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综合以上两个发现以及更为详细的晶体结构,他们确信他们发现了第二十二种由DNA编码的氨基酸——吡咯赖氨酸。
他们还认为,这个新的氨基酸是一个非常罕见的氨基酸,所以这么多年后才被发现。
然而,Krzycki相信它也可能存在于其他有机体内。
对此Chan表示同意并指出,发现第二十二种氨基酸将激励更多的研究者去寻找第二十三种乃至第二十四种氨基酸。
随着更多种生物的基因组序列被破译,有理由认为某些有趣的事情迟早会发生。
小结
氨基酸是一类同时含有氨基和羧基的有机小分子。
组成多肽和蛋白质的氨基酸除Gly外,都属于L型的α-氨基酸(Pro为亚氨基酸)。
氨基酸不仅可以作为寡肽、多肽和蛋白质的组成单位或生物活性物质的前体,也可以作为神经递质或糖异生的前体,还能氧化分解产生ATP。
目前已发现蛋白质氨基酸有22种,其中20种最为常见,而硒半胱氨酸和吡咯赖氨酸比较罕见。
非蛋白质氨基酸通常以游离的形式存在,作为代谢的中间物和某些物质的前体,具有特殊的生理功能。
22种标准氨基酸可使用三字母或单字母缩写来表示。
某些标准氨基酸在细胞内会经历一些特殊的修饰成为非标准蛋白质氨基酸。
氨基酸有多种不同的分类方法:
根据R基团的化学结构和在pH7时的带电状况,可分为脂肪族氨基酸、不带电荷的极性氨基酸、芳香族氨基酸、带正电荷的极性氨基酸和带负电荷的极性氨基酸;
根据R基团对水分子的亲和性,可分为亲水氨基酸和疏水氨基酸;
根据对动物的营养价值,可分为必需氨基酸和非必需氨基酸。
氨基酸的性质由其结构决定。
其共性有:
缩合反应、手性(Gly除外)、两性解离、具有等电点,以及氨基酸氨基和羧基参与的化学反应,包括与亚硝酸的反应、与甲醛的反应、Sanger反应、与异硫氰酸苯酯的反应和与茚三酮的反应等。
与亚硝酸的反应可用于VanSlyke定氮,与甲醛的反应可用于甲醛滴定,Sanger反应和与异硫氰酸苯酯的反应可用来测定N-端氨基酸。
只有脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应产生黄色物质,其余生成蓝紫色物质,利用此反应可对氨基酸进行定性或定量分析。
多数氨基酸的侧链可能发生特殊的反应,可以此鉴定氨基酸。
不同氨基酸在物理、化学性质上的差异可用来分离氨基酸,其中最常见的方法是电泳和层析。
第二章蛋白质的结构
一级结构决定高级结构
蛋白质的高级结构由其一级结构决定的学说最初由ChristianB.Anfinsen于1954年提出。
在1950年之前,Anfinsen一直从事蛋白质结构方面的研究。
在进入美国国立卫生研究所(NIH)以后,继续从事这方面的研究。
当时他最想知道的是:
一个蛋白质是如何折叠成它独特的三维构象的?
需不需要其他酶的帮助?
蛋白质为什么要采取特定的构象?
