厚朴酚与和厚朴酚抗肿瘤作用研究进展文档格式.docx
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一类是上游或启动caspase(包括caspase-2,-8,-9,-10);
一类是下游或效应caspase(包括caspase-3,-6,-7)。
在体外增殖实验中,100mmol/LMG24h能诱导B16-BL六、THP-1和HT-1080细胞凋亡(但对BAE细胞株无效),继而上调caspase-3和caspase-8活性[9]。
100mmol/LMG上调caspase活性的作用可被caspase家族抑制剂z-VAD-fmk所抑制。
提示MG肿瘤生长是通过激活caspase而诱导细胞凋亡起作用的。
在MG诱导人HL-60细胞和白血病JurkatT细胞凋亡的实验中发觉,caspase-九、caspase-3和caspase-2被激活及聚ADP核糖聚合酶(PARP)蛋白分解性剪切。
PARP,即poly(ADP-ribose)polymerase,在体外能够被多种caspase剪切,在体内是caspase-3的要紧剪切对象。
被剪切后的PARP失去其酶活力。
PARP关于细胞的稳固和存活超级重要,PARP失去酶活力会加速细胞的不稳固。
PARP剪切被以为是细胞凋亡的一个重要指标,也通常被以为是caspase-3激活的指标。
caspase家族抑制剂和caspase-9选择性抑制剂能阻止MG诱导的细胞凋亡,caspase-3和caspase-2抑制剂能部份抑制凋亡[2]。
在MG诱导人鳞状细胞肺癌CH27细胞凋亡实验中,MG能致使caspase-九、caspase-3和caspase-6的激活。
用z-VAD-fmk预处置可显著抑制MG诱导的细胞凋亡[1]。
caspase-3,-8,-9,-10抑制剂及caspase家族抑制剂可明显抑制MG诱导的人宫颈癌HeLa细胞凋亡。
80μmol/LMG作用于HeLa细胞12h后caspase-3前体被降解,即产生活化的caspase-3;
同时,caspase-3底物ICAD(inhibitorofcaspasedependentDNase)和PARP被剪切,进一步说明MG诱导的HeLa细胞凋亡时激活了caspase-3。
caspase-3位于caspase级联反映的下游,是细胞死亡的执行者。
caspase-8和-10的抑制剂对HeLa细胞凋亡的抑制作用说明死亡受体途径有可能参与这一进程[4]。
在慢性B淋巴细胞性白血病患者原代培育细胞中,HK诱导的凋亡特点是caspase-3,-8和-9活化和PARP剪切[7]。
在HK处置的CH27细胞中还发觉:
caspase-3蛋白水解性活化和PARP剪切。
caspase-3抑制剂z-DEVD-fmk和caspase家族抑制剂z-VAD-fmk显著阻断HK诱导的凋亡[6]。
以上这些结果证明:
激活caspase是MG和HK诱导肿瘤细胞凋亡的作用机制之一。
在人多发性骨髓瘤(MM)细胞株和复发的难治性MM患者的肿瘤细胞中[10],尽管HK触发caspase-3,-7,-8,-9的活化,但caspase家族抑制剂z-VAD-fmk并非能阻断HK诱导的细胞凋亡。
HK可诱导线粒体释放凋亡诱导因子(AIF,一种非caspase依托性凋亡实施者)。
而且在HK诱导凋亡的SU-DHL4细胞株中,caspase-3和-8水平很低,提示HK除caspase途径外还有和非caspase依托性途径参与了HK诱导细胞凋亡的进程。
哺乳动物细胞凋亡要紧有两条途径――死亡受体(deathreceptor,DR)途径和线粒体途径。
死亡受体是肿瘤坏死因子受体超家族成员,其跨膜蛋白胞浆区内具有死亡结构域,当配体与死亡受体结合后,死亡结构域和适应蛋白结合,招募上游caspase,使上游caspase活化,从而进一步活化下游caspase,而下游caspase参与凋亡降解中的重要底物的剪切,引发细胞凋亡。
在线粒体途径中,各类促凋亡信号促使细胞色素C自线粒体释放到胞浆,在ATP的参与下,胞浆细胞色素C结归并活化胞浆蛋白Apaf-1,从而致使caspase-9自身剪切和活化,活化后的上游caspase-9进一步活化下游caspase(主若是caspase-3),使细胞凋亡。
在MG诱导凋亡中发觉,MG能降低线粒体跨膜电位,诱导细胞色素C释放入胞浆[2]。
在人鳞状细胞肺癌CH27细胞株中,MG能致使胞液内细胞色素C的积聚和caspase-九、caspase-3和caspase-6的激活[1]。
