植物病毒载体系统的研究及应用Word格式.docx
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科学家对植物病毒以及病毒和宿主之间的相互作用进行了深入地研究,对病毒基因组序列和调控机制的认识,使科学家在20世纪80年代初期提出利用植物病毒构建载体制作生物反应器,使外源蛋白、疫苗、药物等在植物体内的表达获得极大成功,现今已有多个植物表达载体系统构建成功。
随着模式植物拟南芥(Arabidopsisthaliana)、水稻、苜蓿、杨树等植物基因组序列测定的完成和更多的正在进行的植物基因组测序计划的完成,科学家们正面对大量未知功能的基因信息,现代生物学研究已进入到后基因组时代,即进行生物信息学、结构和功能基因组学、蛋白质组学研究等。
如何研究如此多基因的功能是生物学家所面对的主要问题,转录后基因沉默(post-transcriptionalgenesilencing,PTGS)的发现,为研究特定基因的功能提供了一个方向。
尤其是携带有内源性功能基因cDNA的植物病毒载体引起宿主内源性基因沉默,因其高效率和操作简单等优点在研究植物功能基因组学的过程中发挥举足轻重的作用。
1植物病毒载体系统的构建
载体的构建一般选择基因组为DNA的病毒,但自然界中的植物病毒多为RNA病毒,少有DNA病毒,并且DNA病毒复制过程的复杂性使这种病毒不适于构建植物病毒载体[1]。
随着逆转录酶的发现和广泛应用,将RNA病毒的基因组RNA反转录为cDNA再克隆到质粒载体中,通过质粒上的RNA聚合酶启动子,在宿主的RNA聚合酶作用下,转录成全长的病毒基因组RNA,最早由AhlquistP等人完成第一个RNA病毒载体的构建。
目前有多种RNA病毒家族的植物病毒用于构建病毒载体。
构建一个理想的植物病毒载体必须满足以下条件:
①该病毒基因组结构和功能清楚且能高水平地复制和翻译,具有有效的启动子,能引起局部和系统感染;
②病毒感染引起的症状轻微,弱毒株系;
③遗传稳定不易变异;
④宿主范围广;
⑤感染过程简单快速,可以机械侵染;
⑥外源基因包装大小不受限制;
⑦易于进行遗传操作;
⑧载体中不应含有引发PTGS的序列信息。
不同病毒由于其基因结构和功能不同,构建载体的策略方法也不同,目前常用于构建植物病毒载体的策略包括基因替代、插入融合、基因互补、抗原展示等。
1.1基因替代
基因替代是最早用于病毒载体的构建,主要指将外源基因替代病毒基因组内对病毒增殖、移动、组装等生命过程非必须的基因,如病毒侵染非必须的外壳蛋白基因(coatprotein,CP)、昆虫传播因子等。
但基因替代由于是由外源基因替代病毒本身基因,相当于删除掉病毒本身基因,所以存在很大的局限性,并且还受替代基因大小的限制。
最早采用基因替代策略构建的植物病毒载体为花椰菜花叶病毒(CaMV)。
用人酸性成纤维生长因子(aFGF)替代CMV的2b基因侵染烟草,表达的外源蛋白具有生物学活性且表达量占烟草可溶性蛋白的5%~8%。
表明通过基因替代构建植物病毒表达载体可成功获得具生物学活性的外源蛋白[2],但被替代的基因严格受片段大小的限制,一般不能超过250bp,并且寄主范围有限,和外源基因容易发生重组而丢失,极大地限制了应用范围。
此后用CAT(氯霉素乙酰转移酶)、GUS、GFP等报告基因替代雀麦花叶病毒(BMV),番茄丛矮病毒(TBSV)、番茄金黄花叶病毒(TGMV)、非洲木薯花叶病毒(ACMV)、黄瓜花叶病毒(CMV)、烟草花叶病毒(TMV)、大麦条纹花叶病毒(BSMV)、烟草脆裂病毒(TRV)、马铃薯X病毒(PVX)等病毒的CP基因都获得了表达载体,并且可包装的外源基因大小有了很大的提高,如PVX载体替代的GUS基因可达到1800bp。
外源基因替代病毒载体的CP基因后,虽然获得外源基因的表达,但表达水平都较低。
主要原因可能是CP与病毒的复制、局部或长距离运动以及病毒颗粒的包装、积累等有关,而外源基因的替代破坏了病毒本身的这些活性。
1.2基因插入融合
以外源基因替代病毒本身的基因打破病毒本身的基因平衡系统,造成病毒整体基因组的紊乱,引起病毒不能在宿主体内系统运动、外源基因表达水平低等不利结果。