ChristianB.Anfinsen
然而,要想了解蛋白质的折叠过程,首先需要建立一种方法能够测量或评估蛋白质的构象,其次还需要找到一种手段用以检测折叠过程。
Anfinsen以牛胰核糖核酸酶(ribonuclease)为研究对象轻而易举地解决了第一个问题(实际上选用此酶的部分原因是当时的芝加哥肉类加工公司能够为他的实验室随时提供足够的原材料),因为核糖核酸酶催化RNA的水解,其酶活性完全取决于其特定的三维构象,于是酶活性成为测量这种蛋白质采取何种构象的一种方法。
但要观测折叠过程既可以从一个新合成的尚没有折叠的蛋白质开始,也可以在体外将一个已折叠好的蛋白质去折叠(unfold),然后再观察它的再折叠(refold)过程。
Anfinsen选择了后一种途径。
事实上,这种酶特别适合用后一种途径进行研究,首先因为二硫键是决定其分子形状的主要因素。
另外,此酶是一种单纯蛋白质,只有124个氨基酸残基组成,含有4个二硫键,而且其活性很容易通过测定水解RNA释放出来的核苷酸量来测定。
Anfinsen和两个博士后MichaelSela、FredWhite在研究中发现,使用高浓度的巯基试剂——β-巯基乙醇(β-mercaptoethanol)可将二硫键还原成自由的巯基,如果再加入尿素,进一步破坏已被还原的核糖核酸酶分子内部的次级键,则该酶将去折叠转变成无任何活性的无规卷曲。
对还原的核糖核酸酶的物理性质进行分析的结果清楚地表明了它的确采取的是无规卷曲的形状。
在成功得到一种去折叠的核糖核酸酶以后,Anfinsen着手开始研究它的重折叠过程了。
考虑到被还原的核糖核酸酶要在已被还原的8个Cys残基上重建4对二硫键共有105种不同的组合,但只有一种是正确的形式,如果决定蛋白质构象的信息一直存在于氨基酸序列之中,那么,最后重折叠得到的总是那种正确的形式。
否则,重折叠将是随机的,最后只能得到少量的正确形式。
显然,第一种情形能完全恢复去折叠过程中丧生的酶活性,而后一种情况只能恢复很少的酶活性。
Anfinsen的重折叠实验还是比较顺利的,他通过透析的方法除去了导致酶去折叠的尿素和巯基乙醇,再将没有活性的酶转移到其生理缓冲溶液之中,在有氧气的情况下于室温放置,以使巯基能重新氧化成二硫键。
经过一段时间以后,发现核糖核酸酶活性得以恢复,这意味着它原来的构象恢复了(图2-47)。
由于上述过程没有细胞内任何其他成分的参与,完全是一种自发的过程,因此,有理由相信此蛋白质正确折叠所需要的所有信息全部存在于它的一级结构之中。
很快,Anfinsen的研究成果被发表在1954年《生物化学杂志》(JournalofBiologicalChemistry,JBC)上。
进一步的实验确定了变性的核糖核酸酶完全恢复其活性的条件,在此基础上,Anfinsen提出了蛋白质折叠的热力学假说(thermodynamichypothesis)。
根据此假说,一个蛋白质的天然三维构象对应于在生理条件下其所处的热力学最稳定的状态。
热力学稳定性由组成的氨基酸残基之间的相互作用决定,于是蛋白质的三维构象直接由它的一级结构决定。
图2-47
牛胰核糖核酸酶的变性和复性实验
尽管Anfinsen的工作奠定了蛋白质折叠的热力学基础,他也因此获得了1972年的诺贝尔化学奖,但是蛋白质折叠是相当复杂的。
到现在为止,我们仍然不能根据一个蛋白质的一级结构推断出它的三维结构。
同时,还必须注意到,蛋白质在体外的折叠比在细胞内的折叠要慢得多!