用z-VAD-fmk预处置可显著抑制MG诱导的细胞凋亡,但并非阻止胞液内细胞色素C的积存。
在MG诱导Hep-G2细胞凋亡[11]和HK诱导CH27细胞凋亡[6]进程中也发觉,线粒体细胞色素C参与了细胞凋亡进程。
Bcl-2家族是细胞凋亡中线粒体途径的调控者,要紧包括两类成员:
抗凋亡蛋白(Bcl-2和Bcl-XL等)和促凋亡蛋白(Bax、Bid和Bak等)。
在多项研究中发觉,MG和HK对这些蛋白水平有阻碍。
在诱导HeLa细胞凋亡实验中,MG作用12h后Bcl-XL减少,Bax的表达明显增加,Bax/Bcl-XL表达比率升高[4]。
Bax的启动子区具有p53结合区。
MG使HeLa细胞磷酸化p53和p53蛋白表达增加。
在人鳞状细胞肺癌CH27细胞株中[1],80mmol/LMG显著增加Bad和Bcl-XS蛋白质的表达,减少Bcl-XL的表达。
Bcl-2高度表达能对抗MG诱导的CH27细胞凋亡。
在HK诱导RKO细胞凋亡中[12],HK能上调mRNA的表达水平和Bid蛋白水平,并下调Bcl-XL,而对Bax和Bcl-2无阻碍,p53表达不变。
LinSY等[11]对MG诱导Hep-G2细胞凋亡的研究发觉:
胞液内游离Ca2+增加,用磷脂酶c抑制剂U73122或细胞内Ca2+螯合物BAPTA/AM预处置,可抑制MG引发的细胞内Ca2+增加和激活caspase-八、caspase-9的作用,因此,这些细胞的凋亡发生率被大大减少。
用ZB4(阻止Fas反映机制)预处置这些细胞,那么MG诱导的caspase-8活化也减少,凋亡发生率减少。
兴奋型Fas抗体CH-11对MG诱导的HeLa细胞死亡有协同作用,MG与CH-11一起作用HeLa细胞24h后细胞死亡率显著高于MG或CH-11单独处置组。
这些结果提示,细胞内Ca2+和Fas功能等细胞内信号参与了MG诱导的细胞凋亡[4]。
MG诱导了中等程度和持久的JNK活化和ERK灭活,而并非阻碍蛋白质水平。
提示这些激酶也参与了凋亡进程的起始时期[1]。
2抑制肿瘤转移
IkedaK等[13]在实验性和自发性转移模型中研究了MG在肿瘤转移中的抗转移作用及其机制。
通过实验性L5178Y-ML25淋巴瘤肝脾转移模型和实验性及自发性B16-BL6黑色素瘤肺转移模型研究了MG的抗肿瘤转移作用。
腹腔注射2或10mg/kgMG能显著抑制肝脾转移或肺转移。
在自发性B16-BL6黑色素瘤肺转移模型中,在肿瘤接种前后多次腹腔注射MG10mg/kg,能显著抑制肺转移和原发肿瘤的生长。
MG还能显著抑制B16-BL6细胞侵犯重建的基底膜,而并非阻碍细胞的生长。
这些体内实验的结果显示,MG表现出壮大的抗转移活性,其作用机制为抑制肿瘤细胞侵袭。
NagaseH等[14]的研究发觉:
MG和HK显著抑制人纤维肉瘤HT-1080细胞对基底膜的侵袭,作用呈剂量依托性;
抑制HT-1080细胞转移(浓度为100μmol/L);
不阻碍细胞生长及对基底膜的粘附。
紫杉醇和MG与HK的混合物对肿瘤侵袭和转移的抑制率别离为%和%。
HT-1080细胞分泌基质金属蛋白酶(MMP-9),在侵袭进程中降解细胞外基质。
MG与HK能抑制MMP-9活性,可能与其抑制肿瘤侵袭有关。
3抑制肿瘤血管形成
阻碍血管生成是MG抑制肿瘤增殖的作用机制之一。
在C57BL/6小鼠的背部皮下或右后足趾移植B16-BL6细胞,别离按时ip给予各类剂量的MG。
背部皮下移植肿瘤8d后和足趾移植21d后切除肿瘤,别离检测肿瘤的大小及新生血管数。
结果发觉,MG对背部皮下移植及右后足趾移植均有抑制肿瘤增殖的作用,新生血管数也明显减少[15]。
MG还能诱导大鼠血管滑腻肌细胞(VSMC)凋亡[16]。
MG5~20mmol/L浓度依托性诱导VSMC凋亡,该效应可被caspase抑制剂z-VAD-fmk50mmol/L所阻断。
MG显著增强caspase-3和caspase-9活性,降低线粒体电位。
MG浓度依托性下调Bcl-2水平,但并非阻碍Bcl-2相关性x蛋白(Bax)或Bcl-XL。
在动物模型中,球囊血管成形术诱导的新生内膜形成可被MG显著抑制,同时Bcl-2蛋白水平下降。
这些结果提示:
MG通过线粒体死亡途径诱导VSMC凋亡。
该效应是由下调Bcl-2蛋白水平介导的。
HK是一种无毒的血管形成抑制剂。
在体外,HK抑制内皮细胞株SVR增殖。
HK对原代培育的人内皮细胞的抑制作用强于对成纤维细胞的抑制,该抑制作用可被TNF-α(肿瘤坏死因子)相关性凋亡诱导配体的抗体所拮抗。
在裸鼠体内,HK对血管肉瘤高度有效[17]。
