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翻译Ghostpeakswithnotes
文稿
边栏附注
前言
嗨,我是RonMajors,安捷伦公司的资深科学家,和我一起给大家讲解的是BillChampion,HPLC技术支持部的一位化学家,现在我们继续LC故障排除系列讨论。
现在我们将讨论鬼峰[showghostpuppet]。
对于这类峰我们还有除“鬼峰”以外的其它几种叫法,如“伪峰”、“异常峰”、“假峰”等。
所有这些术语都意味着色谱图中的这些峰没有准确反映样品的组成。
鬼峰可能来自LC系统的污染,来自流动相的污染或来自样品的污染。
我们将讨论如何识别其来源和如何纠正或补救它。
Bill:
我经常与这样的一些客户讨论,他们观察到一些色谱峰,并且他们认为这些峰不应该出现在色谱图上。
确定其来源并消除这些伪峰极具挑战性,甚至有时是令人沮丧的。
正如Ron所言,这些色谱峰可能来自于LC系统、流动相,或者样品制备。
我们将按顺序依次讨论这些鬼峰的来源[editor:
showtopictitlesonscreen,underlined,astheyareintroduced]:
∙先前进样的残留分析物被洗脱—该问题极易确认并解决。
这是一个简单的色谱问题。
∙流动相污染—该问题更令人困惑且更难于确认;但易于纠正。
∙样品制备—该问题是隐伏性的并难于确认。
它可能是一个化学问题。
∙系统污染—对于现代仪器而言,它通常不是“鬼”峰的来源。
但是我们也将简要讨论一些判断鬼峰是否来自于仪器的方法。
∙色谱柱污染—色谱柱几乎永远不可能是“鬼”峰的来源,但是人们时常把其来源归咎于色谱柱。
我们将简要讨论色谱柱的清洗方法。
色谱柱污染是一个非常严重的问题;但是色谱柱污染更多的是影响柱压、峰形并可能影响样品的回收率。
这些污染通常是由不干净的样品造成的。
RonMajors是一位安捷伦公司的资深科学家。
BillChampion是安捷伦HPLC色谱柱技术支持部的一位化学家。
产生鬼峰的众多原因:
∙先前进样残留分析物的洗脱
∙流动相污染
∙样品制备过程
∙系统污染
∙色谱柱污染
先前进样残留物的洗脱
Bill:
这是一个进样分析氯苯那敏的例子。
[insertphantom_peaks.gif]氯苯那敏是一种抗组胺药。
我喜欢这个例子,因为它能很好地说明几个概念。
马来酸氯苯那敏是由马来酸和氯苯那敏生成的盐。
顺便说一句,当我们的样品是盐时,通常我们会观察到两个色谱峰,一个来自酸(此例中为马来酸),另一个来自碱(此例中为氯苯那敏)。
在溶液中盐发生解离,酸性和碱性成分通常分别流过色谱柱。
运行此分析的色谱人员最初认为她得到了一个氯苯那敏和马来酸同时被洗脱出来的峰。
正如我之前所言,这是不太可能的。
她随后又进了一针添加了伪麻黄碱的单样,得到右图所示的结果。
[indicatewitharrow]这非常令人困惑—她添加了一个单一组分,却得到两个额外色谱峰。
Ron:
[cameraonghostpuppetonly]其实是这样的:
[cameratoRon]
由于我们的分析是在pH11的碱性条件下运行的,所以我们得到的第一个色谱峰为离子化的马来酸,第二个色谱峰为伪麻黄碱,在仪器运行一段时间后,还观察到第三个色谱峰。
第三个色谱峰实际上来自前一针进样的氯苯那敏。
因为氯苯那敏的亲脂性比马来酸或伪麻黄碱更强(因此更容易保留到色谱柱上)并且因为前一针运行时间短(7min),在第一次进样超过15min后氯苯那敏也没有被洗脱出来。
出现在下一张色谱图中的这种色谱峰往往被称作“迟滞”峰,因为该色谱峰是从前一针进样中延迟而来的。
如果用户让色谱图运行大约20min,那么就会得到第二个氯苯那敏的色谱峰了。
在方法开发中,我们经常采用快速梯度洗脱—如在10或15min内流动相由10%乙腈变到90%乙腈来大致了解样品中所含化合物的数量和它们的相对保留时间。
我们将在另一个话题中讨论梯度洗脱。
但是即使运用等度洗脱分离,我们也总是先采用洗脱力较强的流动相,如采用75%甲醇和/或较高流速以实现在更合理的时间里所有化合物均流出色谱柱。
对于150mm,5µm色谱柱而言,我们可以使用2mL/min的流速。
另一个判断是否“迟滞”峰的线索是,它一般比邻近的色谱峰要宽。
[Insertphantom_peaks2.gif][editor:
pointoutwidepeakatright].