肽是氨基酸之间以肽键相连的聚合物,它包括寡肽、多肽和蛋白质。
氨基酸是构成肽的基本单位。
线形肽链都含有N端和C端,书写一条肽链的序列总是从N端到C端。
肽键具有部分双键的性质,多为反式,也有顺式。
酰胺平面中Cα-N单键旋转的角度称为Φ,Cα-C单键旋转的角度称为ψ。
Φ和ψ决定了相邻两个肽单位在空间上的相对位置。
2~10个氨基酸残基组成的肽为寡肽,12~50个氨基酸残基组成的肽为多肽,由50个以上的氨基酸残基组成的肽通常被称为蛋白质。
天然存在的活性肽有的是在核糖体上合成,有的在核糖体以外的地方由特定的酶依次催化而成。
寡肽的理化性质包括两性解离、双缩脲反应等。
蛋白质的结构一般包括一级结构、二级结构、三级结构和四级结构,二级结构、三级结构和四级结构被称为高级结构,一种蛋白质的全部三维结构一般被称为它的构象。
蛋白质的一级结构是指氨基酸在多肽链上的排列顺序,含二硫键的蛋白质的一级结构还包括二硫键的数目和位置。
蛋白质的二级结构是指多肽链的主链骨架本身在空间上有规律的折叠和盘绕,它是由氨基酸残基非侧链基团之间的氢键决定的。
常见的二级结构有α螺旋、三股螺旋、β折叠、β转角、β凸起和无规卷曲。
α螺旋中肽链骨架围绕一个轴以螺旋的方式伸展,它可能是极性的、疏水的或两亲的。
β折叠是肽链的一种相当伸展的结构,有平行和反平行两种。
如果β股交替出现极性残基和非极性残基,那么就可以形成两亲的β折叠。
β转角指伸展的肽链形成180°
的U形回折结构而改变了肽链的方向。
β凸起是由于β折叠股中额外插入一个氨基酸残基而形成的,它也能改变多肽链的走向。
无规卷曲是在蛋白质分子中的一些极不规则的二级结构的总称。
无规卷曲无固定走向,有时以环的形式存在,但不是任意变动的。
从结构的稳定性上看,右手α螺旋>β折叠>U型回折>无规卷曲,但在功能上,酶与蛋白质的活性中心通常由无规卷曲充当,α右手螺旋和β折叠一般只起支持作用。
蛋白质的三级结构是指多肽链在二级结构的基础上,进一步盘绕、卷曲和折叠,形成主要通过氨基酸侧链以次级键以及二硫键维系的完整的三维结构。
三级结构通常由模体和结构域组成。
稳定三级结构的化学键包括氢键、疏水键、离子键、范德华力、金属配位键和二硫键。
模体可用在一级结构上,特指具有特殊生化功能的序列模体,也可被用于功能模体或结构模体,相当于超二级结构。
结构模体是结构域的组分,基本形式有αα、βαβ和βββ等。
常见的模体包括:
左手超螺旋、右手超螺旋、卷曲螺旋、螺旋束、α螺旋-环-α螺旋、Rossmann卷曲和希腊钥匙模体。
结构域是在一个蛋白质分子内的相对独立的球状结构和/或功能模块,由若干个结构模体组成的相对独立的球形结构单位,它们通常是独自折叠形成的,与蛋白质的功能直接相关。
一个结构域通常由一段连续的氨基酸序列组成。
根据其占优势的二级结构元件的类型,结构域可分为五大类:
α结构域、β结构域、α/β结构域、α+β结构域、交联结构域。
以上每一类结构域的二级结构元件可能有不同的组织方式,每一种组织就是一种结构模体。
这些结构域都有疏水的核心,疏水核心是结构域稳定所必需的。
确定一个蛋白质的三级结构的方法有X射线晶体衍射和NMR。
可以用不同的模型来展示蛋白质的三维结构,常见的模型有:
线框模型、球棍模型、棍式模型、空间填充模型、骨架模型和丝带模型。
具有两条和两条以上多肽链的寡聚蛋白质或多聚蛋白质才会有四级结构。
组成寡聚蛋白质或多聚蛋白质的每一个亚基都有自己的三级结构。
蛋白质的四级结构内容包括亚基的种类、数目、空间排布以及亚基之间的相互作用。
驱动四级结构形成或稳定四级结构的作用力包括氢键、疏水键、范德华力和离子键。
具有四级结构的蛋白质具有特殊的优势,不适当的四级结构的相互作用会影响到某些蛋白质的功能。
蛋白质是高度柔性的分子,其柔性是生物功能所必需的。
三级结构的柔性允许蛋白质适应它们的配体。
蛋白质柔性随着功能的不同而不同,并不是所有的蛋白质的柔性都一样。
蛋白质折叠的基本规律包括:
一级结构决定高级结构;
蛋白质的折叠伴随着自由能的降低,但是并不通过随机尝试找到自由能最低的构象;
是协同和有序的过程;
绝大多数需要分子伴侣的帮助。
某些蛋白质的折叠还需要蛋白质二硫键异构酶和肽基脯氨酸异构酶的帮助。
