吐血推荐考研分子生物学复习总结Word下载.docx
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6.减少循环次数
问题3:
拖尾
产物在凝胶上呈Smear状态。
1.模板不纯
2.Buffer不合适
3.退火温度偏低
4.酶量过多
5.dNTP、Mg2+浓度偏高
1.纯化模板
2.更换Buffer
3.适当提高退火温度
4.适量用酶
5.适当降低dNTP和镁离子的浓度
问题4:
假阳性
空白对照出现目的扩增产物
靶序列或扩增产物
的交*污染
1.操作时应小心轻柔,防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外;
2.除酶及不能耐高温的物质外,所有试剂或器材均应高压消毒。
所用离心管
及加样枪头等均应一次性使用。
3.各种试剂最好先进行分装,然后低温贮存
PCR引物设计的黄金法则(转自tiangen)
1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。
DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。
在NCBI上搜索不同物种的同一基因,通过序列分析软件(比如DNAman)比对(Alignment),各基因相同的序列就是该基因的保守区
2.引物长度一般在15~30碱基之间。
引物长度(primerlength)常用的是18-27bp,但不应大于38,因为过长会导致其延伸温度大于74℃,不适于TaqDNA聚合酶进行反应。
3.引物GC含量在40%~60%之间,Tm值最好接近72℃。
GC含量(composition)过高或过低都不利于引发反应。
上下游引物的GC含量不能相差太大。
另外,上下游引物的Tm值(meltingtemperature)是寡核苷酸的解链温度,即在一定盐浓度条件下,50%寡核苷酸双链解链的温度。
有效启动温度,一般高于Tm值5~10℃。
若按公式Tm=4(G+C)+2(A+T)估计引物的Tm值,则有效引物的Tm为55~80℃,其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。
4.引物3′端要避开密码子的第3位。
如扩增编码区域,引物3′端不要终止于密码子的第3位,因密码子的第3位易发生简并,会影响扩增的特异性与效率。
5.引物3′端不能选择A,最好选择T。
引物3′端错配时,不同碱基引发效率存在着很大的差异,当末位的碱基为A时,即使在错配的情况下,也能有引发链的合成,而当末位链为T时,错配的引发效率大大降低,G、C错配的引发效率介于A、T之间,所以3′端最好选择T。
6.碱基要随机分布。
引物序列在模板内应当没有相似性较高,尤其是3’端相似性较高的序列,否则容易导致错误引发(Falsepriming)。
降低引物与模板相似性的一种方法是,引物中四种碱基的分布最好是随机的,不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。
尤其3′端不应超过3个连续的G或C,因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。
7.引物自身及引物之间不应存在互补序列。
引物自身不应存在互补序列,否则引物自身会折叠成发夹结构(Hairpin)使引物本身复性。
这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。
引物自身不能有连续4个碱基的互补。
两引物之间也不应具有互补性,尤其应避免3′端的互补重叠以防止引物二聚体(Dimer与Crossdimer)的形成。
引物之间不能有连续4个碱基的互补。
引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话,应尽量使其△G值不要过高(应小于4.5kcal/mol)。
否则易导致产生引物二聚体带,并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。
8.引物5′端和中间△G值应该相对较高,而3′端△G值较低。
△G值是指DNA双链形成所需的自由能,它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性,△G值越大,则双链越稳定。
应当选用5′端和中间△G值相对较高,而3′端△G值较低(绝对值不超过9)的引物。
引物3′端的△G值过高,容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。
(不同位置的△G值可以用Oligo6软件进行分析)
9.引物的5′端可以修饰,而3′端不可修饰。
引物的5′端决定着PCR产物的长度,它对扩增特异性影响不大。
因此,可以被修饰而不影响扩增的特异性。
引物5′端修饰包括:
加酶切位点;
标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等;
引入蛋白质结合DNA序列;
引入点突变、插入突变、缺失突变序列;
引入启动子序列等。
引物的延伸是从3′端开始的,不能进行任何修饰。
3′端也不能有形成任何二级结构可能。
10.扩增产物的单链不能形成二级结构。
某些引物无效的主要原因是扩增产物单链二级结构的影响,选择扩增片段时最好避开二级结构区域。
用有关软件(比如RNAstructure)可以预测估计mRNA的稳定二级结构,有助于选择模板。
实验表明,待扩区域自由能(△G°
)小于58.6lkJ/mol时,扩增往往不能成功。
若不能避开这一区域时,用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。
11.引物应具有特异性。
引物设计完成以后,应对其进行BLAST检测。
如果与其它基因不具有互补性,就可以进行下一步的实验了。
值得一提的是,各种模板的引物设计难度不一。
有的模板本身条件比较困难,例如GC含量偏高或偏低,导致找不到各种指标都十分合适的引物;
用作克隆目的的PCR,因为产物序列相对固定,引物设计的选择自由度较低。
在这种情况只能退而求其次,尽量去满足条件。
做RealTime时,用于SYBRGreenI法时的一对引物与一般PCR的引物,在引物设计上所要求的参数是不同的。
引物设计的要求:
1)避免重复碱基,尤其是G.