在等度洗脱时,我们几乎从不会发现如图所示的,在如此靠近像伪麻黄碱色谱峰一样窄峰的地方有一个宽峰。
由于理论塔板数和保留时间与峰宽比值的平方呈正比,所以如果计算出某色谱峰的理论塔板数异常的低,这意味着该峰可能为“迟滞”峰。
[Insertcolumn_efficiency.gif]或者更简单地说,峰宽应与保留时间呈正比。
因此不正常的宽色谱峰可能就是迟滞峰。
[insertcolumn_efficiency_with_overlay.gif]
马来酸极易离子化,在反相色谱中只有极小的保留—实际上,在本例中它的保留时间与死时间非常接近。
伪麻黄碱的极性比马来酸小,但是比氯苯那敏大。
因此在反相色谱中,它们的洗脱顺序为马来酸、伪麻黄碱,然后是氯苯那敏。
先前进样的残留分析物在新运行中被洗脱出现的色谱峰称为“迟滞峰”。
它们是造成色谱分析人员困扰的原因之一。
采用一个快速的梯度洗脱—例如在10或15min内流动相由10%乙腈变化到90%乙腈来大致了解样品中化合物的数量和它们的相对保留时间。
即使采用等度洗脱分离,也应该先采用洗脱力较强的流动相,如采用75%甲醇和/或较高流速以实现在更合理的分析时间里所有化合物均流出色谱柱,这是一个非常好的实验习惯。
一条判断迟滞峰的线索:
-它们往往比同次运行的其它色谱峰更宽
流动相污染
Ron:
不幸的是人们还没有充分意识到在HPLC中使用高纯度溶剂的重要性。
Bill:
我有时会接到那些发现鬼峰但又无法去除它们的用户的电话。
通常这些用户都坚信这些“鬼”峰是由于色谱柱或仪器某个部位的污染引起的。
它们的特征是:
[editor:
showchartbelowonscreenasthisisdiscussed,orputtypeonscreentoalignwithkeypoints]
即使长时间冲洗后,“污染”也未见减少。
∙某色谱峰(或多峰)仅在运行梯度程序时出现。
∙甚至在不进样而仅运行梯度程序时色谱峰(或多峰)也会出现,而且其大小不会随后续的多次进样而减小。
现在通常很难说服人们相信这个问题出在流动相而非什么东西“粘”在了色谱柱上。
设计一些实验来证明这些问题实际上仅与流动相有关通常是非常必要的。
我知道我第一次遇到流动相污染问题时我也不相信。
Ron:
其实是这样:
流动相中含有一种杂质(或一些杂质),在固定相上有部分保留。
那就意味着最初用某种强度的流动相,如25%乙腈,杂质在流动相和固定相之间有一个平衡浓度。
在达到平衡后,如果您再运行一个梯度程序,那么平衡将向流动相中杂质相对浓度增加的方向移动。
那就意味着杂质将以谱带形式流出,通常会被看做色谱峰。
有几种方法可以证明这个峰来自流动相。
污染物可能存在于流动相添加剂,如三氟乙酸、甲酸、缓冲剂等等。
因此应在没有任何添加剂的条件下运行梯度程序,以确定流动相添加剂中是否有污染物。
污染物也可能存在于水中。
有时候人们使用“纯化”水,而非HPLC专用水。
因此请采用HPLC专用水,无论是来自室内纯化水系统还是瓶装的HPLC专用水。
要特别注意的是室内制水系统的纯度指标监测应该基于电导率而不是以UV吸收作为指标的。
电导率为离子含量的量度标准,与UV纯度无关。
使用室内制水系统,必须经常更换活性炭过滤器。
一些用户制备纯水时使用旧的反相制备色谱柱去除水中的疏水性污染物。
您可以通过改变水源,观察鬼峰是否被消除或有所改变。
[insertwater_sources.gif]这张色谱图展示了不同来源水的基线差异。
Bill:
污染物也可能存在于有机溶剂中。
因此再次强调要使用新的HPLC级溶剂,甚至可能的话换用其它厂商的溶剂。
[insertacetrontrile_example.gif]这张色谱图展示了不同来源乙腈的背景响应。