为弥补这种缺陷,采取一种新的载体构建策略——插入融合,主要指将外源基因插入到病毒本身的启动子下游,或者将带有外源启动子的目的基因插入到病毒载体基因下游,使外源基因随病毒的增殖而表达,一般外源基因插入的位点通常选择病毒的CP基因启动子位点之后。
Dawson等首次将CAT基因插入到TMV的外壳蛋白启动子下游,重组载体表达CAT活性。
随后对其他植物病毒CP启动子下插入外源基因也获得表达,如BMV、PVX、PVY、BSMV、TMVE,WDV和TEV等[4,5],尤其PVX病毒可以侵染多种植物、复制水平高、外源基因可以高水平表达且比较稳定、无昆虫传播媒介等优点使其成为理想的构建载体。
如将GUS和GFP基因插入到病毒MP和CP之间,报告基因GUS和GFP在整株植物体内获得高水平表达,且在PVXCP亚基因组启动子调控下的外源基因很少发生同源重组而丢失。
如今PVX载体系统已有多种外源基因表达成功[6,7]。
Zhang等将外源基因插入到菜豆夹斑点病毒(BPMV)的MP和CP基因之间,构建表达载体,为了防止同源重组造成外源基因丢失,利用密码兼并性的特点替换掉基因重复的序列,结果表明在大豆中可以很好地表达GFP、番茄丛矮病毒编码的RNA沉默抑制子等外源蛋白[8]。
载体中双CP亚基因组启动子序列容易发生高频重组使外源基因丢失,使后代中极易出现野生型病毒,克服这种缺陷的一种方法是采用病毒亲缘关系较近的亚基因组启动子启动外源基因表达。
有研究者将其他烟草花叶病毒的亚基因组启动子插入到TMV构建了许多修饰后稳定的载体,如Kumagai等将齿兰环斑病毒(ORSV)的CP亚基因组启动子和CP基因插入到TMV载体中,用α-天花粉蛋白基因替代TMV的CP基因,重组后的载体在烟草中成功表达具有活性的α-天花粉蛋白。
1.3基因互补
基因互补是指把外源基因插入到有功能缺陷型病毒组分或亚病毒组分内,通过感染转基因植物或辅助病毒共侵染宿主来互补缺陷的功能。
虽然这种载体构建策略实际应用还没有完全普及,但在理论上已被多种病毒证实,并且已有成功的报道。
Walden等以缺陷性的CaMV病毒携带外源基因,野生型的CaMV或者另一种缺陷型的病毒作为辅助病毒共同侵染宿主,由于病毒可通过2种重组机制发生高频的重组,使外源基因丢失或出现野生型病毒而使载体的构建失败[9]。
为了克服这种缺陷,Hirochika等采用2个交替突变的CaMV病毒,其中一个携带外源基因,一个作为辅助病毒共侵染宿主,这样可以降低重组发生的频率,并且2种病毒可同时存在宿主体内,还可以克服被克隆外源基因的大小限制[10]。
其他的基因互补途径:
一是可将被外源基因替代的病毒基因通过农杆菌整合到宿主染色体基因组内,病毒重组载体侵染宿主后,利用宿主本身表达病毒基因来互补缺陷载体的功能,使病毒载体完成整个的生命活动,现今通过此种方法已成功构建几种病毒载体,如CaMV和TMV等;
二是利用亚病毒携带外源基因,完成复制功能需要辅助病毒共侵染。
如用CAT基因替代竹花叶病毒(bamboomosaicvirus,BaMV)卫星RNA的一个20kD的非结构蛋白,当重组载体与BaMV共接种后能系统地高水平表达CAT[11]。
另外病毒的缺损性干扰RNA(DI-RNA)也可用于构建载体系统,如兰花斑病毒(cymbidiumringspotvirus,CyRSV)DI-RNA中插入外源病毒的CP基因后,在辅助成分作用下稳定表达[12]。
Cai等构建中国株番茄黄萎病病毒卫星DNA载体诱导基因沉默,沉默效应最早出现在微管,随后扩展到整个植株,如果出现在种子中,这种效应可以出现在下一代,包括叶子、花、芽、茎杆、果实等多个器官和组织中,并可延续于植株的整个生命周期。
这种卫星DNA载体由于至少可以浸染7种番茄品种,显示其广泛的宿主范围,为未来番茄功能基因组研究提供一个有力的工具[13]。
构建亚病毒互补载体系统是一个很好的发展方向,并且在单子叶植物的应用中更受欢迎,但是载体的稳定性是影响它进一步应用的限制因素。
有研究表明其稳定性在很大程度上与插入位点有关,随着对病毒的侵染如何影响宿主的症状以及对病毒的运动能力等基本理论的深入了解,可大大加快此类载体的广泛应用。
1.4抗原展示
这种策略应用植物病毒的CP可与外源蛋白形成融合蛋白多肽的特点,通过在病毒的CP基因内选择性插入外源基因,在不影响病毒本身复制、包装、侵染的情况下将外源蛋白多肽呈现在病毒粒子的表面,通过提纯重组病毒粒子即可获得大量抗原。