2)Tm=58-60度。
3)GC=30-80%.
4)3'
端最后5个碱基内不能有多于2个的G或C.
5)正向引物与探针离得越近越好,但不能重叠。
6)PCR扩增产物长度:
引物的产物大小不要太大,一般在80-250bp之间都可;
80~150bp最为合适(可以延长至300bp)。
7)引物的退火温度要高,一般要在60度以上;
要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在。
而且引物设计时应该考虑到引物要有不受基因组DNA污染影响的能力,即引物应该跨外显子,最好是引物能跨外显子的接头区,这样可以更有效的不受基因组DNA污染的影响。
至于设计软件,PRIMER3,PRIMER5,PRIMEREXPRESS都应该可以的。
做染料法最关键的就是寻找到合适的引物和做污染的预防工作。
对于引物,你要有从一大堆引物中挑出一两个能用的引物的思想准备---寻找合适的引物非常不容易。
关于BLAST的作用应该是通过比对,发现你所设计的这个引物,在已经发现并在GENEBANK中公开的不物种基因序列当中,除了和你的目标基因之外,还有没有和其他物种或其他序列当中存在相同的序列,如和你的目标序列之外的序列相同的序列,则可能扩出其他序列的产物,那么这个引物的特异性就很差,从而不能用。
关于分子生物学方面的实验设计题,要求对现在流行的一些实验技术有了解
一、蛋白质的各级结构
蛋白质的结构可划分为4个层次,即一级结构、二级结构、三级结构、四级结构。
其中,一级结构即基本结构,
二级、三级、四级属于空间结构。
维持的力:
一级:
主要是肽键,还有二硫键;
二级:
是氢键;
三级:
是次级键,包括:
二硫键、氢键、盐键、范德华力、疏水作用(主要);
四级:
是非共价键,包括:
氢键、盐键、范德华力、疏水作用。
维持蛋白质一级、二级、三级、四级结构的作用力分别是什么?
有弱作用力,包括疏水作用,范德华作用力,氢键和荷电基团相互作用,还有就是共价键作用,就是肽键和二硫键及部分金属键。
一级结构主要是肽键连接的氨基酸序列,二级结构除了肽键还有以氢键为主的弱作用力,他的螺旋由氢键维持,三级结构则主要靠疏水作用力维持,还可能有二硫键的,如胰岛素(尚有争议,有人认为是四级结构),四级结构也主要由疏水作用力将亚基聚合在一起,以上所有结构中的作用力,肽键自然是必须的,但弱作用力也都涉及到,只是有主次之分。
至于上面提到的金属键则肯能出现在三级结构中,因为残基数量较少,蛋白质不能稳定存在,可有部分金属离子来作为配体使他稳定,如ferredoxin
蛋白质的生物活性不仅决定于蛋白质分子的一级结构,而且与其特定的空间结构密切相关。
异常的蛋白质空间结构很可能导致其生物活性的降低、丧失,甚至会导致疾病,疯牛病,Alzheimer'
s症等都是由于蛋白质折叠异常引起的疾病。
蛋白质如何在细胞内正确地折叠?
为什么这个过程有时会失败?