值得注意的是在下部的色谱图中没有出现上部色谱图中的小峰。
[editor:
pointoutlowertracepeaks]
另一种方法:
如果使用乙腈出现该现象,用甲醇替换或反之亦然。
使用高纯度的HPLC级溶剂对获得良好的色谱结果是非常重要的。
流动相污染的特征:
∙即使长时间冲洗后,“污染”也未见减少。
∙某色谱峰(或多峰)仅在运行梯度程序时出现。
∙甚至在不进样而仅运行梯度程序时色谱峰(或多峰)也会出现,而且其大小不会随后续的多次进样而减小。
判断是否流动相污染是产生鬼峰的原因
一种证明鬼峰来自流动相的方法是改变梯度程序。
如果您不熟悉梯度洗脱操作,请观看我们制作的有关梯度洗脱的视频片段。
当完成一个梯度洗脱后,我们必须让色谱柱回到初始的流动相组成状态。
这步操作被称作再平衡,可以快速恢复到初始梯度溶剂组成或通过一个负梯度程序完成,虽然后者较慢但有时更有效。
一旦梯度比例恢复到初始流动相组成,我们还需要短暂的一段时间使系统稳定,并获得一条平稳的基线。
这段时间被称作平衡时间。
如果您的流动相中存在杂质,在这段平衡时间内这些污染物就可能不被弱流动相洗脱,并聚集在色谱柱柱头处。
平衡时间越长,污染物在色谱柱上积聚的就越多。
Ron:
那么让我们来看一个操作,您可以通过该操作来判断污染是否来自流动相。
我们可以参考屏幕上的图来解释该操作。
[insertcontamination_equilibration.jpg]
这三张空白色谱图(未进样只运行梯度程序)分别使用了不同的平衡时间。
值得注意的是在这三张色谱图中均出现了基线漂移。
这个基线漂移有可能是杂质造成的,但更可能是由于缓冲系统或示差折光效应影响吸光度的变化导致的。
我们的讨论不涉及这种漂移,我们关心的是5.5-6.2min时间段出现的色谱峰。
[editor:
showimageagainandpointoutpeaks]这些色谱峰可能会干扰目标峰的测定。
因此我们必须清楚它们的来源并设法消除它们。
蓝色(下部)[pointout]色谱图代表了已经设定好平衡时间为10分钟的原始梯度程序。
我们可以通过观察在5.5-6.2min时间段内大约6个色谱峰各自的峰高(峰面积)变化作为证据。
因此,要判断污染是否来自流动相,我们只需额外多平衡5min,平衡总时间为15min(见中部色谱图)[pointout]。
值得注意的是杂质峰的峰高(峰面积)[pointout]仅稍稍增加。
因此接下来的梯度程序中我们额外多平衡了10min,正如我们所看到的上部空白色谱图[pointout],峰高(峰面积)的增加更显著了。
我们可以重复该实验以确保该空白色谱图可以重现,进一步证明杂质的积聚可以根据预期重现。
这一系列实验表明来自流动相中一些痕量杂质的污染会随着平衡时间的加长而积聚增加。
从这些结果里,我们无法判断杂质来自两种流动相溶剂中的哪一个,所以每种溶剂都需要按照前面讨论过的方法进行进一步考察。
一种用于判断是否是由于流动相污染而产生鬼峰的方法:
∙-改变梯度程序并在再平衡过程中观察基线走势。
∙-平衡时间越长,污染物在色谱柱上积聚的就越多。
流动相添加剂的污染
Bill:
我有一个关于诸如缓冲剂或者酸等流动相添加剂的简要评说。
一些添加剂,如三氟乙酸(TFA),可能会产生背景吸收,它也是杂质的一个来源。
我们推荐使用高纯度的TFA试剂。
一些公司出售安瓿瓶装的高纯度TFA。
这些试剂往往有更高的纯度,部分是因为TFA没有暴露在空气中。
另一个早已认识到但一直没有引起重视的问题是TFA的紫外吸收光谱会随着乙腈/水比例的变化而变化。
随着乙腈量的增加,TFA的紫外吸收增大。
该现象引起基线向上漂移。
有时人们采用含TFA的水溶性流动相溶剂和含较低浓度TFA的有机流动相溶剂来消除TFA带来的基线漂移影响。