并且这种方法可以大大增加一些小分子量抗原的免疫原性,更易被哺乳动物的免疫系统识别。
因此,这种载体的成功构建对于获得一些免疫原性较差的致病菌抗原蛋白具有重要的意义,如致病菌疫苗的获得、小分子多肽药物制备等。
如利用豇豆花叶病毒(cowpeamosaicvirus,CPMV)构建的外源蛋白表达载体成功地在CPMV粒子表面表达了多种致病菌的抗原蛋白,如口蹄疫病毒(FMDV)、艾滋病毒-1(HIV-1)、人鼻病毒-14(HRV-14)、犬细小病毒(CPV)、慢性肺炎病菌(pseudomonasaeruginosa)外层膜蛋白的F抗原和疟疾抗原等,并且这些融合抗原在动物体内试验中都显示出强烈的免疫原性。
另外,在烟草花叶病毒(tobaccomosaicvirus,TMV)、番茄丛矮病毒(tomatobushystuntvirus,TBSV)、李痘病毒(plumpoxvirus,PPV)、马铃薯x病毒(potatovirusX,PVX)和苜蓿花叶病毒(alfalfamosaicvirus,ALMV)等病毒中都成功构建外源抗原展示载体[14-16]。
抗原展示载体构建成功需要有一个基本的条件,即对该病毒的基因组和CP基因结构有充分地了解,以便外源基因能成功地插入正确的位点。
并且这种载体也受外源基因大小的限制,如TMV抗原展示载体系统仅能融合表达小分子量的短肽,如小于23个氨基酸的小肽,如果过大就会影响病毒的组装,甚至使病毒的生长速率减慢;
即使基因组结构最熟悉的CPMV抗原展示系统,外源基因如果小于120bp左右时可以很好的表达。
这种缺点限制了抗原展示载体的广泛应用,但作为生物反应器用来合成疫苗或药物,无疑植物作为宿主最为合适,并且已经成功的例子也给今后的研究指明了方向。
2植物病毒载体系统的应用
2.1基础研究领域的应用
2.1.1研究基因重组。
利用病毒载体可以对病毒RNA剪切、DNA介导的重组、农杆菌T-DNA和转座子转移以及甲基化等进行研究,这些研究都涉及病毒基因内或者基因间的重组,为深入认识病毒基因的重组机制、重组效率和位点及外源基因丢失等提供良好的工具。
Schoelz等利用携带有转基因VI的CaMV载体来研究基因的重组,发现在病毒基因组间以及病毒和转基因植物之间会发生重组,如CaMV载体可发生基因重组使载体恢复为野生型病毒[17]。
用CAT替代TBSV的外壳蛋白基因构建载体,侵染转TBSV-CP基因的植株,结果发生重组使载体恢复为野生型病毒。
2.1.2研究病毒移动。
病毒表达载体除了可以表达外源抗原蛋白外,还可以用来研究病毒在宿主体内的系统侵染过程。
Giesman-Cookmeyer等用香石竹环斑驳病毒(RCNMV)移动蛋白基因替代TMV的移动蛋白基因构建表达载体,在宿主体内表达的香石竹环斑驳病毒移动蛋白可辅助TMV在宿主体内细胞与细胞之间的移动,表明病毒的异源移动蛋白可以促进不相关病毒的移动[18]。
另外,用BMV载体表达烟草花叶病毒移动蛋白基因也证明异源病毒移动蛋白的此种作用[19]。
用GUS基因替代TEV病毒的CP基因构建表达载体,发现CP参与了病毒在宿主细胞内的移动,而长距离的移动需要辅助成分蛋白酶的协助。
用TMV载体融合表达GFP报告基因,通过GFP的表达可以了解与病毒移动有关亚细胞结构成分[20]。
2.1.3研究基因功能。
利用病毒载体在植物体内表达某一外源基因,通过植株表型的变化来了解基因的功能,获得有用基因。
最早Stanley用BNYVV基因N替代CaMV的基因Ⅱ,引起宿主的过敏反应,而正常的CaMV并不引起此类坏死反应,说明基因N可能引起宿主的过敏反应[21]。
PVX载体也可用来鉴定一些植物基因的功能,如Rommens等利用PVX载体在番茄中表达对除草剂Fenthion敏感的Fen基因,结果表明,那些对除草剂Fenthion不敏感的叶片也变得敏感,随后对PVX-Fen构建产物进行突变分析,确定Fen基因的功能结构域[22]。
另外,利用植物病毒载体携带其内源基因也可以通过其表型的改变来研究其功能,Pignatta等利用携带有Mg2+螯合酶和八氢番茄红素脱氢酶基因的番茄丛矮病毒改造载体转染本氏烟草。
该载体具有病毒的外壳蛋白,在感染的早期,植株的表型改变只出现在感染部位的几个叶片,随着感染时间的延长,植株的各个部位都出现了表型的改变,这种结果为研究植物的内源性基因功能提供了思路和方向[23]。