过去四十年间关于蛋白质折叠过程的研究集中在当变性剂被缓冲液稀释后变性的蛋白质如何再重新折叠这一问题上。
但是这样的体外研究与真正的细胞内情况相去甚远。
强调活体细胞内的蛋白质正常折叠、异常折叠的研究,尤其是折叠催化剂、分子伴侣和大分子的参与是这一领域目前的研究热点。
在功能和结构细节上阐明关于蛋白质折叠的过程将对相关疾病的预防和治疗有重要意义。
肽单位(peptideunit):
又称为肽基(peptidegroup),是肽键主链上的重复结构。
是由参与肽链形成的氮原子,碳原子和它们的4个取代成分:
羰基氧原子,酰氨氢原子和两个相邻α-碳原子组成的一个平面单位。
蛋白质一级结构(primarystructure):
指蛋白质中共价连接的氨基酸残基的排列顺序。
蛋白质二级结构(protein在蛋白质分子中的局布区域内氨基酸残基的有规则的排列。
常见的有二级结构有α-螺旋和β-折叠。
二级结构是通过骨架上的羰基和酰胺基团之间形成的氢键维持的。
蛋白质三级结构(proteintertiarystructure):
蛋白质分子处于它的天然折叠状态的三维构象。
三级结构是在二级结构的基础上进一步盘绕,折叠形成的。
三级结构主要是靠氨基酸侧链之间的疏水相互作用,氢键,范德华力和盐键维持的。
蛋白质四级结构(proteinquaternarystructure):
多亚基蛋白质的三维结构。
实际上是具有三级结构多肽(亚基)以适当方式聚合所呈现的三维结构。
超二级结构(super-secondarystructure):
也称为基元(motif).在蛋白质中,特别是球蛋白中,经常可以看到由若干相邻的二级结构单元组合在一起,彼此相互作用,形成有规则的,在空间上能辨认的二级结构组合体。
结构域(domain):
在蛋白质的三级结构内的独立折叠单元。
结构域通常都是几个超二级结构单元的组合。
二硫键(disulfidebond):
通过两个(半胱氨酸)巯基的氧化形成的共价键。
二硫键在稳定某些蛋白的三维结构上起着重要的作用。
范德华力(vanderWaalsforce):
中性原子之间通过瞬间静电相互作用产生的一弱的分子之间的力。
当两个原子之间的距离为它们范德华力半径之和时,范德华力最强。
强的范德华力的排斥作用可防止原子相互靠近。
α-螺旋(α-heliv):
蛋白质中常见的二级结构,肽链主链绕假想的中心轴盘绕成螺旋状,一般都是右手螺旋结构,螺旋是靠链内氢键维持的。
每个氨基酸残基(第n个)的羰基与多肽链C端方向的第4个残基(第4+n个)的酰胺氮形成氢键。
在古典的右手α-螺旋结构中,螺距为0.54nm,每一圈含有3.6个氨基酸残基,每个残基沿着螺旋的长轴上升0.15nm.
β-折叠(β-sheet):
蛋白质中常见的二级结构,是由伸展的多肽链组成的。
折叠片的构象是通过一个肽键的羰基氧和位于同一个肽链的另一个酰氨氢之间形成的氢键维持的。
氢键几乎都垂直伸展的肽链,这些肽链可以是平行排列(由N到C方向)或者是反平行排列(肽链反向排列)。
β-转角(β-turn):
也是多肽链中常见的二级结构,是连接蛋白质分子中的二级结构(α-螺旋和β-折叠),使肽链走向改变的一种非重复多肽区,一般含有2~16个氨基酸残基。
含有5个以上的氨基酸残基的转角又常称为环(loop)。
常见的转角含有4个氨基酸残基有两种类型:
转角I的特点是:
第一个氨基酸残基羰基氧与第四个残基的酰氨氮之间形成氢键;
转角Ⅱ的第三个残基往往是甘氨酸。
这两种转角中的第二个残侉大都是脯氨酸。
二、五种以上的方法确定蛋白质之间的相互作用
利用体内足迹法分析蛋白质-DNA的相互作用。
足迹法是一种用来测定DNA-蛋白质专一性结合的方法。
用于检测与特定蛋白质结合的DNA序列的部位,可展示蛋白质因子同特定DNA片段之间的结合区域。
其原理为:
DNA和蛋白质结合以后便不会被DNAase分解,在测序时便出现空白区(即蛋白质结合区),从而了解与蛋白质结合部位的核苷酸对数目。
在用酶移出与蛋白质结合的DNA后,又可测出被结合处DNA的序列
检测两种蛋白质之间相互作用的实验方法比较
研究蛋白-蛋白相互作用是理解生命活动的基础。
蛋白质—蛋白质互作网络是生物信息调控的主要实现方式,是决定细胞命运的关键因素。
检测蛋白质间相互作用的实验方法有哪些?
这些检测方法各有什么优缺点?