例如,假如您使用含0.1%TFA的水溶液,或者含0.086%TFA的乙腈溶液,这些浓度百分比会消除梯度程序造成的基线漂移,并获得更稳定的基线。
降低TFA背景响应的另一个方法是选用较长的波长(如235nm、254nm、280nm等),在这些波长下TFA有较弱的紫外吸收。
[demoChemStation,programmingwavelength]
流动相添加剂的污染也应该引起注意。
TFA的紫外吸收随乙腈量的增加而增大。
该现象引起基线向上漂移。
解决该问题的两种方法是:
--采用含一定浓度TFA的水相和较低浓度TFA的有机相(例如含0.1%TFA的水溶液/0.086%TFA的乙腈溶液)。
这些浓度百分比会消除梯度程序造成的基线漂移,并获得更稳定的基线。
--您也可以选用较长的波长,如235nm、254nm和280nm,在这些波长下TFA有较弱的紫外吸收。
样品制备
Ron:
良好的色谱柱“保健”对于延长HPLC色谱柱寿命是非常重要的。
一根用于干净样品分析的色谱柱可以进样一千次或更多。
一根用于复杂基质样品(如血浆、尿液或其它生物液体样品、环境样品、或其它复杂基质样品)分析而又没有获得良好冲洗净化的HPLC色谱柱可能仅能进样几十次或更少。
在进样之前采用如固相萃取,也被称作SPE、液-液萃取或蛋白沉淀等方法进行样品净化[insertfootageofJoannewithSPE]。
您也可以使用一种简单的过滤器如微型非针头式过滤器(demo)。
过滤样品可以防止毛细管管路、筛板和色谱柱入口的堵塞。
但是过滤器只能去除微粒,而不能去除可溶性污染物。
有趣的是有时我们把它们相互混淆。
典型的薄膜过滤器的孔径为0.45µm。
该孔径远远大于任何可能会给您带来麻烦的分子。
因此这就是为什么我们要使用如SPE、液液萃取等手段根据化学和物理性质去除可能存在杂质的原因。
分析生物液体样品的色谱柱经常会出现一些问题。
该类样品中的很多组分如蛋白质,会紧紧吸附在反相色谱柱的顶端。
人们通常采用往生物液体样品中加入酸化乙腈后振摇使蛋白质沉淀,随后过滤或离心除去它。
这种方法有时奏效,但滤液仍然不是非常干净。
因此,该色谱柱的寿命低于分析干净样品的色谱柱寿命。
我们将在其它视频中进一步讨论样品制备和色谱柱冲洗。
Bill:
不过,我们还是要讨论由于样品制备原因所导致的鬼峰。
导致样品污染的原因有很多[editor:
considersummarizingpointsonscreen]
∙样品溶剂中可能含有的杂质
∙样品制备中添加的如缓冲剂、内标物等组分中所含的杂质。
∙来自样品的降解或自动进样器上放置的样品小瓶中带有的杂质。
因此,您至少应该单独进一针样品溶剂,以确保该溶剂中不存在能产生假峰或鬼峰的物质[demonstrateoninstrument]。
所以通常我们会先进一针样品溶剂。
此外,通过样品制备过程如过滤、萃取、添加内标物等,制备一个空白对照样品,对该空白样品进行分析也非常有效。
另外,在多次运行过程中做几次空白进样以确证没有由于残留物造成的鬼峰出现也是一个非常好的想法[showrunbeingmadeandcuttochemstationscreenorholdingablankchromatogram]。
样品中的分析物或组分可能发生降解,形成假峰。
如果该组分在样品溶剂中的降解不是很快发生的,那么一般您可以通过几小时后或隔天重复进同一个样的分析结果来判断。
样品制备是极有利于降低色谱柱耗损和减少污染的方法。
在进样之前采用如固相萃取(SPE)、液-液萃取或蛋白沉淀等方法进行样品净化。
过滤样品可以防止毛细管管路的堵塞。
可溶性污染物不同于微粒污染物。
SPE和液-液萃取可协助去除可溶性污染物。
谨防来自样品制备过程中的污染源:
