组织量和相应的变性裂解液量,将变性裂解液分装到RNase-free的50ml无菌离心管中,冰浴5分钟。
2.将组织样品放入变性裂解液中,在高速下匀浆15-30秒/次,直到看不见组织和细胞碎片。
3.根据表1加入适量2M的乙酸钠(pH4.0),反复颠倒混匀4-5次。
4.根据表1加入适量酚/氯仿,加盖颠倒混合4-5次,再摇动10秒钟。
5.冰浴10分钟。
6.4C,12000g离心20分钟。
7.小心转移上层水相于另一个RNase-free的无菌离心管中,内含所需的RNA。
蛋白质和DNA分别留在了有机相和中间层。
8.加入等体积的异丙醇,-20C沉淀30分钟以上。
9.4C,12000g离心20分钟。
10.根据表1加入适量的变性裂解液重新溶解RNA。
11.加等体积的氯仿,加盖颠倒混合4-5次,再摇动10秒钟。
12.4C,12000g离心20分钟。
13.小心转移上层水相于另一个RNase-free的无菌离心管中,加入等体积的异丙醇,-20C沉淀至少30分钟。
14.4C,12000g离心20分钟。
15.弃上清,加1ml75%的乙醇漂洗RNA沉淀。
4C,12000g离心10分钟。
16.弃上清,空气中干燥RNA沉淀,直至没有乙醇气味。
用适量DEPC水充分溶解RNA沉淀。
17.取少量RNA用于测定OD值及电泳,其余置-80C冰箱中保存。
表1
Mg#oftissue
500
800
1000
变性裂解液(ml)
5
8
10
2MNaOACpH4(ml)
0.5
0.8
1
水饱和酚(mL)
氯仿(mL)
1.6
2
异丙醇(mL)
4
6
变性裂解液(mL)
75%乙醇(mL)
DEPC-treatedH20(mL)
3.植物组织totalRNA的提取
1.先将研钵于-80℃冰箱中预冷,然后将1g样品在液氮中研磨成粉末状。
2.将粉末倒入盛有3ml变性裂解液的50ml离心管中,充分匀浆。
(1g样品加入3ml变性裂解液)。
3.加入0.3ml(1/10体积)2M的NaAc(ph4-5)颠倒混匀。
4.加入3ml(等体积)的水饱和酚,充分振荡,再加入1ml(1/3)的氯仿,振荡。
5.冰浴10min。
4℃,12000g离心10min
6.小心转移上清于另一离心管中,加入2倍体积的无水乙醇,-70℃沉淀至少1小时。
7.4℃,12000g离心20min。
8.去上清,取沉淀。
加1ml4M的LiCl溶解沉淀(1mlLiCl/g组织),并转入1.5ml离心管中。
9.4℃,13000rpm离心15min。
10.用0.4mlDEPC水溶解沉淀,加1/2体积的水饱和酚,1/2体积的氯仿,颠倒混匀。
11.4℃,13000rpm离心10min。
12.取上清,加1/10体积的3MNaAc(ph5)和2倍体积的无水乙醇,-70℃沉淀30min以上。
13.4℃,13000rpm离心15min。
14.弃上清,用1ml75%的乙醇洗涤沉淀,4℃,13000rpm离心10min。
15.弃上清,取沉淀,空气中干燥RNA沉淀,直至无乙醇味。
16.用40-60ulDEPC水溶解(300-500ug/g)RNA沉淀。
17.取少量RNA用于测定OD值及电泳,其余置-80℃冰箱中保存。
4.TRIzolReagent提取totalRNA(GIBCO)
1.查表2根据样品量选择适当的TRIzolReagent体积装入50mlRNase-free离心管中,注意样品体积不能超过TRIzolReagent体积的10%。
2.将组织样品放入TRIzolReagent中,高速下匀浆15-30秒/次,直至看不见组织和细胞碎片。
3.室温温育10分钟。
4.据表2加入适量体积的氯仿,剧烈震荡15秒钟,然后室温下温育3分钟。
5.4º
C,12000g离心15分钟,形成淡红色的苯酚/氯仿有机相,中间相和上层水相,水相约占TRIzol体积的60%。
6.转移上清于另一个Rnase-free的50ml离心管中。
根据表2加入适量异丙醇,-20º
C沉淀1小时以上。
7.4º
C,12000g离心10分钟。
8.去上清,据表2加入适量体积的75%的乙醇混匀。
9.4º
C,7500g离心5分钟。
10.去上清,空气中干燥或真空抽干RNA沉淀,但不要太干。
加入适量体积的DEPC-WATER,溶解沉淀。
11.取少量RNA用于测定其OD值和电泳,其余置-80º
C冰箱中保存。
表2
组织量
TRIzolReagent
氯仿
异丙醇
75%乙醇
50~100mg
1ml
0.2ml
二.mRNA的分离
1.OligotexmRNAKits(QIAGEN)法
准备工作:
1.将OligotexSuspension置于37℃水浴中,旋转混匀,溶解Oligotex.,然后置于室温。