总结如下。
1.生化方法
●共纯化、共沉淀,在不同基质上进行色谱层析(需要补充)
●蛋白质亲和色谱
基本原理是将一种蛋白质固定于某种基质上(如Sepharose),当细胞抽提液经过改基质时,可与改固定蛋白相互作用的配体蛋白被吸附,而没有吸附的非目标蛋白则随洗脱液流出。
被吸附的蛋白可以通过改变洗脱液或者洗脱条件而回收下来。
GSTpulldown技术:
为了更有效的利用蛋白质亲和色谱,可以将待纯话的蛋白以融合蛋白的形式表达,即将”诱饵“蛋白与一种易于纯化的配体蛋白融合。
例如与GST融合的蛋白再经过GSH的色谱柱时,就可以通过GST和GSH的相互作用而被吸附。
当载有细胞抽提物经过柱时,就可以得到能够与“诱饵”蛋白相互作用的目标蛋白了。
Epitope-tag技术:
表位附加标记技术
就是将附加的抗原融合到目的蛋白以检测目的蛋白的表达,同时还可以通过亲和层析法来纯化目的蛋白。
缺点:
表位附加标记可能会使融合蛋白不稳定,改变或使融合蛋白功能丧失。
以上两种方法都要共同的缺点:
假阳性。
实验所检测到的相互作用可能时由蛋白质所带电荷引起的,并不是生理性的相互作用;
蛋白的相互作用可能并不是直接的,可是由第三者作为中介的;
有时会检测到两种在细胞中不可能相遇却有极强亲和力的蛋白。
因此实验结果还应经其他方法验证。
●免疫共沉淀免疫共沉淀是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。
改法的优点是蛋白处于天然状态,蛋白的相互作用可以在天然状态下进行,可以避免认为影响;
可以分离得到天然状态下相互作用的蛋白复合体。
缺点:
免疫共沉淀同样不能保证沉淀的蛋白复合物时候为直接相互作用的两种蛋白。
另外灵敏度不如亲和色谱高。
●Far-Western
又叫做亲和印记。
将PAGE胶上分离好的凡百样品转移到硝酸纤维膜上,然后检测哪种蛋白能与标记了同位素的诱饵蛋白发生作用,最后显影。
缺点是转膜前需要将蛋白复性。
2.
等离子表面共振技术(Surfaceplasmonresonance)
该技术是将诱饵蛋白结合于葡聚糖表面,葡聚糖层固定于几十纳米厚的技术膜表面。
当有蛋白质混合物经过时,如果有蛋白质同“诱饵”蛋白发生相互作用,那么两者的结合将使金属膜表面的折射绿上升,从而导致共振角度的改变。
而共振角度的改变与该处的蛋白质浓度成线性关系,由此可以检测蛋白质之间的相互作用。
该技术不需要标记物和染料,安全灵敏快速,还可定量分析。
需要专门的等离子表面共振检测仪器。
3.
遗传学方法使某处发生缺损,检测对其他地方的影响。
●基因外抑制子。
基因外抑制子是通过一个基因的突变来弥补原有基因的突变。
比如相互作用的蛋白A和B,如果A发生了突变使两者不再相互作用,此时B如果再发生弥补性突变就可以使两者的相互作用恢复,那么B就是A的基因外抑制子。
需要知道基因,要有表型,筛选抑制子比较费时。
●合成致死筛选
指两个基因同时发生突变会产生致死效应,而当每个基因单独发生突变时则无致死效应。
用于分析两个具有相同重要蛋白之间的相互作用。
4.
双杂交技术
原理基于真核细胞转录因子的结构特殊性,这些转录因子通常需要两个或以上相互独立的结构域组成。
分别使结合域和激活域同诱饵蛋白和猎物蛋白形成融合蛋白,在真核细胞中表达,如果两种蛋白可以发生相互作用,则可使结合域和激活域在空间上充分接近,从而激活报告基因。
自身有转录功能的蛋白会造成假阳性。
融合蛋白会影响蛋白的真实结构和功能。
不利于核外蛋白研究,会导致假隐性。
5.