∙样品溶剂中的杂质
∙样品制备中添加的如缓冲剂、内标物等组分中所含的杂质。
∙样品的降解或自动进样器上放置的样品小瓶中带有的杂质。
防止样品制备过程造成污染的几条有益的建议:
∙-单独进一针样品溶剂以确保该溶剂中不存在产生假峰或鬼峰的物质。
∙-此外,在多次运行过程中做几次空白进样以确证没有由于残留物造成的鬼峰出现是一个非常好的想法。
系统污染
Bill:
让我们讨论一下系统污染。
一个很可能发生系统污染的地方是自动进样器,尤其是当使用高灵敏度的LC/MS和LC/MS/MS分析时。
在现代仪器的自动进样器序列操作中通常有编好的步骤去减少或消除残留污染。
这里我们有一个典型的现代自动进样器的构造图[insertautosampler_diagram.gif]。
在自动进样器中可能发生污染的常见部位为自动进样器进样针、切换阀或定量环[editor:
pointoutareasonschematicastheyarediscussed–rounditemincenteristheswitchingvalve,twistedblueareaontopissampleloop;needleistoleft,pullingfrompurplesamplewells]。
目前较新仪器的一个功能就是有一个可以冲洗进样针外表面的自动针冲洗操作[Showselectionofneedlewashonchem.Station;showcloseupofneedlewashoninstrument]。
Ron:
在故障排除的视频中我们一直在讨论这个问题。
确定问题的来源是故障排除过程中最耗时的部分。
我们这里给您提供一条建议,可以帮助您快速确定污染源。
从仪器上拆除色谱柱并用一小段窄内径的毛细管取代它,比如0.12mmID的管线,进行一次空白运行。
如果还是出现鬼峰,您就可以判断很可能存在系统污染问题。
您可以进一步逆向依次检查系统关键部件—如色谱柱进口接头或自动进样器。
如果不再出现鬼峰,那么您可以确定该部件为污染源。
Bill:
假定自动进样器是鬼峰的来源,我们也可以拆除自动进样器,通过没有自动进样器的系统进行一次分析运行来确定。
我们有时称之为“空白梯度”。
即在没有任何自动进样,包括阀转换的操作下,启动梯度程序。
使用ChemStation工作站中,如果在序列表中没有设置样品小瓶的位置,就可以实现跳过整个自动进样器操作的运行。
[showonchemstation—screenbelowiswhatitwilllooklike].
注意本例中我们平行运行了5次梯度程序。
如果没有出现鬼峰,那么它们可能来自样品、相关的样品溶剂,或者自动进样器的污染。
如果它们仍然存在,而且大小未变,那么它们可能来自流动相。
自动进样器是系统污染的一个常见部位,尤其对于高灵敏度的LC/MS和LC/MS/MS分析而言。
您可以通过从流路上拆除自动进样器,然后运行一针空白,观察鬼峰是否消失来判断。
可以采用的一条捷径是在ChemStation工作站操作序列表中不设置样品小瓶的位置,这样就可以跳过自动进样器运行梯度程序。
色谱柱污染-色谱柱净化/色谱柱冲洗
Ron:
目前有几种清洗色谱柱的方法。
不过,正如我们先前所讨论的那样,归咎于色谱柱的很多问题其实来自其它地方。
不管怎样,净化效果差的样品引入的污染物,是形成色谱柱污染或色谱问题的重要原因。
在我们介绍色谱柱净化之前,我会先介绍关于“藏”在色谱柱上的污染物。
色谱柱中填满了填料颗粒,但流动相可以顺畅的流过,不会有死点或其它隐藏污染物的部位被漏掉。
色谱柱制造商竭力确保色谱柱没有死体积。
如果存在死体积,那么它们会造成柱外谱带展宽或出现拖尾峰。
所以如果我们冲洗色谱柱,我们不应该认为是“隐藏”于色谱柱中的污染物导致出现的鬼峰。
