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取10ml冰醋酸,加蒸馏水至100ml。
4.血红蛋白应用标准液将血红蛋白贮存液用生理盐水稀释成10mg/100ml备用。
5.抗凝试管取0.2ml100U/ml肝素于试管内,在80℃以下烘干,每管可抗凝2ml全血。
【操作方法】
1.将抗凝全血分离血浆。
2.取试管3支,分别标明测定、标准和空白,分别加入血浆、应用标准液,再向
各管中分别加入邻一甲联苯胺溶液及1%过氧化氢溶液各1.0ml,充分混匀,放置10min。
3.于上述3支试管内分别加入10%冰醋酸溶液10ml混匀,用435nm波长比色,以空白调“0”,读各管吸光度。
4.计算:
测定管吸光度
游离Hb(mg/L)=________________________×
100
标准管吸光度
【质量控制】
1.一切容器均应避免血红蛋白污染,标本勿溶血,否则可引起假阳性。
2.过氧化氢溶液浓度要准,新鲜配制。
3.联苯胺醋酸的含水量不能低于15%和超过30%,否则均可引起吸光度降低。
4.标准液的加入量一定要准。
【参考区间】<
40mg/L
【临床意义】血浆游离血红蛋白含量增加是血管内溶血的特征。
血浆中血红蛋白含量超过与血清中结合珠蛋白的结合能力时,其含量即可升高。
微血管内溶血时,血浆游离血红蛋白含量均明显升高。
PNH为200~2500mg/L,输不合血型后为150~5000mg/L。
温抗体型自身免疫性溶血性贫血、镰状细胞贫血及地中海贫血时血浆游离血红蛋白可轻度或中度增加。
血管外溶血则正常。
实验三、血清结合珠蛋白测定(比色法)
【实验原理】血清结合珠蛋白(Hp)是肝脏产生的a2糖蛋白,它与游离的血红蛋白(Hb)具有特殊的亲合力,可形成稳定的Hb-Hp复合物,后者在弱酸性(pH4)条件下,具有过氧化物酶的活性,测其活性可间接反映Hp的含量。
1.乙酸缓冲液0.2mol/L(pH4)称取乙酸钠(NaAC·
3H2O)2.8g,冰乙酸5.7ml溶解,加蒸馏水至500ml。
2.0.1%(V/V)愈创木酚溶液取1ml愈创木酚溶液于500ml乙酸缓冲液中,加蒸馏水至1000ml。
3.0.3%过氧化氢溶液临用前配制。
4.0.5g/L高铁血红蛋白液。
1.取静脉血分离血清,避免溶血。
2.取受检血清0.4ml,与等量高铁Hb溶液混合。
3.取上述混合液0.2ml,加入于已预温(25℃)的愈创木酚5ml溶液中,再加入0.5ml0.3%过氧化氢,于25℃水浴内作用8min,注意避光。
每份标本均应双份同时测定。
4.用蒸馏水调“0”点,440nm处读取吸光度。
5.由校正曲线查出受检血清中Hp含量。
【质量控制】
1.受检血清要避免溶血。
2.电泳时温度不能过高,应把电泳槽置于冷水中电泳。
否则电泳效果差,区带不易区分。
3.电泳液应经常更换,防止因pH及离子强度改变对电泳效果的影响。
【参考区间】0.2~1.9gHb/L。
【临床意义】Hp可与Hb结合,以除去血循环中游离的Hb。
各种溶血性贫血,无论血管内溶血还是血管外溶血,血清中Hp含量均明显降低,甚至测不出。
Hp降低的程度与溶血程度呈正相关,即溶血越严重,血清Hp越低。
如果血管内溶血超出Hp的结合能力,即可出现血红蛋白尿。
动态监测表明,急性溶血开始,血循环中游离Hb即迅速增加,随着Hb-Hp复合物的有效清除,血清Hp也随之恢复正常,因此血清Hp与游离Hb同时测定对溶血性贫血的诊断及疗效观察均具有重要意义。