2.将OBBBuffer置于37℃水浴中,旋转混匀,重溶沉淀物,然后置于室温。
3.将OEBBuffer置于70℃水浴中,待用。
试验步骤:
表3:
加入试剂量据此表
TotalRNA
RNase-freeWaterto:
BufferOBB
(ul)
Oligotex
Suspension(ul)
Prepsize
<
=0.25mg
250ul
15
Mini
0.25-0.5mg
500ul
30
Midi
0.5-0.75mg
45
0.75-1.00mg
55
1.TotalRNA量不要多于1mg,用移液器取出所需RNA量到1.5ml离心管中,加RNase-freewater补足到500ul
2.根据表3加入适当体积的OBBBuffer和OligotexSuspension,轻弹1.5ml离心管彻底混匀
3.置于70℃水浴中3min
4.取出置于室温(20℃-30℃)10min
5.13000rpm室温离心2min,用移液器吸出上清到一个新的1.5ml离心管中,保留上清直到polyA被结合上。
6.用移液器取400ulOW2Buffer混匀沉淀物,将混合物转移到SpinColumn中,RT,13000rpm,离心1min
7.将SpinColumn转移到一个新的1.5ml离心管中,加400ulOW2,RT,13000rpm,离心1min
8.将SpinColumn转移到一个新的1.5ml管中,取出25ulOERBuffer(70℃)到Column中,用移液器吹打3-4次树脂,室温13000rpm,离心1min。
9.取出25ulOERBuffer(70℃)到Column中,用移液器吹打3-4次树脂,室温13000rpm,离心1min。
10.测OD,并电泳定量。
2.磁珠法分离mRNA
1.在RNase-free的Eppendorf管中加入0.1~1.0mg的总RNA和RNase-free水至终体积为500ul.
2.65º
C加热10分钟。
3.加入3ul生物素标记的Oligo(dT)和13ul20×
SSC于RNA中,轻轻混合,室温放置逐渐冷去至室温,一般需10分钟左右。
4.同时配0.5×
SSC1.2ml和0.1×
SSC1.4ml.
5.将磁珠(SA-PMPs)轻晃散开,放入磁性分离架上,使SA-PMPs集中于管的一侧(约30sec),小心去上清,切不可离心。
用0.3ml0.5×
ssc漂洗SA-PMPs,用磁性分离架集中磁珠,去除上清,重复3次。
6.将漂洗后的SA-PMPs重新悬浮于0.1ml0.5Xssc,注意漂洗后的SA-PMPs应在30分钟内使用。
7.将(3)中的oligo(dT)/mRNA退火反应物全部加入含漂洗好的SA—PMPs管中,轻轻摇匀,室温下放10分钟。
8.用磁性分离架捕获SA-PMPs,小心去上清,但不要弃去。
9.用0.1×
SSC,每次0.3ml洗3次,每次都晃至SA-PMPs悬浮,最后一次漂洗后尽可能多的吸取水相,而不损坏SA-PMPs.
10.将SA-PMPs重新悬浮在0.1mlRNase-free水中,反复颠倒,使SA-PMPs散开,洗脱mRNA。
11.用磁性分离架捕获SA-PMPs,将洗脱的mRNA吸入另一个新的Eppendorf管中。
12.将SA-PMPs再悬浮于0.15mlRNase-free的水中,洗脱,与(11)步洗脱液合并。
13.将得到的mRNA溶液取几微升跑电泳,若mRNA浓度不足以进行下一步的反转录,则需将得到的mRNA溶液浓缩(浓缩步骤见14-18)。
14.加0.1体积的3mol/lNaAc和1.0体积的异丙醇于洗脱液中,-20º
C沉淀过夜。
15.4º
C,13000g离心60分钟。
去上清,加入500ul70%乙醇混匀。
16.4º
C,7500g离心10分钟。
17.去上清,真空或空气中自然风干,但不要太干,加适量RNase-free水溶解。
18.重复步骤5-12,将步骤8保留下的样品重新上柱
注意事项:
1.所有操作均需要严格戴手套,戴口罩进行
2.如果totalRNA质量高,杂质少,就选择Oligotex的方法分离mRNA,相反则可以用磁珠法。
3.mRNA的电泳图是smear。
三.cDNA双链合成
1.SupersciptII—RT合成第一链:
1.在一RNase-free的0.2mlPCR管中,加入
xulmRNA(大约500ng)
1ulXhoIPrimer(1.4ug/ul)
(5’GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT…3’)
11-xulRNase-freewater
(大于500ngmRNA分n管(500ng/tube)合成第一链,第一链合成完毕后将n管合成一管进行第二链合成.)