如果您认为污染物来自于先前的进样,那么您可以尝试反冲色谱柱。
[demohow–insertfootagefrompressureincreasevideohere]这个过程在我们有关压力变化问题的视频中有非常详细的讨论。
当您清洗色谱柱,使用一种比流动相洗脱能力更强的溶剂时。
在冲洗之前,将检测器从流路上拆除是一个很好的主意。
-首先,假定您正使用的是反相HPLC,您应该先用不含缓冲盐的流动相冲洗色谱柱。
[demo]
-然后用100%有机溶剂冲洗。
[demo]通常情况下,如果您使用的是甲醇,就先以甲醇开始冲洗,然后采用乙腈。
如果您一直使用着乙腈,那么您可以把甲醇作为第二冲洗溶剂使用。
甲醇具有与乙腈不同的溶解性。
-完成上述操作后,请检查您的色谱柱,观察其压力是否恢复正常。
如果没有,那么考虑舍弃该色谱柱或采用更强烈的条件进行清洗。
一个简单的方法是改用75%乙腈和25%IPA-异丙醇的混合溶剂。
异丙醇清洗能力更强,但其背压也更高。
如果您的系统起初就背压很高,那么您不要直接使用100%异丙醇开始冲洗。
并且冲洗时可使用较低流速以免超过系统最高压力限制。
-在使用了乙腈/异丙醇混合溶剂清洗之后,就可以使用100%异丙醇进行清洗了。
观察使用100%异丙醇清洗是否奏效。
如果该操作仍不能解决问题,那么考虑使用如二氯甲烷或己烷等较强的非极性溶剂。
鉴于混溶性的原因,请记住在使用这些更强的溶剂和重新使用乙腈前,都要先使用异丙醇过渡。
鬼峰的产生很少是由色谱柱污染导致的。
色谱柱污染更倾向于导致柱压升高。
如果您认为色谱柱受到污染,请您先查看色谱柱说明书,确定该色谱柱能否进行反冲。
反冲色谱柱时,拿住该色谱柱,将其从系统中拆除并将其出口端与从泵中接出的原入口端管线相连。
在反冲时不要把色谱柱连接到检测器上。
相反,应该把色谱柱的进口端引入一个烧杯,用以收集冲洗色谱柱时流出的溶剂或水。
冲洗时流速不能太快。
起始时要慢,需要时再设定一个更高的流速用以除去微粒。
您应该使用足量溶剂冲洗直至色谱柱非常干净。
我们以“柱体积”为衡量标准,柱体积可以通过公式计算。
通常我们推荐起初使用10倍柱体积的溶剂进行冲洗。
清洗色谱柱的几条建议:
冲洗色谱柱需要使用比流动相洗脱能力更强的溶剂。
并确保检测器从流路中断开。
不能直接向缓冲液中加入有机溶剂,因为这样可能会导致缓冲盐沉淀析出,从而造成更高的背压。
清洗反相色谱柱:
使用至少10倍柱体积的各种溶剂冲洗分析柱。
1.首先用不含缓冲盐的流动相冲洗(水/有机溶剂)
2.然后用100%有机溶剂(甲醇或乙腈)冲洗
3.检查压力是否恢复正常;
4.如果没有,那么舍弃该色谱柱或考虑用更剧烈的条件清洗:
75%乙腈/25%异丙醇
5.然后用100%异丙醇冲洗
6.如仍不能解决问题,考虑使用100%二氯甲烷或己烷等非极性溶剂。
小结
Bill:
好了,现在我们做一下总结。
鬼峰的产生有很多可能的原因。
它们可能是先前进样残留物的洗脱流出—或我们称之为迟滞峰。
如果您正在使用一个等度洗脱方法,那么您可以通过延长运行时间、提高流速或增加流动相洗脱强度来避免它。
当然您也可以采用梯度洗脱。
Ron:
您也可能由于流动相污染而出现鬼峰。
要确保使用HPLC级溶剂以减少与流动相相关的鬼峰的出现。
注意您的样品制备过程。
确保在样品制备过程中没有引进污染物。
Bill:
系统污染—尤其是自动进样器—是另一个值得注意的问题。
通过绕过自动进样器并运行一个空白梯度这种方法判断是否可以确定污染源。
Ron:
最后,我们考虑一下色谱柱。
色谱柱几乎不会成为鬼峰出现的来源。
不过,色谱柱污染可能会导
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