肝病、传染性单核细胞增多症和先天性无Hp血症,Hp亦降低,故诊断溶贫时应除外上述疾患。
感染、创伤、肿瘤、肝外阻塞性黄疸及类固醇激素治疗时Hp可增加,这些情况下Hp正常也不能除外溶血。
醋纤膜电泳有助于区别血管内抑或血管外溶血。
各种溶血性贫血患者Hp均显著减少,甚至缺如,故电泳后无Hb-Hp区带,而仅有一条未结合的Hb区带。
但显著血管内溶血(如PNH)时,还出现一条高铁血红素白蛋白区带,而血管外溶血(如球形红细胞增多症)则无此区带。
实验四、尿含铁血黄素试验(Rou’stest)
【实验原理】含铁血黄素中的高铁离子(Fe3+)在酸性环境中与亚铁氰化钾作用,生成蓝色的低铁氰化铁,称为普鲁氏蓝反应。
1、20g/L亚铁氰化钾水溶液,用时新鲜配制。
2、3%盐酸。
【操作方法】取新鲜尿5ml离心沉淀,弃去上清,于沉淀中加入试剂①和②各1ml,混匀。
置室温10min,再离心沉淀,取沉淀物显微镜检查。
【结果判断】如见到有分散或成堆蓝色颗粒(直径约1~3μm)即为阳性。
存在于细胞内更为可信。
【质量控制】所用试管、玻片、试剂均应防止铁剂污染,否则出现假阳性。
每次试验应做阴性对照。
如两种试剂混合后即显深蓝色,提示试剂污染高铁,不宜使用。
晨尿阳性率较高。
【临床意义】血浆游离血红蛋白经肾小球滤出后,被肾小管上皮细胞吸收、降解,最后形成含铁血黄素,贮存于细胞内。
当细胞脱落随尿排出,即成为含铁血黄素尿。
正常为阴性。
阳性主要见于慢性血管内溶血,尤其以PNH为多见。
即使无血红蛋白尿时也可呈阳性。
但阴性结果也不能完全排除血管内溶血,因含铁血黄素颗粒的直径需>
1μm时才能从镜下见到。
急性血管内溶血时,虽可有血红蛋白血症和血红蛋白尿,但还不能形成足够大的含铁血黄素颗粒,需在数日后才阳性,并可持续数周。
实验五、红细胞渗透脆性试验
【实验原理】红细胞在低渗盐水中,水分透过细胞膜内渗,使之膨胀破坏而溶血。
本试验是测定红细胞对不同浓度低渗盐水的抵抗力,以鉴别某些与红细胞形态有关的溶血性贫血。
红细胞对低渗盐水的抵抗力与其表面积和体积的比值有关,厚度越大,该比值越小,即渗透脆性越大;
反之,脆性越小。
以浓度为横坐标,溶血度为纵坐标绘制曲线,找出50%溶血对应的盐浓度,即红细胞中间脆性(MCF),后者较敏感。
【试剂】171mmol/LNaCl(10g/L)溶液:
将100℃烘干的分析纯氯化钠1.0g置于100ml容量瓶中加少量蒸馏水溶解后,再加蒸馏水至刻度处。
【操作方法】取12支试管,按5-1分别加入10g/LNaCl和蒸馏水。
表5-1红细胞渗透脆性试验操作表(国际单位制)
试管号123456789101112
10g/LNaCl(ml)1.71.61.51.41.31.21.11.00.90.80.70.6
蒸馏水(ml)0.80.91.01.11.21.31.41.51.61.71.81.9
NaClSIg/L6.86.46.05.65.24.84.44.03.63.22.82.4
制mmol/L116.3109.4102.695.888.982.175.268.461.654.747.941.0
浓度旧制(%)0.680.640.600.560.520.480.440.400.360.320.280.24
然后各管立即加入新鲜静脉血各1滴,并从低浓度到高浓度逐管颠倒混匀,室温静置。