2.混匀后,70℃反应10分钟;
3.反应完成后,立刻将反应体系置于冰上5min;
4.稍微离心一下,顺序加入以下试剂:
4ul5×
firststrandbuffer
2ul0.1MDTT
1ul10mMdNTP(自己配制)
5.混匀,稍微离心反应物之后,42℃放置2分钟;
6.反应完成,趁热加入1ulSupersciptII—RT,混匀;
7.42℃反应50分钟,然后70℃,15分钟灭活反转录酶.
2.cDNA第二链的合成:
1.第一链反应完成后,取2ul一链产物-20℃冰箱中保存,待电泳检测。
其余的产物合并,混匀,然后顺序加入下列试剂(promega):
20ul10×
DNAPolymeraseIbuffer
6ul10mMdNTP(自己配制)
xulddH2O
1ulRNaseH(2U/ul)
10ulDNAPolymeraseI(10U/ul)
总体系为200ul;
2.混匀后,16℃反应2.5小时;
3.70℃灭活10分钟;
4.反应完成后,得到200ulcDNA第二链反应体系,将此体系置于冰上;
5.取2ul二链产物,同保存的一链产物一起电泳鉴定。
同时上1kbladder,确定双链的大小范围。
注:
一链,二链的电泳图是smear,且二链稍比一链大一些。
3.双链cDNA末端补平:
1.在第二链反应体系中,顺序加入下列试剂(promega):
6ul10mMdNTP
2ulT4DNAPolymerase(8.7U/ul)
2ulBSA(10mg/ml)
2.稍微离心混匀反应物,37℃反应至少30分钟,然后75℃灭活10分钟;
3.加入等体积酚/氯仿/异戊醇,剧烈振荡后,常温下13000g离心5分钟;
4.离心后,吸取上清于另一1.5mleppendof管中,加入等体积氯仿,上下颠倒几次混匀后,常温下13000g离心5分钟;
5.吸取上清至另一eppendof管,加入1/10V3MNaAc(PH5.2)和2.5V预冷的无水乙醇,混匀,-20℃放置过夜以沉淀双链cDNA;
6.第二日,将昨日沉淀物在4℃,13000g离心60分钟以充分沉淀双链cDNA;
7.离心完毕,弃上清,加入1ml70%乙醇洗涤沉淀,常温下13000g离心5分钟;
8.离心完毕,弃上清,干燥沉淀至无乙醇气味.
第3,第4步可以用PCR纯化试剂盒代替。
PCR纯化试剂盒操作流程:
1.溶液PE使用前应加入适量体积95%-100%的乙醇,混匀。
2.向200ul二链补平产物中加入5倍体积的bufferPB,混匀。
3.加入spincolumn中,13000rpm离心1min。
4.加入0.75mlbufferPE,13000rpm离心1min。
5.13000rpm,再离心1min。
6.将spincolumn放入一新的离心管中,加入50ulbufferEB,静置10min。
7.13000rpm离心2min。
8.加入30ulbufferEB,静置10min。
9.13000rpm离心2min。
10.加入1/10体积3M的NaAc,2.5倍体积无水乙醇,混匀,-20℃沉淀过夜。
4EcoRIadaptor加接:
1.往双链cDNA沉淀中加入9ulEcoRIadaptor(400ng/ul),4℃至少放置30分钟以充分溶解cDNA沉淀;
2.溶解完成后,顺序加入下列试剂:
1.2ul10×
LigaseBuffer
1ul10mMrATP
1ulT4DNALigase(4U/ul)
3.混匀后,4℃连接3days,或者8℃过夜连接;
5双链cDNA末端的磷酸化及XhoI酶切:
1.连接反应完成后,将反应体系70℃放置15分钟灭活T4DNALigase;
2.稍微离心使反应物集中至管底,室温下放置5分钟,然后加入下列试剂:
1ul10×
6ulddH2O
1ulT4PNK(10U/ul)
3.37℃反应30分钟,然后70℃灭活15分钟;
4.稍微离心使反应物集中至管底;
5.室温放置5分钟;
然后加入下列试剂:
4ulXho10×
Buffer
2ulBSA
5ulddH2O
8ulXhoI(10U/ul)
6.37℃反应1.5小时,然后65℃灭活酶10分钟;
7.反应完成,双链cDNA合成完毕。
置于4℃准备回收。
6.胶回收cDNA(QIAEXIIGELExtractionKit回收试剂盒)
1.配制小胶数板(每个样品一板):
1%琼脂糖凝胶,2ulEB/300ml胶
2.取4℃保存样品上样,40ul/孔。
3.电泳50V;
1hr
4.紫外灯下分别切下500~1kb、1.0-2.0kb及2.0-4.0kbcDNA片段.,分别放入已做标记的1.5ml离心管中。