荧光共振能量转移技术
指两个荧光法色基团在足够近(<
100埃)时,它们之间可发生能量转移的现象。
荧光共振能量转移技术可以研究分子内部对某些刺激发生的构象变化,也能研究分子间的相互作用。
它可以在活体中检测,非常灵敏,分辩率高,能够检测大分子的构象变化,能够定性定量的检测相互作用的强度。
缺点此项技术要求发色基团的距离小于100埃。
另外设备昂贵,还需要融合GFP给蛋白标记。
此外还有交联技术(cross-linKing),蛋白质探针技术,噬菌体展示技术(Phagedisplay)以及生物信息学的方法来检测蛋白质之间相互作用。
三、酵母双杂交
酵母双杂交技术和免疫共沉淀技术在研究蛋白质相互作用方面的优缺点的比较
酵母双杂交技术
优势:
1。
大规模筛选,
2。
操作简单,直观(可以用荧光做报告基因,也可以用氨基酸缺陷型平板筛选等)
传统的酵母双杂交技术不能研究膜蛋白的相互作用。
由此派生出的新技术研究膜蛋白的相互作用较困难。
酵母双杂交技术研究的目的蛋白相互作用需在酵母细胞核内发生相互作用,那么新的问题产生了:
如果酵母双杂交技术显示两个蛋白相互作用(也就是在酵母细胞核内,这两个蛋白确实相互作用),但是两个相互作用蛋白在原宿主内却位于不同细胞器(也就是他们不可能出现在同一个位置),那么假阳性就产生了,由此出现的例子很多。
虽然有上述不足,但是酵母双杂交技术还是大大推动了蛋白质相互作用研究。
免疫共沉淀技术:
能弥补上述酵母双杂交技术的不足,但是没有上述酵母双杂交技术的优势。
两个技术结合使用,能互相补充彼此缺陷,叠加优势。
酵母双杂交系统由Fields和Song等首先在研究真核基因转录调控中建立。
典型的真核生长转录因子,如GAL4、GCN4、等都含有二个不同的结构域:
DNA结合结构域(DNA-bindingdomain)和转录激活结构域(transcription-activatingdomain)。
前者可识别DNA上的特异序列,并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游,转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用,启动它所调节的基因的转录。
酵母双杂交系统能在体内测定蛋白质的结合作用,具有高度敏感性。
主要是由于:
①采用高拷贝和强启动子的表达载体使杂合蛋白过量表达。
②信号测定是在自然平衡浓度条件下进行,而如免疫共沉淀等物理方法为达到此条件需进行多次洗涤,降低了信号强度。
③杂交蛋白间稳定度可被激活结构域和结合结构域结合形成转录起始复合物而增强,后者又与启动子DNA结合,此三元复合体使其中各组分的结合趋于稳定。
④通过mRNA产生多种稳定的酶使信号放大。
同时,酵母表型,X-Gal及HIS3蛋白表达等检测方法均很敏感。
免疫共沉淀co-immunoprecipitation定义:
用抗体将相应特定分子沉淀的同时,与该分子特异性结合的其他分子也会被带着一起沉淀出来的技术。
这种技术常用于验证蛋白质之间相互特异性结合。
免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。
是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。
其原理是:
当细胞在非变性条件下被裂解时,完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留了下来。
如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X,那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。
这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合;
也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。
免疫共沉淀优点
(1)相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的,处于天然状态;
(2)蛋白的相互作用是在自然状态下进行的,可以避免人为的影响;
(3)可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。
免疫共沉淀缺点
(1)可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质-蛋白质相互作用;
(2)两种蛋白质的结合可能不是直接结合,而可能有第三者在中间起桥梁作用;
(3)必须在实验前预测目的蛋白是什么,以选择最后检测的抗体,所以,若预测不正确,实验就得不到结果,方法本身具有冒险性。
免疫共沉淀实验流程
(1)转染后24-48h可收获细胞,加入适量细胞裂解缓冲液(含蛋白免疫共沉淀
酶抑制剂),冰上裂解30min,细胞裂解液于4°
C,最大转速离心30min后取上清;
(2)取少量裂解液以备Westernblot分析,剩余裂解液加1μg相应的抗体加入到细胞裂解液,4°
C缓慢摇晃孵育过夜;
(3)取10μlproteinA琼脂糖珠,用适量裂解缓冲液洗3次,每次3,000rpm离心3min;
(4)将预处理过的10μlproteinA琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中4°
C缓慢摇晃孵育2-4h,使抗体与proteinA琼脂糖珠偶连;
(5)免疫沉淀反应后,在4°
C以3,000rpm速度离心3min,将琼脂糖珠离心至管底;
将上清小心吸去,琼脂糖珠用1ml裂解缓冲液洗3-4次;
最后加入15μl的2×
SDS上样缓冲液,沸水煮5分钟;
(6)SDS-PAGE,Westernblotting或质谱仪分析。
注意的问题:
(1)细胞裂解采用温和的裂解条件,不能破坏细胞内存在的所有蛋白质-蛋白质相互作用,多采用非离子变性剂(NP40或TritonX-100)。
每种细胞的裂解条件是不一样的,通过经验确定。
不能用高浓度的变性剂(0.2%SDS),细胞裂解液中要加各种酶抑制剂,如商品化的cocktailer。
(2)使用明确的抗体,可以将几种抗体共同使用 (3)使用对照抗体:
单克隆抗体:
正常小鼠的IgG或另一类单抗 兔多克隆抗体:
正常兔IgG
免疫共沉淀注意的问题
(1)确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的,而并非外源非特异蛋白,单克隆抗体的使用有助于避免污染的发生;
(2)要确保抗体的特异性,即在不表达抗原的细
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