【结果判断】静置室温2h,观察结果,从高浓度开始,上清液呈透明红色而管底有红细胞者为开始溶血管;
溶液透明红色,管底完全无红细胞者为完全溶血管。
【质量控制】
1.NaCl溶液浓度要准确,故应干燥精称。
2.注射器和试管必须清洁干燥。
3.应用新鲜静脉血,忌用抗凝血,必要时可用去纤维蛋白血或肝素抗凝血。
4.结果不易判断时可离心后观察。
5.黄疸病人开始溶血不易观察,严重贫血红细胞太少时均可用等渗盐水将红细胞
洗涤后再配成50%红细胞悬液进行试验。
6.每次试验均应做正常对照,与被检血相差0.4g/L,即有临床意义。
【参考区间】开始溶血:
71.8~78.6mmol/L(4.2~4.6g/L)
完全溶血:
47.8~54.7mmol/L(2.8~3.2g/L)
中间脆性:
68.5~76.2mmol/L
【临床意义】患者比正常对照高6.8mmol/L或中间脆性>
76.2mmol/L有诊断价值。
脆性增加:
见于遗传性球形红细胞增多症,也见于自身免疫性溶血性贫血伴球形红细胞增多者。
脆性降低:
见于缺铁性贫血,各型地中海贫血,HbC、D、E病,脾切除术后及阻塞性黄疸等。
实验六、酸溶血试验(Ham’stest)
【实验原理】正常人红细胞在酸化(pH6.6~6.8)的自身新鲜血清中(内含补体和备解素),经37℃孵育1h不溶血。
而阵发性睡眠性血红蛋白尿(PNH)患者,因红细胞膜缺陷,对补体溶血效应敏感性增强,则发生溶血。
1.0.2mol/LHCl。
2.8.5g/LNaCl溶液。
1.配制50%红细胞悬液取10ml离心管2支,标明患者、对照,均加入8.5g/LNaCl溶液5~6ml,分别加入患者和对照者未梢血十几滴,混匀,离心后弃去上清,如此重复洗涤红细胞2次,最后配成50%红细胞悬液备用。
2.分离正常对照血清取与患者同型或AB型血3~5ml,待自然凝固后分离血清。
3.按表6-1操作。
表6-1酸溶血试验操作表
正常对50%红细胞0.2mol/L
管别孵育
照血清悬液(ml)HCl(ml)
患者对照
试验管0.50.0250.0537℃
对照管0.50.0250.05水溶Ih
【结果判断】试验管溶血,对照管不溶血为阳性;
试验管和对照管均不溶血为阴性。
1.血清酸化后试管必须塞紧,否则CO2逸出使血清酸度降低。
2.抗凝剂中的Na、K可影响pH,故不宜用抗凝血,但可用脱纤维血。
3.为保证补体充足,最好用混合血清,但正常对照红细胞必须用“O”型血。
4.多次输血者,可因血中异常红细胞相对减少,本试验可呈弱阳性或阴性。
【临床意义】正常人为阴性。
阳性见于PNH。
遗传性球形红细胞增多症及自身免疫性溶血性贫血也可呈阳性。
主要与红细胞球形化有关。
血清加热破坏补体,若本试验转为阴性则更支持PNH。
实验七、蔗糖溶血试验
【实验原理】低离子强度的等渗蔗糖溶液,在温育条件下可促进补体与红细胞膜的
结合,使红细胞对补体损伤的敏感性增强而导致溶血。
【试剂】92.4g/L蔗糖溶液。
【操作方法】取新鲜抗凝血(枸橼酸盐或草酸盐抗凝)0.5ml加入4.5ml蔗糖溶液中,混匀,置37℃孵育箱内30min后离心,上清液呈红色为阳性,无色为阴性。
【质量控制】注射器、试管应清洁干燥,避免溶血。
无蔗糖可用10%葡萄糖代替。
【临床意义】正常人为阴性。
本试验较Ham试验敏感,是PNH诊断的筛选试验,但特异性较差。
再障-PNH综合征、巨幼红细胞性贫血、自身免疫性溶血性贫血也可呈阳性。