4抑制肿瘤细胞增殖,诱导肿瘤细胞分化
MG和HK能抑制多种肿瘤细胞增殖:
包括HeLa细胞[4]、B16-BL六、THP-一、BAE和HT-1080细胞株[9],人鳞状细胞肺癌CH27细胞株[1]和人淋巴样白血病细胞Molt4B[5]。
在培育的人COLO-205和Hep-G2肿瘤细胞株中[3],3~10mmol/LMG能剂量依托性抑制DNA合成,减少细胞数,但非变形细胞如角质形成细胞、成纤维细胞和人脐静脉内皮细胞(HUVEC),MG在这些浓度未发觉细胞毒性。
MG减少DNA合成且阻遏细胞周期停留在G0/G1期。
MG诱导的细胞周期阻遏作用只发生在当周期蛋白-CDK系统被抑制、p21蛋白表达被放大时。
在COLO-205细胞株皮下种植至裸鼠形成实体瘤模型中,MG腹腔注射可观看到85%以上显现的肿瘤消退。
在这些肿瘤中,可观看到p21蛋白水平表达增加。
FongWF等[18]研究发觉,低剂量的1,25-双羟维生素D3(VD3)和全反式维甲酸(ATRA)能诱导人白血病细胞株HL-60分化,MG与HK能增强该作用。
10~30mmol/LMG或HK处置后,表达膜分化标志CD11b和CD14的细胞增加至占总数的8%~16%,而阴性对照组仅为4%。
加用1mmol/LVD3后,MG或HK增加表达标志的细胞数从原先的30%增至50%~80%;
在MG或HK处置的细胞中加入20nmol/LATRA,表达CD11b的细胞从9%增至24%~70%,而表达CD14的细胞数不变。
在一样条件下,把MG或HK加入到VD3或ATRA处置的细胞中,结果发觉G0/G1期细胞数增加,p27(Kip1)表达增加。
p27(Kip1)是一种周期蛋白依托性激酶抑制剂,利用MEK抑制剂PD09805九、p38MARK抑制剂SB203580和JNK抑制剂SP600125的研究结果显示:
对在VD3和ATRA诱导的分化和MG或HK增强该分化作用的进程中,MEK途径起了重要的作用;
p38MARK途径起了抑制作用,而JNK途径与此无关。
可见,MG和HK是壮大的分化增强剂,它们可与低剂量VD3和ATRA联合用于医治急性早幼粒细胞白血病。
5阻断核因子NF-κB活化
NF-κB是调控了参与肿瘤血管生成、转移和细胞存活的一系列基因。
在4种肿瘤细胞株中,TNF-α诱导的NF-κB激活可被HK阻断。
HK不直接阻碍NF-κB与DNA结合,而是抑制由TNF-α激活的胞液内NF-κB抑制剂IKBα的磷酸化和降解。
HK还抑制内源性和TNF-α激活的上游IKB激酶(IKKs)活性,提示HK在阻断IKBα的磷酸化和降解中起了关键的作用。
在HeLa细胞中,HK能抑制由TNF-α激活的和NIK(NF-κB诱导的激酶)、野生型IKKβ、活化的IKKα和IKKβ或p65亚单位的短暂转染和表达激活的虫荧光素酶表达。
HK还可抑制NF-κB的p65亚单位的核移位及磷酸化。
HK抑制NF-κB调控的炎性和致癌基因产物,包括MMP-九、TNF-α、IL-八、ICAM-1和MCP-1。
在NF-κB活化的细胞株中,HK能增强TNF-γ诱导的细胞凋亡。
总之,HK通过抑制IKKs来抑制NF-κB活化和NF-κB调控的基因表达,可能是其抗肿瘤作用机制之一[19]。
6逆转肿瘤耐药
在人多发性骨髓瘤(MM)细胞株和复发的难治性MM患者的肿瘤细胞中,HK表现出显著的细胞毒性。
HK还能增强硼替佐米(bortezomib)诱导的MM细胞毒性和凋亡[10]。
在B-CLL患者原代培育细胞中,HK能克服凋亡耐受性。
用IL-4(支持B-CLL存活的一种细胞因子)预处置过的B-CLL细胞与HK孵育后显现凋亡。
HK能增强氟达拉滨(fludarabine)、克拉曲滨(cladribine)或苯丁酸氮芥(chlorambucil)的细胞毒作用[7]。
P-糖蛋白与大部份内源性和取得性肿瘤耐药有关,抑制P-糖蛋白表达是一种有效的逆转肿瘤药物耐药的方式。
在人乳房MDR肿瘤细胞株MCF-7/ADR中,HK能下调P-糖蛋白的表达,同时细胞内药物积聚,对阿霉素灵敏性部份恢复。
7结语
最近几年来,从中草药中寻觅平安有效的肿瘤化疗替代药物成为研究的热点之一。
MG和HK在体内外对多种肿瘤具有诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤转移、抑制肿瘤血管形成和诱导肿瘤细胞分化等作用,加上植物资源丰硕,使其具有良好的研究价值和进展前景。
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