蛋白质折叠经过启动过程形成结构域,再经熔球态中间体最终形成完整的三维结构。
蛋白质在溶液中折叠的驱动力有:
肽链内的氢键释放水,增加水的熵;
疏水侧链倾向聚合以尽可能减少与水接触的疏水面积;
亲水残基面向表面与水接触,增加溶解性。
细胞内错误折叠的蛋白质来不及处理就可能导致机体的病变。
与蛋白质错误折叠相关的疾病有阿尔茨海默病、帕金森病和牛海绵状脑病等。
蛋白质高级结构可以通过预测来进行研究。
与预测蛋白质的三级结构相比,二级结构的预测要容易一些,因为20多种标准氨基酸残基具有形成不同二级结构的倾向。
对于两种主要的二级结构而言,α螺旋可被视为多肽链的默认二级结构状态,因为α螺旋与β折叠相比具有熵的优势。
目前使用从头计算法预测三维结构还很不成功。
获得一种蛋白质精确的三级结构仍然需要借助于X射线衍射和NMR。
可以对蛋白质单独进行功能预测或者与结构预测结合起来。
第三章蛋白质结构与功能的关系
一种多功能蛋白质的发现
以前分子生物学里有一个基本观点,就是一个基因决定一条多肽链,而一条多肽链只具有一种特殊的功能。
但随着分子克隆技术的发展,越来越多已知活性的蛋白质及其基因被克隆、测序和比对以后发现,蛋白结构与活性之间不再是个单纯的一对一的关系了。
1987年,芬兰Oulu大学的Pihlajaniemi在研究人体胶原蛋白的时候就发现了这样的例外。
TainaPihlajaniemi
胶原蛋白是人体中含量最多的蛋白质,其二级结构是由三条相同的多肽链互相缠绕而成的三股螺旋,每条肽链上含有多个Gly—X—Y重复序列,其中X位置主要是Pro,Y位置主要是羟脯氨酸(Hyp)。
胶原蛋白三股螺旋结构的稳定性与Y位置上脯氨酸有多少被羟基化有关,因此,催化Pro羟基化的脯氨酸羟化酶(prolyl-4-hydroxylase)是决定胶原蛋白稳定性的一个十分重要的酶。
脊椎动物的这个酶是由2个α基和2个β亚基组成的四聚体。
α亚基和β亚基分别由不同的基因编码。
不论α或β亚基,单独都没有活性,但β亚基的单克隆抗体能使整个酶失去活性,而只有α和β亚基同时存在的时候,酶才能与它的辅助因子——抗坏血酸结合,这说明β亚基的确是表现酶活性的重要组成部分。
但奇怪的是,α及β亚基在细胞内的表达并不一致。
β亚基的数量远远高于α亚基,因此α亚基合成后立刻会与β亚基结合成有活性的脯氨酸羟化酶,而留下许多单独存在的β亚基。
那么单独的β亚基会有其他的功能吗?
既然蛋白质的一级结构决定蛋白质的高级结构,而蛋白质的高级结构又决定它的功能,那么如果知道了一种蛋白质的一级结构,不仅可以预测和解释这个蛋白质的高级结构和功能,同时还可以将这个蛋白与其他已知功能的蛋白质进行序列比对,从而有可能发现新的功能。
Pihlajaniemi在得到脯氨酸羟化酶β亚基的一级结构以后,也将它的氨基酸序列输入计算机,在互联网上和其他已知的蛋白质的氨基酸序列进行比对。
出乎意料的是,她发现人类脯氨酸羟化酶β亚基中94%的氨基酸与小鼠的蛋白质二硫键异构酶(proteindisulfideisomerase,PDI)相同。
她用纯化的β亚基也检测到它的确有PDI的酶活性,再用克隆的β亚基的cDNA作探针,发现人类细胞中只有一个基因具有类似的碱基序列。
因此PDI很可能就是单独的脯氨酸羟化酶的β亚基。
换句话说,一个基因表达出来的蛋白质在不同的条件下可以同时具有两种完全不同的酶活性。
PDI早在1963年就在鼠肝和胰腺组织中被发现,其主要功能是催化蛋白质上二硫键的交换反应,具有较广的底物特异性。
PDI在体外能够促进被变性和还原的含有二硫键的蛋白质(如胰岛素、溶菌酶、核黄素结合蛋白和抗体等)重获活性。
当一个蛋白质的天然构象遭尿素破坏,而其二硫键也被还原剂打破以后,若要恢复这个蛋白质原来正确的构象,不仅要除去尿素,同时还要让二硫键重新形成,并恢复到原来正确的连接,PDI就可以加速这个“尝试错误、发现正确”的过程。
但PDI在人体内是否也扮演同样的角色则仍是未知数。
有了这个后知之明,再去看PDI在体内分布的情形,发现PDI的活性主要集中在内质网,这很容易让人们想起它可能在分泌蛋白折叠过程中起作用,因为许多分泌蛋白都含有二硫键。
而后来的许多研究证明,PDI的确就具有这种功能。
那么,β亚基的功能是不是就到此为止了呢?