本试验最好与Ham试验同时操作,用正常血清代替患者血清做试验,可除外患者补体异常所致的假阴性。
实验八、热溶血试验
【实验原理】利用患者的红细胞和自身新鲜血清(含补体),经37℃孵育后,由于葡萄糖分解产酸,使有内在缺陷的红细胞溶解而溶血。
【操作方法】抽取静脉血1-2ml,取下针头,沿管壁缓缓注入小试管内,避免产生气泡,置37℃孵育箱保温24h,取出后离心。
上清呈红色(溶血)为阳性。
【质量控制】注射器要干燥,小试管要清洁,操作过程中避免溶血,防止出现假阳性。
孵育24h血块未回缩者,可用小玻棒沿管壁轻轻分离,然后离心,观察结果。
阳性见于PNH,其他溶血性贫血亦呈阳性,但阳性率比PNH为低。
本试验用于PNH的筛选。
实验九、高铁血红蛋白还原试验
一、比色定量法
【实验原理】6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PD)在戊糖旁路中使6-磷酸葡萄糖转变为6-磷酸葡萄糖酸,同时催化氧化型辅酶II(NADP)形成还原型辅酶II(NADPH),再使氧化型谷胱甘肽(GSSG)形成还原型谷胱甘肽(GSH)。
NADPH是高铁血红蛋白还原酶的辅酶,在递氢体美兰和高铁血红蛋白还原酶的作用下,使暗褐色的高铁血红蛋白还原为红色的血红蛋白。
当红细胞内G6PD含量不足或缺乏时,高铁血红蛋白还原速度减慢,甚至不能还原。
1.12.5g/L亚硝酸钠-葡萄糖溶液亚硝酸钠1.25g,葡萄糖5g,加蒸馏水至100ml。
置棕色瓶内4οC下可保存1个月。
2.0.0004mol/L美蓝溶液美蓝15mg放乳钵中,加少量蒸馏水研磨后过滤,再加蒸馏水至100ml。
室温可保存1~2个月。
3.0.02mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4)取Na2HPO4229.5mg,KH2PO452.2mg,加蒸馏水至100ml。
1.静脉采血1.5-2.0ml,加入含有38g/L枸橼酸钠抗凝剂的小瓶内(血:
抗凝剂=9:
1),再加葡萄糖20mg摇匀。
2.取血液1.0ml,加亚硝酸钠-葡萄糖溶液和美蓝溶液各0.05ml,颠倒混合12次,使与空气中的氧充分接触。
加塞,37±
0.5οC水浴(或孵箱)保温3h。
3.取出后摇匀,取0.1ml加于10ml磷酸盐缓冲液中溶解,2min后于波长635nm处(或红色滤光板)比色,用蒸馏水作空白,测其吸光度(A)。
4.另取原血液0.1ml,按上法加缓冲液溶解后比色,测其吸光度(B)。
再于此液中加亚硝酸钠-葡萄糖液1滴,摇匀,5min后比色,测其吸光度(S)。
【计算】
A-B
高铁血红蛋白还原率%=(1-———)×
100
S-B
【参考区间】高铁血红蛋白还原率>
75%(比色法)
1.红细胞比积低于30%时,高铁血红蛋白还原率显著降低,必须调整红细胞与血浆的比例。
2.本试验抗凝剂若用ACD保养液时,该保养液与血液之比为0.15:
1。
该抗凝血可保存1周。
因草酸盐具有还原性,不宜使用。
3.标本不应有凝块或溶血,以免影响测定结果。
4.测定吸光度时,分光光度计的波长应准确。
一般要求S比B大8倍以上。
本试验用于G6PD缺乏症的过筛检查,蚕豆病和伯氨喹啉型药物溶血性贫血患者,由于G6PD缺陷(隐性遗传),高铁血红蛋白还原率明显下降。
杂合子型多在74%~31%之间,纯合子型常在30%以下。
二、细胞化学法
【实验原理】红细胞内血红蛋白可被亚硝酸钠氧化为高铁血红蛋白,后者可经美兰还原为血红蛋白;