视网膜母细胞瘤相关蛋白(RBR)控制细胞的分裂和分化,在进化上非常保守,动物植物都含有此蛋白。
Jordan等利用携带视网膜母细胞瘤相关蛋白基因的番茄金花叶病毒载体,通过微粒注射的方法转染处于发育中的烟草叶片,结果烟草叶片的发育出现缺陷,如细胞大量死亡、形状改变、数量减少、形态变小等,定量PCR表明RBR基因在侵染4周后转录水平下降,表明细胞分裂的不正常激活对植株来说是致死的,同时RBR也展示了一些与细胞分裂没有关系的其他功能[24]。
2.1.4研究基因沉默。
利用植物病毒载体研究基因沉默的机制、鉴定基因沉默的抑制子以及通过基因沉默分析植物特定基因的功能已经成为当今功能基因组学研究最主要的手段。
最早由Kumagai等在TMV载体上插入番茄红素脱氢酶基因(PDS)的部分序列,侵染本氏烟草后成功诱导PDS的沉默,使植株出现光漂白症状。
但TMV载体不稳定,容易发生功能的下降,为了克服这种缺点,Ruiz等将PDS基因插入到PVX载体内,侵染本氏烟草后再次成功地实现PDS基因的沉默。
烟草脆裂病毒(TRV)基因沉默载体,由于其可侵染的宿主范围广、可通过一些致病线虫传播、诱导基因沉默的效率高、持久性好、可侵染分生组织和花等器官以及引起宿主温和的病症等优点已经成为研究基因沉默的主要载体,逐渐成为研究植物功能基因组学的主要工具[25]。
通过卫星病毒构建载体不仅可引起内源性的基因沉默,还可以引起转基因的沉默,还可同时引起2个基因沉默,且持久性和稳定性都优于其他载体,并不引起宿主病理性症状,这些优点很有可能使卫星病毒载体成为未来研究基因沉默的主要体系。
Yaegashi等通过携带有GFP的苹果潜在球形病毒(ALSV)载体转染可以表达GFP的转基因烟草,转染5d后,被转染的叶片上小GFP斑点消失,12d后整个叶子上的斑点消失,21d后大部分叶片上的斑点消失,表明ALSV也可以用于诱导内源性基因沉默的研究[26]。
Qian等构建烟草卷叶病毒(TbCSV)的卫星DNA病毒载体,将DNAβ上的βC1基因用多克隆位点替代,然后将此载体与GFP和叶绿体内Mg2+螯合酶基因的片段连接,与辅助病毒共同侵染烟草,可以看到明显的基因沉默现象。
这种修饰的卫星DNA病毒载体可能为反向基因组学时代大规模研究基因功能提供一个强有力的工具[27]。
2.2生产应用
植物病毒表达载体最有价值的用途是商业应用,使植物作为生物反应器生产一些具有生物学活性的蛋白质多肽,尤其是生产疫苗和药物蛋白,迄今为止,已经有多种疫苗和药用蛋白获得成功表达[28-30]。
3存在问题和展望
利用植物病毒构建载体首先要考虑的是安全性问题。
病毒是植物的主要病原菌,大多病毒具有较广的寄主范围,虽然经过修饰的病毒载体相对比较安全,不会引起严重症状和大规模扩散,但已有试验证明,植物病毒载体在宿主体内会发生高频重组产生野生型病毒[17]。
其次是载体的稳定性问题。
植物病毒载体的稳定性很低,一般经过几代后外源基因就会丢失,即使是比较稳定的PVX载体,最终也会发生双亚基因组启动子同源重组,而丢失外源基因。
另外,病毒蛋白二级结构的变化也会影响载体的稳定性。
最后是外源基因大小的限制。
目前构建成功携带外源基因最大的植物病毒载体为PVX载体,也仅仅是1800bp,而对于TMV和CPMV载体来说,外源基因的大小更是受到严格限制,一般是30~60bp比较合适,太大就会影响病毒的增殖和组装。
虽然应用植物病毒载体可以进行广泛的基础生物学研究和具有潜力巨大的商业价值,但植物病毒载体这些问题没有彻底解决之前,大规模的应用病毒载体还为时尚早,尤其是安全性的问题,否则会造成植物病毒害的大规模流行和新的生态问题。
虽然植物病毒载体还存在以上的问题需要解决,但其诱人的应用前景值得人们去探索、去研究,在后基因组时代,通过植物病毒载体的基因沉默来特异性地沉默植物的某些基因,通过表型的改变来研究基因的功能越来越受到人们的重视[31,32]。
另外,植物病毒表达载体具有许多其他载体无法具有的表达水平高、增殖速度快、易于遗传操作、宿主范围广和外源蛋白易于纯化和保存等优点,使它在应用方面非常受欢迎。
尤其在植物体内表达口服疫苗和药用蛋白,与其他生产口服疫苗和药用蛋白的方法相比较,可大大降低成本且服用方便,这些优点使植物有可能成为生产外源蛋白的最大生物反应器。