1991年,J.R.Wetteran等使用氨基酸序列分析和免疫化学分析发现一种由大小两个亚基组成的微粒体三酰甘油转移蛋白(microsomaltriglyceridetransferprotein,MTP)的小亚基与脯氨酸羟化酶的β亚基一模一样。
但MTP的PDI酶活性仅是自由PDI的十分之一。
后来又有人发现,单独的β亚基在细胞内还充当甲状腺素结合蛋白(thyroidhormonebindingprotein,THP)。
迄今为止,已经发现了许多多功能蛋白,像哺乳动物的脂肪酸合酶居然具有7种酶活性外加一种酰基载体蛋白的功能。
多功能蛋白质的存在不仅可以提高基因的编码功能,而且还可能有利于对蛋白质的活性进行调控。
蛋白质可视为生物功能试剂,几乎每一项细胞活动都牵涉到一种或多种特定的蛋白质。
蛋白质的主要功能包括分子识别、酶、分子开关和结构支持。
分子识别是蛋白质功能的中心。
配体与蛋白质的特异性结合受到形状、互补性和极性相互作用的控制。
蛋白质表面大分子配体的结合位点可能是凹陷、突起或“平地”;
小分子配体的结合位点是裂缝、口袋或空穴。
蛋白质和配体结合的亲和力主要归于无方向性的疏水作用,结合的特异性主要归于具有方向性的力,如氢键。
蛋白质的功能由其特定的三维结构决定。
每一种蛋白质都具有特定的结构和特定的功能,高级结构决定其功能。
蛋白质的一级结构决定其高级结构和功能,一级结构相似的蛋白质具有相似的功能。
功能相似的蛋白往往在进化上具亲缘关系,一级结构相似的蛋白质往往具有共同的起源。
许多疾病是由相关的蛋白质结构异常引起的。
纤维状蛋白质由几条肽链铰合而成,难溶于水,它们倾向于形成规则的长的曲线结构,这是由其一级结构的高度规律性决定的。
它们的主要功能是在结构或机械上,为生物体提供坚实的支架。
α-角蛋白来源于动物的毛发、角、鸟喙和爪子。
每一个α-角蛋白分子在其中央形成典型的α螺旋,而两端为非螺旋区。
两个α-角蛋白分子通过疏水的R基团的结合,相互缠绕形成双股的卷曲螺旋,这大大地提高了α螺旋的稳定性。
链间形成的多个二硫键还可进一步提高α-角蛋白的强度。
β-角蛋白主要来源于蚕丝和蜘蛛丝中的丝心蛋白,其一级结构具有重复序列Gly—Ala/Ser—Gly—Ala/Ser;
二级结构主要是反平行β折叠。
Gly和Ala/Ser分别分布于折叠片层的两侧,使得相邻的β折叠更加紧密地堆积形成网状结构,赋予蛛丝较高的抗张强度,同时α螺旋又赋予蛛丝一定的柔软性。
相邻的β角蛋白之间无共价交联。
胶原蛋白是动物细胞外基质的一种成分,其基本组成单位是由3条α链组成的原胶原分子。
原胶原的一级结构具有重复的Gly—X—Y三联体序列。
X和Y通常是Pro。
胶原蛋白富含Gly和Pro的性质使得它难以形成α螺旋,但有规律重复的三联体序列促进三条胶原蛋白链之间形成三股螺旋。
球状蛋白质的结构与功能要比纤维状蛋白复杂。
属于球状蛋白的珠蛋白家族都含有血红素辅基,都能够可逆地结合氧气,都含有珠蛋白折叠这样的结构模体。
属于这一类家族的有Mb、Hb、Ngb和Cygb。
Mb存在于肌肉中,其功能主要是贮存和运输O2,此外还能解除NO的毒性。
Mb的分子表面形成一个深的疏水口袋,血红素“藏”在洞中。
该口袋允许O2进入而阻止H2O的进入,既保证了Fe2+结合O2又可防止Fe2+的氧化。