G6PD缺乏时则高铁血红蛋白不被还原。
加入氰化物后形成氰化高铁血红蛋白,易被过氧化氢洗脱,染色后形成空影红细胞。
正常的红细胞,氧合血红蛋白的过氧化酶活性,不被氰化物抑制,阻止了枸椽酸盐的洗脱作用,保证红细胞的正常形态。
1.反应试剂取0.0004mol/L美蓝溶液1ml,12.5g/L亚硝酸钠-葡萄糖溶液0.5ml,生理盐水8.5ml,混匀。
此液于冰箱中可放置1周。
2.0.4mol/L氰化钠(或氰化钾)。
3.洗脱液95%酒精40.0ml,0.2mol/L枸椽酸8.0ml,30%H2O22.5ml,混匀。
4.固定液甲醇
5.染液5g/L苏木素液,4g/L伊红液。
1.取ACD抗凝血0.05ml,置于预先盛有0.05ml反应试剂之小试管中,摇匀,放37C水浴(或孵箱)中保存4h。
2.取出后用滴管轻轻吸去上清液,于剩下的红细胞中加入0.4mol/L氰化钠0.005ml(细玻棒蘸起一小滴),摇匀。
3.5min后加入1滴患者血浆(或AB型血浆),用滴管混匀,取出1滴作薄涂片,待干。
4.将玻片放入盛有洗脱液的染色缸内,上下移动1min,再静置于液中2~4min,取出后甲醇固定半分钟,水冲洗,待干。
5.用苏木素染2~3min,水冲洗,再以伊红染1~4min水冲洗,待干。
6.在高倍镜下观察,计数1000个红细胞(涂片四角及中央各数200个),算出G6PD缺乏红细胞(空影红细胞)的百分率。
【质量控制】本法受洗脱液H2O2浓度的影响,因H2O2易分解,不易保存所需浓度,因此使用过程中宜随时补充少量H2O2。
补充的量依使用次数的多少、放置时间和室温高低而定,需凭经验掌握,最好用阴性、阳性样本对比试验来确定。
【临床意义】正常人空影红细胞<
0.4%,G6PD严重缺乏者>
88.0%,杂合子0.4%~88%。
此法对于杂合子的检出敏感性较高,但作为筛选法则过于繁琐。
实验十、变性球蛋白小体检查
【实验原理】氧化物质可使G6PD缺乏患者的红细胞中积蓄多量的H2O2等氧化剂,使血红蛋白氧化变性。
而与某些碱性染料(如煌焦油蓝)或结晶紫孵育后形成蓝黑色或紫黑色颗粒定位于红细胞内。
【试剂】用0.73%NaCl溶液配制成1%的结晶紫(龙胆紫)溶液。
【操作方法】滴1滴试剂于载玻片上,用玻棒或竹签蘸一点患者血液于其上,混匀,加盖玻片,染5~10min后在高倍镜下观察。
计算500个红细胞中含变性珠蛋白小体红细胞的百分率。
含变性珠蛋白小体的红细胞是在红细胞中出现多个紫黑色、或细或粗、形状不规则的颗粒,位于细胞的边缘或中央,血红蛋白或仍均匀分布,或完全缺如。
【参考区间】正常人无变性珠蛋白小体,或偶见几个(<
0.01)细小者。
【临床意义】阳性见于G6PD缺乏症患者(3%~82%),随着溶血的恢复逐渐减少或消失。
还见于不稳定血红蛋白病,呈单一的圆形或卵圆形粗大颗粒,附着于红细胞膜或突出于其外。
另外,硝基苯、苯胺、苯肼等化学物质中毒者也可出现变性珠蛋白小体。
实验十一、葡萄糖6-磷酸脱氢酶荧光斑点试验
【实验原理】在葡萄糖-6-磷酸(G6P)和NADP存在下,G6PD能使NADP还原成NADPH,后者在紫外线照射下可发出荧光。
【试剂】混合剂的成分与配方如下:
0.1mol/LG6P1ml
7.5mmol/LNADP1ml
0.7mol/LTris-HCl(pH7.8)3ml
8mmol/L氧化型谷胱甘肽1ml
10g/L皂素2ml
蒸馏水2ml