4参考文献
[1]PORTAC,LOMONOSSOFFGP.Virusesasvectorsfortheexpressionofforeignsequencesinplants[J].BiotechnolGenetEngRev,2002(19):
245-291.
[2]MATSUOK,HONGJS,TABAYASHIN,etal.DevelopmentofCu-cumbermosaicvirusasavectormodifiablefordifferenthostspeciestoproducetherapeuticproteins[J].Planta,2007,255
(2):
277-286.
[3]GRONENBORNB,GARDNERRC,SCHAEFERS,etal.PropagationofforeignDNAinplantsusingcauliflowermosaicvirusasvector[J].Biotechnology,1992,294(24):
371-373.
[4]WANGZD,UEDAS,UYEDAI,etal.Positionaleffectofgeneinsertionongeneticstabilityofacloveryellowveinvirus-basedexpressionvector[J].GenPlantPathology,2003,96(5):
327-334.
[5]DOLJAVV,MCBRIDEHJ,CARRINGTONJC.Taggingofplantpotyvirusreplicationandmovementbyinsertionofbeta-glucuronidaseintotheviralpolyprotein[J].ProcNatlAcadSciUSA,1992,89(21):
10208-10212.
[6]RAVINNV,MARDANOVAES,KOTLYAROVRY,etal.Completesequencingofpotatovirusxnewstraingenomeandconstructionofviralvectorforproductionoftargetproteinsinplants[J].Biochemistry(Mosc),2008,73
(1):
44-49.
[7]CEROVSKAN,HOFFMEISTEROVAH,PECENKOVAT,etal.Tran-sientexpressionofHPV16E7peptide(aa44-60)andHPV16L2peptide(aa108-120)onchimericpotyvirus-likeparticlesusingPotatovirusX-basedvector[J].ProteinExprPurif,2008,58
(1):
154-161.
[8]ZHANGC,GHABRIALSA.DevelopmentofBeanpodmottlevirus-basedvectorsforstableproteinexpressionandsequence-specificvirus-inducedgenesilencinginsoybean[J].Virology,2006,344
(2):
401-411.
[9]WALDENRM,HOWELLSH.Intergenomicrecombinationeventsamongpairsofdefectivecauliflowermosaicvirusgenomesinplants[J].MolApplGenet,1982,1(5):
447-456.
[10]HIROCHIKAH,HAYASHIK.Anewstrategytoimproveacauli-flowermosaicvirusvector[J].Gene,1991,105
(2):
239-241.
[11]LINNS,LEEYS,LINBY,etal.TheopenreadingframeofbamboomosaicpotexvirussatelliteRNA
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