Mb的氧合曲线是双曲线,这使得它倾向于结合O2而非释放O2,只有在pO2极低的时候才释放出O2。
Hb存在于红细胞,其功能是运输氧气。
Hb由四个亚基组成,每个亚基的一、二和三级结构与Mb相似。
Hb氧合曲线因为它与O2结合具有正协同效应而呈S形,只有在pO2很高的情况下Hb才结合氧气,而pO2一旦降低,它就释放O2。
Hb的正协同效应是指Hb分子中一个亚基结合O2后,可以导致其构象发生变化,使其他亚基对O2的亲和力突然增强。
可使用Hill系数对Hb的正协同效应进行评估:
n=1,无协同效应;
n>1,为正协同效应;
n<1,为负协同效应。
H+、CO2和2,3-BPG等小分子配体对Hb的氧合也产生影响。
其中H+和CO2促进Hb释放O2,这样的效应被称为波尔效应。
2,3-BPG可与脱氧Hb上的位于两条β亚基之间的带正电荷的空洞结合,稳定T态,显著降低Hb与O2的亲和力,促进Hb在组织中释放O2。
HbS是Hb的突变体,它直接导致镰状细胞贫血。
HbS导致溶血的原因在于其β亚基的Glu6突变成Val6以后,HbS由于疏水键而聚集在红细胞表面使细胞膜破裂。
Ngb和Cygb是近期发现的珠蛋白,Ngb主要在脊椎动物的大脑和视网膜细胞中表达,Cygb几乎在脊椎动物所有的细胞和组织中都能表达。
与Mb和Hb不同的是,Ngb和Cygb的血红素辅基上的铁在没有氧气结合的时候,已有6个配位键,故O2或其他配体需要取代HisE7形成的配位键后才能与血红素结合。
此外,Ngb和Cygb含有链内二硫键。
Ig是一类由B淋巴细胞分泌的糖蛋白,可与特异的抗原结合而激发特定的免疫反应。
Ig由2条重链和2条轻链组成,分子内有大量的二硫键。
多肽链分为C区和V区。
IgG的二级结构几乎全是β折叠,由无规卷曲连接。
IgG的三级结构由12个球形结构域组成,每个均被二硫键锁住。
抗体在结合抗原的前后,其构象从Y型变成T型。
生物膜的各种功能是由各种结构不同的膜蛋白完成的。
膜蛋白可分为外周蛋白、内在蛋白和脂锚定蛋白。
膜蛋白与非膜蛋白含有相同的二级结构元件,其中α螺旋是最常见的二级结构,β折叠也时有发现。
目前常使用的功能预测法主要包括:
基于序列的途径、基于结构的途径、结构与序列比对法、基于模体的方法和基于“连坐”的功能预测等。
第四章蛋白质的性质、分类及研究方法
NGF的纯化
NGF是一种扩散性分泌多肽,其作用是促进神经元的存活(neuralsurvival)和分化。
RitaLevi-Montalcini一直在VictorHamburger实验室从事神经胚胎学(neuroembryology)的研究,主要研究移植或去除鸡趾对神经系统发育的影响。
他在研究中发现,移植的鸡趾不仅能发育,而且还能受到神经的支配(innervated)。
神经解剖显示,受神经支配的鸡趾大小与在合适的位置支配鸡趾的神经元数目相吻合,即移植的鸡趾越大,支配它的神经元数目就越多。
进一步研究表明,移植多余的鸡趾不仅能够增加支配它的神经元数目,而且还能增加位于其他位置不是支配它的神经元数目。
于是,他认为可能有一种扩散性的分泌因子,能够在一定的距离范围内增加神经元
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