5.称取胶重,加入三倍体积bufferQXI(例如,100mg胶中加入300ulbufferQXI)
6.50℃水浴数分钟,至胶完全融化。
用手指弹QIAEXII使重悬,每管中加入5ulQIAEXII
7.50℃水浴10min,每隔2min取出颠倒混匀数次,使QIAEXII保持悬浮
8.4℃,13000rpm,30sec。
(弃上清,离心机中甩一下,吸取上清)
9.加入500ulbufferQXI,轻弹管底使QIAEXII重悬
10.离心并去上清(同操作8)
11.加入500ulbufferPE,重悬QIAEXII,离心30sec,去上清
12.再加入500ulbufferPE,重悬QIAEXII,离心30sec,弃上清,离心机中甩一下,吸去上清
13.超净台上吹干(至无乙醇味),加入10ulelutionbuffer,重悬QIAEXII,静置5min,13000rpm,30sec。
吸上清,冰上放置。
14.取1ul上清上样电泳,同时做分子量标准(1kbladder)及DNA含量标准(10ng,20ng)作对照。
15.将收回的cDNA置于-20℃内保存,据电泳结果,取适量DNA进行连接。
1.胶回收前电泳槽,电泳板,梳子等都要用1%的HCl浸泡过夜。
2.胶回收时电压要稳定。
四.载体制备
1.pBlueScriptII的提取
1.取1ul商品的pBlueScriptII,转化入大肠杆菌宿主菌中,取5ul转化产物均匀涂布在含AMP的LB平板上,37℃培养过夜。
2.第二天取一只无菌的50ml离心管,加入10mlAMP抗性的LB液体培养基,挑单克隆于离心管中,37℃,250rpm,培养过夜。
3.第三天取200µ
l小摇后的菌液接种于250ml含AMP的LB液体培养基中,37℃,250rpm培养6hr左右,使OD值达到0.6-0.8。
4.将菌液移入250ml离心管中,4℃,3000rpm,离心15min。
取出离心管,菌团朝上倒掉上清,将离心管倒置于吸水纸上使上清充分滤干。
(注意离心前需配平)
5.加入10ml溶液Ⅰ(50mMGlucose,25mMTris-HCl,10mMEDTA,pH8.0),加入RNase至终浓度100µ
g/ml,晃动摇菌,使菌体充分悬浮,静置10min。
6.按NaOH(0.4N):
SDS(2%)--1:
1的比例新鲜配制溶液Ⅱ,加入20ml溶液Ⅱ,静置3-5min。
静置时间勿超过5min,提前将溶液Ⅲ置于冰盒中。
7.加入15ml冰浴的溶液Ⅲ,冰浴15-30min。
8.4℃,5000rpm,离心15min。
9.取上清于两个50ml离心管中,弃去原离心管中的沉淀。
10.每管加入0.6倍体积的异丙醇,充分混匀,室温下放置10min。
11.20℃,12000g,离心20min回收质粒沉淀。
12.弃上清,用70%的乙醇洗2次。
13.弃上清,倒扣于吸水纸上,尽量空干液体。
14.用3mlTE(pH8.0)溶解沉淀,移入1.5mlEppendorf离心管中。
15.电泳检查DNA质量并定量。
(必要的话,可以用胶回收的方法先纯化一下质粒再进行双酶切。
)
2.pBlueScriptII的双酶切消化
1.以如下体系进行EcoRI酶切:
pBSK(+)Xµ
l(6µ
g)
ddH2O174-Xµ
l
10×
BufferE20µ
l
混匀,加入限制性内切酶:
EcoRI(10U/µ
l)6µ
总体积为200µ
l。
2.轻弹管壁或用枪头轻轻吹打混匀,在离心机上甩一下。
3.37℃,水浴1hr。
4.加入200ul1:
1的酚/氯仿,混匀。
4℃,13000rpm,离心15min。
5.取上清,加入等体积的氯仿,4℃,13000rpm,离心10min。
6.取上清,加入0.1倍体积的NaAC和2.5倍体积的无水乙醇,-20℃,沉淀30min。
7.4℃,13000rpm,离心10min,弃上清,取沉淀。
8.加入200ul70%的乙醇洗沉淀。
9.4℃,13000rpm,离心10min,弃上清,取沉淀。
10.自然风干沉淀,至无乙醇味,加入100ulddH2O充分溶解沉淀。
11.加入以下试剂进行XhoI酶切:
ddH2O74µ
BufferD20µ
混匀,加入限制性内切酶XhoI:
XhoI(10U/µ
总体积为200µ
12.轻弹管壁或用枪头轻轻吹打混匀,在离心机上甩一下
13.37℃,水浴1.5hr。
14.加入200ul1:
15.4℃,13000rpm,离心15min。
16.取上清,加入
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