此混合试剂分装,置-20οC保存,可稳定数月。
1.取末梢血或抗凝血5~10μl,加入含100μl反应试剂的小试管中。
亦可取血滴于滤纸上,干后取直径约为1cm的血迹剪碎,置含反应试剂的小试管中洗脱。
2.放37οC孵育10min。
3.取约10μl溶血液滴于新华滤纸上,晾干后立即用冷风吹干,在长波紫外线下观察结果。
【结果观察】G6PD正常者可见明亮荧光,严重缺乏者无荧光,杂合子介于两者之间(弱荧光)。
1.本法是直接测定NADPH的量,特异性较好。
2.每次或每批要有(G6PD)正常和缺陷者的标本作对照。
3.取血量以5~10μl为宜,正常者宜偏少,贫血者可偏多。
4.干血滤纸片存在其酶活性可损失,宜同时作正常对照血样品。
5.加入GSSG是为了提高敏感性,因有残余G6PD活性的标本(如杂合子),可产生少量NADPH,若有足量的GSSG存在,则通过谷胱甘肽还原酶的作用,再将其氧化为NADP。
这样患者和正常红细胞即可显示明显差别。
不使用GSSG亦可,效果稍差,可将G6P-Na2和NADP浓度减半,血样本用生理盐水稀释至1/4,孵育时间缩至3min,可减弱残余酶活性的影响。
【临床意义】正常人有很强的荧光。
G6PD缺乏者荧光很弱或无荧光;
杂合子型或某些G6PD变异体者可有轻度或中度荧光,本试验适用于大批量筛选,但不利于杂合子型的检出。
实验十二、硝基四氮唑蓝试验
硝基四氮唑蓝试验(nitroblue-tetrazoliumtest)有定性试验和G6PD活性定量测定两种。
一、定性纸片法
【实验原理】NADPH通过吩嗪二甲酯硫酸盐(M-PMS)的递氢作用,使淡黄色的硝基四氮唑蓝(NBT),还原成紫色的甲。
G6PD缺乏时由于NADPH生成不足,不显紫色。
1.0.25mol/LTris-HCl缓冲液(pH7.4)称取三羟甲基氨基甲烷(Tris)7.6g,溶于蒸馏水约100ml中,先加入1mol/HCl60ml,然后用pH计调整pH至7.4,再加蒸馏水200ml。
在4οC可保存数月。
2.0.6g/LM-PMSM-PMS6mg加蒸馏水10ml溶解,加入0.01mol/LHCl1小滴调整pH至3.8左右。
于棕色瓶内,暗处存放,可保存2周以上。
如试剂由黄变绿,应重新配制。
3.3g/LNBTNBT15mg加蒸馏水5ml,在水浴中加热至80οC左右溶解,过滤。
用棕色瓶盛装,可保存2周以上。
4.6.25mmol/LG6P-Na2称取G6P-Na210mg,用Tris-HCl缓冲液4ml溶解。
放0οC可保存1个月以上。
5.6.25mmol/LNADP称取NADP10mg(如用含70%的制品则称14mg),加Tris-HCl缓冲液2ml溶解。
放0οC可保存数月。
6.0.12mol/LMgCl2称取分析纯MgCl2·
6H2O2.10g溶于蒸馏水至100ml。
Mg2+为G6PD的激活剂。
7.反应试剂M-PMS0.1ml,NBT0.5ml,G6P-Na20.4ml,NADP0.1ml,MgCl20.1ml,混合,当天配制。
8.对照试剂用等量Tris-HCl代替G6P-Na2和NADP,余同反应试剂。
1.取末梢血1滴,滴于干净滤纸上,血迹直径1.0cm左右,自然晾干(密封后4οC保存,酶活性可维持5~7天)
2.用打孔机打出一小圆血迹红片(直径约5mm),置于反应板的小
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